梓醇上调局灶脑缺血大鼠缺血灶周围大脑皮质BDNF和TrkB蛋白表达

目的观察梓醇对局灶脑缺血大鼠缺血灶周围大脑皮质BDNF及其受体TrkB蛋白表达的影响,探讨梓醇促神经修复作用分子基础。方法 SD大鼠42只,随机分为假手术组、模型组、生理盐水组、梓醇低、中、高剂量治疗组(剂量分别为1、5、10 mg.kg-1)和胞磷胆碱(剂量为0.5 g.kg-1)对照组。开颅电凝右侧大脑中动脉制备局灶永久性脑缺血模型,造模后24 h,首次经腹腔注射梓醇或胞磷胆碱进行干预,每日1次,连续7 d。于造模后15 d断头取脑,制备脑片和脑组织匀浆,采用免疫荧光组织化学染色和Western blot检测缺血灶周围大脑皮质BDNF及其受体TrkB蛋白表达。结果 BDNF阳性细胞被Cy3标记,具有神经元的形态特征,胞质和突起呈现红色,细胞核未见红色荧光。缺血灶周围大脑皮质BDNF阳性细胞数模型组和生理盐水组均较假手术组明显增加(P<0.05),梓醇1、5、10 mg.kg-1剂量组均较模型组明显增加(P<0.05),且梓醇5、10 mg.kg-1剂量组明显高于胞磷胆碱组(P<0.05)。TrkB阳性细胞被FITC标记,具有神经元形态特征,胞质和突起呈现绿色,胞核未见绿色荧光。TrkB阳性细胞数模型组较假手术组有减少趋势,但差异无显著性(P>0.05);梓醇5 mg.kg-1剂量组较模型组和胞磷胆碱组明显增加(P<0.05)。Western blot检测结果与免疫荧光原位检测结果一致。结论梓醇上调局灶脑缺血大鼠缺血灶周围大脑皮质BDNF及其受体TrkB蛋白表达,有助于模型大鼠神经缺失功能恢复。     

梓醇促进局灶脑缺血大鼠皮质脊髓束芽生和重塑

目的观察梓醇对局灶脑缺血大鼠病灶对侧皮质脊髓束(corticospinal tract,CST)轴突芽生和重塑的影响。方法30只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、生理盐水组、梓醇治疗组和胞磷胆碱对照组。开颅电凝右侧大脑中动脉,制备局灶永久性脑缺血模型,造模后24 h首次经腹腔注射梓醇(5 mg·kg-1)或胞磷胆碱(0.5 g·kg-1),每日1次,连续7d。采用黏贴物移除实验和足失误实验测试受累前肢(左前肢)功能状况;核磁共振(MRI)测量脑梗死体积;生物素化葡聚糖胺(biotinylated dextran amine,BDA)顺行示踪健侧CST,检测脊髓颈膨大区健侧CST越边至失神经支配侧的纤维数量,了解脊髓颈膨大区CST轴突重塑;免疫荧光双标脊髓颈膨大区BDA标记纤维与生长相关蛋白(growth-associatedprotein,GAP-43),检测BDA/GAP-43共定位信号,了解脊髓颈膨大区CST轴突芽生能力。结果造模后7、14、21和28d,梓醇组和胞磷胆碱组左前肢黏贴片移除时间均比模型组和生理盐水组明显缩短(P<0.05),左前肢失误率也较模型组和生理盐水组明显降低(P<0.05);其中,造模后28 d时,梓醇组左前肢感觉运动功能状况明显优于胞磷胆碱组(P<0.05)。造模后1和28 d,各组脑梗死体积差异无显著性(P>0.05)。造模后28 d,梓醇组脊髓颈膨大区健侧CST越边纤维占(8.5%±2.1%),较模型组(4.7%±1.3%)和胞磷胆碱组(5.5%±1.8%)明显增加(P<0.05);梓醇组脊髓颈膨大区BDA/GAP-43共定位信号明显强于模型组和胞磷胆碱组(P<0.05)。结论梓醇可增强缺血性脑卒中大鼠皮质脊髓束轴突芽生和重塑能力,有助于受累肢体感觉运动功能恢复。     

