嗜铁蛋白对血管内皮细胞的损伤作用及葛根素的保护机制

目的探讨葛根素对嗜铁蛋白诱导EA.hy926型血管内皮细胞损伤的保护作用及机制。方法嗜铁蛋白以不同作用时间(0、24、48、72 h)及浓度(0、5、10、20μmol·L-1)刺激EA.hy926细胞,MTT法及流式细胞术分别测细胞增殖及凋亡,比色法测乳酸脱氢酶(LDH)活性、ELISA测高敏C反应蛋白(hs-CRP)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平,Western blot测p-p38 MAPK、t-p38 MAPK、Bax、Bcl-2蛋白表达,加入葛根素(10、50、100μmol·L-1)和p38 MAPK抑制剂SB203580(20μmol·L-1)检测葛根素的干预作用及机制。结果与空白组比较,10μmol·L-1嗜铁蛋白作用48 h可显著抑制EA.hy926细胞增殖,上调p-p38 MAPK及Bax蛋白表达促进细胞凋亡,诱导分泌hs-CRP及MCP-1,并增加LDH活性(P<0.05);50、100μmol·L-1葛根素均可显著减轻嗜铁蛋白诱导的EA.hy926细胞增殖抑制、下调p-p38 MAPK及Bax蛋白表达以抑制细胞凋亡、减少嗜铁蛋白诱导EA.hy926细胞分泌hs-CRP及MCP-1并降低LDH活性(均P<0.01),且较SB203580更为显著(均P<0.05)。结论嗜铁蛋白可诱导血管内皮细胞损伤,葛根素可抑制p38 MAPK通路减轻嗜铁蛋白诱导的血管内皮细胞损伤。     

大蒜素对PM2.5损伤EA.hy926内皮细胞的保护作用及机制

目的探讨PM2.5对EA.hy926型人脐静脉内皮细胞损伤的影响及大蒜素的保护作用及机制。方法采集大气PM2.5分别以20、200、400 mg·L~(-1)染毒EA.hy926细胞24h,MTT法测细胞存活率;流式细胞术测细胞凋亡;Western blot法测p-ERK1/2、Bax、Bcl-2蛋白水平;ELISA法测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)含量,并测细胞丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及乳酸脱氢酶(LDH)活性;分别加入大蒜素(5、20、40 mg·L~(-1))和ERK1/2通路特异性阻滞剂PD98059 20μmol·L~(-1),检测大蒜素的干预作用及机制。结果与对照组比较,PM2.5染毒后呈剂量依赖性降低EA.hy926细胞存活率,上调p-ERK1/2蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以促进细胞凋亡,诱导分泌TNF-α及IL-6含量增高,降低SOD活性,增加MDA含量及LDH活性(P<0.05);大蒜素呈剂量依赖性增加EA.hy926细胞的存活率,下调p-ERK1/2蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以抑制细胞凋亡,降低TNF-α及IL-6含量,增加SOD活性,降低MDA含量及LDH活性(P<0.05)。结论大蒜素可能通过抑制ERK1/2信号通路,减轻PM2.5诱导的炎症反应及氧化应激损伤,从而保护EA.hy926细胞。     

银杏内酯K调节缺氧诱导因子-1α通路抑制氧糖剥离再灌注诱导的神经血管单元损伤

目的确定银杏内酯K(ginkgolide K,GK)对缺血性脑卒中诱导的神经血管单元损伤的保护作用及调节缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)通路机制。方法采用小鼠小胶质细胞BV-2及人脐静脉细胞融合细胞EA.hy926氧糖剥离再灌注(oxygen-glucose deprivation and reperfusion,OGD/R)模型模拟脑缺血引起的神经血管单元损伤。细胞OGD 4 h后再灌注并给予GK干预。给药24 h时检测BV-2细胞上清中炎症因子水平及EA.hy926细胞损伤情况;Western blot检测BV-2细胞给药1 h后p-Akt、p-Erk和6 h后HIF-1α水平,并应用LY294002验证,同时检测EA.hy926细胞给药1 h后p-Akt及6 h后HIF-1α等蛋白变化。结果GK明显抑制BV-2细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β分泌,激活p-Akt、抑制p-Erk并下调HIF-1α,且LY294002共同干预后,GK调节作用下降;同时,增加EA.hy926细胞活力和抑制LDH释放,上调p-Akt、HIF-1α、HO-1、VEGF并下调cleaved caspase-3/9水平。结论GK可多效应减少缺血性脑卒中诱导的神经血管单元损伤,其机制可能与针对不同细胞HIF-1α调节作用不同有关。     