梓醇增强缺血灶周围大脑皮质神经元轴突芽生及突触新生

目的观察梓醇对局灶脑缺血大鼠缺血灶周围区大脑皮质(peri-infarct cortex,PIC)神经元轴突芽生及其形成突触的影响,揭示梓醇促神经修复作用的形态学基础。方法SD大鼠36只,随机分为假手术组、模型组、生理盐水组、梓醇低、中、高剂量组(剂量分别为1、5、10 mg.kg-1)和胞磷胆碱组(阳性药物对照组,剂量为0.5 g.kg-1)。开颅电凝右侧大脑中动脉制备局灶永久性脑缺血模型,造模后24 h,首次经腹腔注射梓醇或胞磷胆碱进行干预,每日1次,连续7 d。于造模后15 d断头取脑,采用免疫荧光双标组织化学染色技术检测PIC区生长相关蛋白-43(growth-associated protein,GAP-43)与突触素(synaptophysin,P38)共定位信号,了解梓醇对PIC区芽生轴突形成突触的影响;采用透射电镜结合体视学方法观察梓醇对PIC区神经毡内突触数密度(number density,Nv)和面密度(surface density,Sv)的影响,明确梓醇对突触重构的可能作用。结果免疫荧光双标组织化学染色显示,绿色荧光显示P38标记的突触前末端,红色荧光显示GAP-43表达阳性的芽生轴突,GAP-43/P38共定位呈现黄色,显示芽生轴突形成的突触末端。Pearson相关系数反映GAP-43/P38共定位频度,Pearson相关系数越大表明芽生轴突形成突触连接的数量越多。结果模型组和生理盐水组Pearson相关系数明显大于假手术组(P<0.05),提示脑缺血后存在自发性轴突芽生,并形成新的突触连接;梓醇各剂量组Pearson相关系数均比模型组明显增大(P<0.05),且梓醇中、高剂量组明显大于胞磷胆碱组(P<0.05),提示梓醇可促进PIC区芽生轴突形成突触连接,增强突触新生。突触超微结构分析显示,梓醇中剂量组PIC区神经毡内突触Nv和Sv较模型组和生理盐水组明显增加(P<0.05),但与胞磷胆碱组比较差异无显著性(P>0.05),提示梓醇对脑缺血后突触重构有明显促进作用。结论梓醇能促进局灶脑缺血大鼠PIC区神经元芽生轴突形成新的突触连接,增强突触结构可塑性。     

梓醇对大鼠梗死灶周围大脑皮质神经元树突生长及突触素表达的影响

目的观察梓醇对局灶脑缺血大鼠梗死灶周围大脑皮质(peri-infarction cortex,PIC)锥体神经元树突生长及突触素p38蛋白表达的影响,探讨其促脑卒中后神经修复作用及机制。方法 57只清洁级成年SD大鼠,随机分为假手术组,模型组,生理盐水组,梓醇低、中、高剂量(分别为1、5、10 mg·kg-1)组和胞磷胆碱(0.5 g·kg-1)对照组。开颅电凝右侧大脑中动脉制备局灶永久性脑缺血模型。于造模后24 h开始腹腔注射不同剂量梓醇或胞磷胆碱,每日1次,连续7d。术后1、4、7和15 d采用角落实验评估神经缺失功能恢复状况;术后1 d和15 d磁共振成像测量脑梗死体积;术后15 d,断头取脑,Golgi-Cox染色显示PIC区锥体神经元树突变化,免疫荧光组织化学染色及Western blot检测PIC区突触素p38蛋白表达。结果梓醇各剂量组和胞磷胆碱组术后7 d和15 d神经功能恢复明显优于模型组和生理盐水组(P<0.05);术后1 d、15 d,各实验组脑梗死体积差异无显著性(P>0.05);梓醇中剂量组PIC区锥体神经元树突分支数和树突棘密度均比模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组明显增加(P<0.05);梓醇各剂量组PIC区突触素p38表达均比模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组明显上调(P<0.05)。结论梓醇可增强局灶脑缺血大鼠PIC区锥体神经元树突可塑性,上调突触素p38表达,促进神经缺失功能恢复。     

梓醇上调GAP-43表达伴随局灶脑缺血大鼠神经功能恢复

目的观察滋阴中药地黄的主要活性成分梓醇对局灶脑缺血大鼠神经功能恢复及缺血周围区大脑皮质生长相关蛋白-43表达的影响。方法♂SD大鼠42只,随机分为假手术组、模型组、生理盐水组、梓醇低、中、高剂量治疗组(剂量分别为1、5、10mg.kg-1)和胞二磷胆碱(剂量为0.4g.kg-1)对照组,每组6只。采用开颅电凝右侧大脑中动脉的方法制备局灶脑缺血模型。造模后6h,经腹腔注射首次给予梓醇进行干预,每天1次,连续7d。给药前及术后1、4、7及15d分别评定各组大鼠姿势反射及肌力变化,并在术后15d断头取脑,制备脑片和脑组织匀浆,采用免疫荧光组织化学染色和Western blot检测缺血周围区大脑皮质GAP-43蛋白表达。结果假手术组无明显神经功能障碍;梓醇高、中剂量治疗组姿势反射及肌力恢复明显优于模型组、生理盐水组和胞二磷胆碱组,且梓醇各剂量治疗组缺血周围区GAP-43蛋白表达比其它实验组明显上调(P<0.05)。结论梓醇可上调脑缺血大鼠缺血周围区皮质GAP-43表达,促进轴突再生,加速其神经功能恢复。     

慢性脑缺血大鼠Nogo-A和NgR表达的变化

目的 探讨大鼠海马区Nogo-A和NgR表达在慢性脑缺血的不同时间点的动态变化.方法 大鼠随机分为假手术组、15、30和60 d模型组;采用双侧颈总动脉永久结扎建立慢性脑缺血模型;Morris水迷宫试验检测行为学变化;免疫组化染色检测Nogo-A和NgR的表达变化.结果 Nogo-A和NgR免疫反应阳性细胞数模型组比假手术组均增多(P＜0.01),与行为学改善基本相符.结论 慢性脑缺血造成Nogo-A和NgR表达持续升高可能是成年哺乳动物损伤后神经再生障碍的重要原因之一.     

梓醇促进脑缺血大鼠神经修复的行为学观察与评价

目的采用系列行为学评价手段评测梓醇对局灶脑缺血大鼠神经功能恢复的影响,探讨其治疗时间窗和有效治疗剂量。方法制备局灶永久性脑缺血大鼠模型,于造模后6h、24 h两个时点开始腹腔注射给予低、中、高剂量(1、5、10mg.kg-1)梓醇进行治疗,每日1次,连续7 d,分别于造模后1、4、7、15、21 d,进行Bederson评分、肌力评定、平衡木行走试验、受累前肢食物抓取成功率测试。结果与模型组比较,各种神经行为学评价梓醇治疗组均有改善;其中术后21d,梓醇中、高剂量组受累前肢(左)食物抓取成功率分别为48.7%±5.4%(约相当于基线值72%)和47.3%±4.8%(约相当于基线值70%),与模型组(25.8%±4.1%,约相当于基线值38%)比较差异具有显著性(P<0.05)。提示梓醇对脑缺血后感觉运动功能恢复有促进作用。但术后21 d,术后6 h给药组和术后24 h给药组左前肢食物抓取成功率差异无显著性(P>0.05),提示脑缺血后延迟给予梓醇治疗仍对大鼠神经功能恢复有促进作用。结论采用Bederson评分、肌力评定、平衡木行走试验和左前肢食物抓取功能测定等多种方法,证实梓醇对脑缺血后功能恢复有促进作用,后两种评价方法更为灵敏;梓醇治疗有效剂量为1～10 mg.kg-1,缺血后24 h给药仍然有效。     

梓醇对脑缺血后神经血管单元构筑的影响

目的结合神经行为学评价,研究地黄梓醇对局灶性脑缺血后神经血管单元构筑的影响。方法 SD大鼠18只,随机分为假手术组、模型组、梓醇组,每组6只。采用开颅电凝法制备局灶性脑缺血模型,造模成功后6h予梓醇进行干预(5 mg·kg-1,ip,qd×7d)。术后1、4、7、14 d采用平衡木漏脚率及肢体不对称应用实验进行行为学评分。末次评分后麻醉,灌注明胶墨汁显示血管,取脑组织切片,行神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫组织化学和尼氏染色分别显示星形胶质细胞和神经元。结果 (1)术后1d与假手术组相比,模型组大鼠各时点平衡木行走足滑落次数明显增加,肢体不对称使用率为63.3%(P<0.01);术后4 d,梓醇组大鼠肢体不对称使用率下降为51.7%,与模型组58.3%比较差异有显著性(P<0.05),术后7、14 d,大鼠的健侧与患侧应用次数差值缩小,肢体不对称使用率分别为31.7%和13.3%,与模型组58.3%和53.3%比较差异有显著性(P<0.01),但均未恢复至假手术组水平。(2)脑缺血后14 d,与假手术组比较,模型组微血管稀疏,变短,丢失42.4%(P<0.01),神经元数目减少66.5%(P<0.01)、胞体固缩、尼氏小体淡染,数目减少,星形胶质细胞数目增多2.3倍(P<0.01)、胞体肥大、分支增多增粗;与模型组相比,梓醇组微血管分布密集(P<0.01),神经元数目增多29.3%(P<0.05),反应性星形胶质细胞减少20.2%(P<0.05),胞体体积较小,接近于正常、分支数目不如模型组多。结论梓醇对局灶性脑缺血后引起的神经血管单元病变有明显的保护作用,且能促进脑缺血后神经功能的恢复。     