蒙花苷对TNF-α诱导的血管内皮细胞炎症损伤及TLR4/IκBα/NF-κB信号通路的影响

目的 以肿瘤坏死因子(TNF-a)刺激人脐静脉内皮细胞(EA.hy926),体外模拟血管内皮细胞炎症损伤模型,探讨蒙花苷(Buddleoside,BUD)对血管内皮细胞的保护作用和机制。方法 MTT法检测TNF-a和蒙花苷对EA.hy926细胞活性的影响;采用TNF-a(50 ng.mL_-1)刺激EA.hy926细胞,加入不同浓度(5、15和25 mmol.L_-1)蒙花苷处理,DAPI染色法测定EA.hy926细胞与单核细胞(THP-1)的黏附能力;Western Blot法检测细胞中Toll样受体(TLR4)、核因子-kB抑制蛋白(IκB-α)、核因子-kB(NF-kB)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)等蛋白表达;RT-PCR法检测ICAM-1、VCAM-1等基因mRNA的表达;ELISA法检测细胞上清液中白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的含量。结果 蒙花苷可显著抑制TNF-a刺激EA.hy926细胞与THP-1细胞间黏附作用,降低EA.hy926细胞分泌的炎症因子IL-1、IL-6和IL-8水平。Western blot和RT-PCR结果表明蒙花苷能减少EA.hy926细胞中TLR4、NF-kB、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达量及ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表达量,同时能升高细胞中IκB-α的蛋白表达量。结论 蒙花苷能缓解血管内皮细胞炎症损伤,其作用机制可能主要是通过抑制TLR4/IΚBα/NF-κB信号通路发挥效用。     

高分子量脂联素在EA.hy926血管内皮细胞中对前炎症因子介导的NF-κB信号通路及其下游因子的影响

目的本研究通过促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1对血管内皮细胞株EA.hy926的作用,来探讨高分子量脂联素对EA.hy926中NF-κB活性及其下游因子的影响,以阐明高分子量脂联素在血管内皮细胞炎症反应中的作用。方法构建NF-κB荧光素酶报告质粒,并稳定转染血管内皮细胞株EA.hy926。在TNF-α和IL-1作用之前,用不同浓度(0~8μg/ml)高分子量脂联素处理转染后的血管内皮细胞EA.hy926。NF-κB的活性通过荧光酶报告分析法测定。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定细胞培养上清液中TNF-α、IL-1及IL-6的浓度。分别采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time-PCR)法、蛋白印迹法(Western blot)在m RNA和蛋白水平上检测血管内皮细胞的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的含量。结果研究表明高分子量脂联素抑制促炎因子TNF-α和IL-1介导的NF-κB活性及其下游因子的表达。结论高分子量脂联素通过抑制NF-κB的活性及其下游因子的表达,抑制前炎症因子介导的炎症反应,从而保护血管内皮细胞。     

白介素-1β通过上调血管内皮细胞中FucT-Ⅶ及蛋白糖基化调控细胞间黏附作用

目的探讨炎症因子白介素-1β(IL-1β)是否通过α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅶ(FucT-Ⅶ)对血管内皮细胞中功能蛋白糖基化修饰调控单核细胞与内皮细胞的黏附作用,为揭示炎症因子损伤血管内皮细胞的分子机制奠定基础。方法建立不同浓度IL-1β损伤EA.hy926血管内皮细胞的模型,通过与荧光标记的THP-1单核细胞共培养,观察细胞间的黏附作用;采用Real time-PCR及Western blot检测EA.hy926细胞中FucT-Ⅶ差异表达;用蛋白免疫印迹法检测细胞内sLex糖支链蛋白差异表达;运用siRNA干扰FucT-Ⅶ基因,观察细胞间黏附的变化。结果 IL-1β可以促进内皮细胞与单核细胞的黏附,同时内皮细胞中FucT-Ⅶ表达上调;sLex糖支链蛋白表达也上调。当干扰内皮细胞中FucT-Ⅶ基因后,细胞间的黏附能力明显下降,且sLex糖支链蛋白表达下调。结论 IL-1β可能通过调控EA.hy926细胞中FucT-Ⅶ的糖基化修饰作用增加其对单核细胞的黏附能力,这可能是炎症早期发生时影响血管内皮功能新的重要分子机制之一。     

缺氧对人微血管内皮细胞HIF-VEGF-Notch信号通路的影响

目的：观察缺氧对人微血管内皮细胞(HMVEC)中HIF-VEGF-Notch信号通路相关分子表达的影响。方法常规方法培养HMVEC细胞,低氧培养箱制备HMVEC缺氧模型,正常细胞作为对照组。采用Western Blot法检测HMVEC中HIF-1α及Notch-1的蛋白表达,ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF蛋白表达水平。结果缺氧组和对照组细胞中Notch1蛋白表达分别为2.07±0.16和0.91±0.04,两者差异有显著意义（P<0.05）;HIF-1α蛋白表达缺氧组为2.53±0.19,对照组为0.67±0.08,差异有统计学意义（P<0.05）。对照组上清液中VEGF表达量为50.04±5.92 ng/L,缺氧组上清液中VEGF表达量为238.04±19.29 ng/L,两者差异有统计学意义（P<0.05）。结论缺氧可上调HMVEC细胞中HIF-VEGF-Notch信号通路相关分子的表达,此可能与重要脏器缺血缺氧性损伤后诱导的血管新生有关。     

丹参酮ⅡA对EA.hy926细胞TLR4/NF-κB炎症信号通路的影响

目的观察丹参酮ⅡA对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉细胞融合细胞EA.hy926 TLR4/NF-κB炎症信号通路的影响,探讨丹参酮ⅡA抗动脉粥样硬化(AS)的作用机制。方法体外培养人脐静脉细胞融合细胞EA.hy926;观察丹参酮ⅡA低、中、高剂量组对LPS刺激EA.hy926细胞的保护作用,RT-PCR和Western bolt法检测TLR4、NF-κB、TNF-αmRNA和蛋白表达。结果 LPS刺激组TLR4、NF-κB和TNF-αmRNA和蛋白表达较正常组明显增加(P<0.05)。与LPS刺激组相比,丹参酮ⅡA低剂量组TLR4、NF-κB、TNF-αmRNA及蛋白表达无明显差异,而丹参酮ⅡA中、高剂量组TLR4、NF-κB和TNF-αmRNA及蛋白质表达明显降低(P<0.05)。结论丹参酮ⅡA抗AS的作用机制之一是通过干预TLR4/NF-κB信号通路来实现的。     

益元抑瘤汤提取物的体外抗肿瘤作用研究

目的研究益元抑瘤汤提取物的抗肿瘤细胞增殖和抗肿瘤新生血管的作用。方法采用系统溶剂萃取法获得提取物,用SRB染色法测定肿瘤细胞A549、Bel7402和内皮细胞EA.hy926、HMEC的IC50,通过测定内皮细胞外液LDH的释放来监测提取物的细胞毒性。结果水提醇沉法所得醇溶部分干粉经正丁醇萃取后,正丁醇相提取物在A549细胞、Bel7402细胞、EA.hy926细胞和HMEC细胞的IC50分别为34.43±0.56、54.13±0.37、34.82±0.48、35.14±0.37μg·m L-1。结论益元抑瘤汤提取物具有抗肿瘤细胞增殖和抗肿瘤新生血管的作用。     

丹参酮ⅡA对EA.hy926细胞TLR4/NF-кB炎症信号通路的影响

目的 观察丹参酮ⅡA对脂多糖(LPS)诱导入脐静脉细胞融合细胞EA.hy926 TLR4/NF-кB炎症信号通路的影响,探讨丹参酮ⅡA抗动脉粥样硬化(AS)的作用机制.方法 体外培养人脐静脉细胞融合细胞EA.hy926;观察丹参酮ⅡA低、中、高剂量组对LPS刺激EA.hy926细胞的保护作用,RT-PCR和Westem bolt法检测TLR4,NF-кB、TNF-αmRNA和蛋白表达.结果 LPS 刺激组TLR4,NF-кB和 TNF-αmRNA和蛋白表达较正常组明显增加(P<0.05).与LPS刺激组相比,丹参酮ⅡA低剂量组TLR4,NF-кB,TNF-αmRNA及蛋白表达无明显差异,而丹参酮ⅡA中、高剂量组TLR4,NF-кB和TNF-αmRNA及蛋白质表达明显降低(P<0.05).结论 丹参酮ⅡA抗AS的作用机制之一是通过干预TLR4/NF-кB信号通路来实现的.     

诺帝对血管内皮生长因子诱导的人脐血源性内皮祖细胞功能的影响

探讨手性化合物诺帝(Nordy)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐血源性内皮祖细胞(EPCs)功能的影响及其意义。应用密度梯度离心法分离新鲜人脐血的单个核细胞，接种于EGM-2培养液中培养7～10 d获得内皮祖细胞(EPCs)。分别采用MTT法、Millicell-PCF培养小室系统和Matrigel内小管形成试验检测诺帝对VEGF刺激下EPCs增殖活性、迁移能力和体外形成小管样结构能力的影响。结果表明，100 μmol·L^-1诺帝作用24 h明显抑制EPCs增殖活性(P<0.05)，诺帝(25～50 μmol·L^-1)作用48～72 h也明显抑制EPCs增殖活性(P<0.05)。诺帝(25～100 μmol·L^-1)显著抑制VEGF诱导的EPCs迁移活性和体外形成小管样结构的能力(P<0.05)。诺帝能抑制体外VEGF诱导的人脐血源性EPCs增殖、迁移和体外小管形成能力，提示其具有抗EPCs效应。     

The effect of acute exposure to coarse particulate matter air pollution in a rural location on circulating endothelial progenitor cells: results from a randomized controlled study

Abstract

Context: Fine particulate matter (PM) air pollution has been associated with alterations in circulating endothelial progenitor cell (EPC) levels, which may be one mechanism whereby exposures promote cardiovascular diseases. However, the impact of coarse PM on EPCs is unknown.

Objective: We aimed to determine the effect of acute exposure to coarse concentrated ambient particles (CAP) on circulating EPC levels.

Methods: Thirty-two adults (25.9?±?6.6 years) were exposed to coarse CAP (76.2?±?51.5?μg?m^?3) in a rural location and filtered air (FA) for 2 h in a randomized double-blind crossover study. Peripheral venous blood was collected 2 and 20 h post-exposures for circulating EPC (n?=?21), white blood cell (n?=?24) and vascular endothelial growth factor (VEGF) (n?=?16–19) levels. The changes between exposures were compared by matched Wilcoxon signed-rank tests.

Results: Circulating EPC levels were elevated 2 [108.29 (6.24–249.71) EPC?mL^?1; median (25th–75th percentiles), p?=?0.052] and 20 h [106.86 (52.91–278.35) EPC?mL^?1, p?=?0.008] post-CAP exposure compared to the same time points following FA [38.47 (0.00–84.83) and 50.16 (0.00–104.79) EPC?mL^?1]. VEGF and white blood cell (WBC) levels did not differ between exposures.

Conclusions: Brief inhalation of coarse PM from a rural location elicited an increase in EPCs that persisted for at least 20 h. The underlying mechanism responsible may reflect a systemic reaction to an acute “endothelial injury” and/or a circulating EPC response to sympathetic nervous system activation.     

Decreased mobilization of endothelial progenitor cells contributes to impaired neovascularization in diabetes

• 1 Circulating bone marrow (BM)‐derived endothelial progenitor cells (EPCs) play an important role in neovascularization. In the present study, we investigated the mechanisms underlying the reduction in circulating EPCs in a mouse model of diabetes induced by streptozotocin.
• 2 Compared with non‐diabetic controls, diabetic mice had reduced circulating EPCs (0.59 ± 0.11 vs 0.94 ± 0.21%, respectively; P < 0.01) and increased plasma endothelial microparticles (18 642 ± 6809 vs 5692 ± 1862/mL, respectively; P < 0.01). In a mouse bone marrow (BM) transplantation model, increased adhesion of transplanted BM cells to aortas of diabetic mice was observed compared with control (900 ± 194 vs 431 ± 109 cells/mm², respectively; P < 0.01).
• 3 Following hindlimb ischaemia, diabetic mice exhibited suppressed EPC mobilization, a reduction in the expected increase in capillary density and suppressed restoration of transcutaneous oxygen pressure in the ischaemic tissue. Diabetic mice also showed impaired ischaemia‐induced upregulation of vascular endothelial growth factor (VEGF), hypoxia‐inducible factor (HIF)‐1α and interleukin‐1β, an exaggerated increase in matrix metalloproteinase (MMP)‐2 and ‐9 and a suppressed increase in tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP)‐1. On multivariate analysis, VEGF expression was the only independent factor related to circulating EPC count.
• 4 In conclusion, the data indicate that the decrease in basal circulating EPCs in diabetes may be attributable, in part, to consumptive loss of EPCs due to increased endothelial damage. Impairment of ischaemia‐induced EPC mobilization in the diabetic mouse model is associated with altered HIF‐1α/VEGF and MMP/TIMP regulation and represents a novel mechanism underlying defective postischaemic neovascularization in diabetes.

     

血管内皮生长因子对兔肾血管内皮细胞体外培养的影响

目的 探索血管内皮生长因子（VEGF）对兔肾血管内皮细胞（MVECs）体外培养的影响。方法采用三步梯度筛网法，获得纯度较高的肾血管球，0．5％胶原酶Ⅳ37℃消化15～20min，离心沉淀获取血管内皮细胞，分加与不加VEGF培养。对培养的细胞用倒置显微镜观察常规形态，用免疫组化法进行第Ⅷ因子相关抗原鉴定，用透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体，用间接免疫荧光法检测CD31、CD34及CD44的表达。结果加VEGF的MVECs原代3d铺满瓶底，3～4d传一代；不加VEGF的MVECs原代7～12d铺满瓶底，7～8d传一代。鉴定时两种培养的MVECs表达是一致的。倒置显微镜观察细胞铺满瓶底时呈典型的铺路卵石样结构，免疫组化法第Ⅷ因子相关抗原阳性，透射电镜观察到细胞浆中的Weibel-Palade小体，间接免疫荧光法检测CD31、CD34表达阳性，CD44阴性。结论VEGF对MVECs体外培养的影响无显著意义。     

蜕皮甾酮对内皮细胞凋亡保护作用的研究

目的　初步探讨缺氧对培养人脐静脉内皮细胞 (HU VECs)凋亡的影响及蜕皮甾酮的干预性作用。方法　①人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定 ;②建立人脐静脉内皮细胞缺氧模型 ,TUNEL法观测不同的缺氧时间 ( 0、12、2 4、4 8h)及蜕皮甾酮对内皮细胞凋亡的影响 ;③内皮细胞在常氧与缺氧状态下 ,实验组分别给于蜕皮甾酮 ( 10 0mg·L-1)刺激 ,2 4h后检测细胞中血管内皮生长因子 (VEGF)的表达。结果　随缺氧时间延长 ,HUVECs凋亡率显著升高 ;蜕皮甾酮能抑制缺氧导致的内皮细胞凋亡 ;蜕皮甾酮刺激内皮细胞VEGF表达上调。结论　缺氧作为一种致病因素 ,对内皮细胞凋亡的促发作用是随缺氧时间的延长而加重的。内皮细胞的过度凋亡是引起内皮功能障碍的一个重要因素 ,蜕皮甾酮通过抑制内皮细胞凋亡而具有内皮细胞保护作用 ,而此作用是由蜕皮甾酮刺激内皮细胞VEGF表达上调所介导的。     

内外源性EETs对血管内皮一氧化氮合酶的表达及其在Thr-495位磷酸化的作用

目的　研究细胞色素P4 5 0表氧化酶基因转染和直接加入EETs对内皮细胞eNOS表达及其在Thr 4 95位磷酸化的影响。方法　在原代培养的牛主动脉内皮细胞中 ,分别加入生理浓度的 8,9 EET(1 0 0nmol·L-1 )、1 1 ,1 2 EET(1 0 0nmol·L-1 )、1 4 ,1 5 EET(1 0 0nmol·L-1 )孵育 4h ,或直接用重组腺相关病毒介导的花生四烯酸表氧化酶转染牛主动脉内皮细胞2wk ,以产生内源性EETs ,用Westernblot法检测总eNOS蛋白的表达及eNOSThr 4 95磷酸化的水平 ;此外 ,从大鼠尾静脉注射真核表达质粒pCB6、pCB6 2C1 1OR、pCB6 2J2和pCB6 F87V ,2wk后检测大鼠主动脉总eNOS表达及eNOSThr 4 95磷酸化的水平。结果　与空白和溶媒组比较 ,外源性EETs明显促进内皮细胞总eNOS表达 ,增加eNOSThr 4 95的磷酸化 ,而CYP4 5 0抑制剂 (1 7 ODYA)则可明显降低eNOS表达和eNOSThr 4 95的磷酸化水平 ;与相应的对照组比较 ,体内和体外转染不同的表氧化酶基因均能明显上调内皮细胞eNOS的表达 ,增加eNOSThr 4 95的磷酸化水平。结论　EETs和CYP表氧化酶不仅能明显促进血管内皮细胞总eNOS蛋白的表达 ,而且还通过其翻译后修饰来增加其Thr 4 95位蛋白磷酸化水平     

普伐他汀对人内皮祖细胞一氧化氮合成的影响

目的观察普伐他汀对人内皮祖细胞（EPCs）一氧化氮（NO）合成的影响。方法密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,培养7d后,收集贴壁细胞并分别加入普伐他汀,10μmol/L及100μmol/L干预48h,免疫组化、荧光显微镜和流式细胞仪鉴定EPC,用RT-PCR方法测定对细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表达的影响,并用硝酸还原酶法测定培养液中一氧化氮（NO）的水平。结果普伐他汀组的人内皮祖细胞eNOS mRNA的表达、NO的合成明显增加。结论普伐他汀可增加人内皮祖细胞eNOS mRNA的表达和NO的合成