布美他尼通过Nogo-A/RhoA调控脑梗死大鼠的轴突再生

目的探讨布美他尼通过Nogo-A/RhoA调控脑梗死大鼠的轴突再生。方法颅内注射内皮素(ET-1)制作脑梗死模型。成年雄性大鼠随机分为3组:假手术组、模型组、布美他尼0.2mg/kg组,每组10只,应用微量注药系统于侧脑室内给药3周,每天1次。每组取5只大鼠用于测量梗死体积,免疫荧光染色检测脑梗死大鼠BDA阳性纤维通过脊髓灰质联合越过中线的长度;采用Western blotting检测synaptophysin和PSD-95水平、和轴突生长抑制因子Nogo-A和RhoA的水平。结果与模型组比较,布美他尼组BDA阳性纤维通过脊髓灰质联合越过中线的轴突芽生的长度明显增多(P0.05)。与模型组比较,布美他尼组的synaptophysin和PSD-95水平明显升高(P0.05)。与模型组比较,布美他尼组Nogo-A和RhoA水平均显著降低(P0.05)。结论布美他尼通过Nogo-A/NgR调控脑梗死大鼠的轴突再生,为更好地了解布美他尼发挥作用的可能机制和脑梗死的临床康复提供新的理论基础和治疗靶点。     

胞磷胆碱和硫酸镁联用对大鼠局灶脑缺血脑梗死体积及caspase-3表达的影响

目的:研究胞磷胆碱(CDP-c)和硫酸镁联用对大鼠实验性短暂局灶脑缺血的神经保护作用。方法:124只雄性SD大鼠分为7个组,假手术组4只大鼠,余6组均为20只:(1)模型组,(2)对照组(0.9%氯化钠1 mL.kg-1.d-1),(3)CDP-c组(250 mg.kg-1.d-1),(4)硫酸镁组(90 mg.kg-1.d-1),(5)两药联用A组(CDP-c 250 mg.kg-1.d-1,硫酸镁90 mg.kg-1.d-1),(6)两药联用B组(CDP-c 150 mg.kg-1.d-1,硫酸镁60 mg.kg-1.d-1),其中10只用于测定脑梗死体积,10只用于caspase-3和TUNEL阳性细胞两指标的测定。用大脑中动脉栓塞法制作短暂性(90 min)局灶脑缺血模型,观察CDP-c、硫酸镁单用及不同剂量联用7 d后,大鼠脑梗死体积、caspase-3表达及凋亡细胞数。结果:与对照组相比,CDP-c、硫酸镁单用及两药联用组脑梗死体积较小,caspase-3表达、凋亡细胞数均较少,并有统计学意义(P<0.05)。两药联用组脑梗死体积均比单用药组小,caspase-3表达、凋亡细胞数亦较两药单用组少(P<0.05)。剂量不同的两药联用组相比各项指标均无显著差别(P>0.05)。结论:CDP-c和硫酸镁单用对实验性短暂脑缺血模型可能具有神经保护作用。CDP-c与硫酸镁联用对实验性短暂局灶脑缺血的神经保护可能有协同作用,并且可以减少各药的用量。     

梓醇改善东莨菪碱诱导的学习记忆障碍及机制研究

目的研究梓醇对由东莨菪碱所致小鼠空间学习记忆障碍的影响和机制。方法小鼠随机分为4组:正常组、模型组(东莨菪碱,2 mg.kg-1)、奥拉西坦组(阳性药物,105mg.kg-1)和梓醇治疗组(9 mg.kg-1),采用水迷宫测试小鼠空间学习记忆功能。于实验前30 min腹腔注射东莨菪碱诱导小鼠学习记忆障碍模型,记录小鼠逃避潜伏期时间。水迷宫测试毕,处死小鼠,分离大脑皮质和海马,匀浆取上清液测大脑皮质和海马中乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的含量。结果①各组实验前逃避潜伏期无差异;给药东莨菪碱前后差异有显著性。②组间比较,与正常组比较,东莨菪碱导致记忆障碍;与东莨菪碱组比较,阳性药物奥拉西坦和梓醇治疗组逃避潜伏期明显缩短,ACh和BDNF含量明显增加(P<0.05)。结论小鼠注射东莨菪碱成功诱导学习记忆机能障碍模型。梓醇改善东莨菪碱诱导的学习和记忆障碍,其机制可能与促进BDNF表达,增加脑ACh含量有关。     

前列地尔对局灶性脑缺血模型大鼠大脑皮层基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9表达的影响

目的:探讨前列地尔对局灶性脑缺血模型大鼠大脑皮层基质金属蛋白酶(MMP)2和MMP-9表达的影响。方法:取SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照(尼莫地平1 mg.kg-1)组和前列地尔低、中、高剂量(1.25、2.50、5.00μg.kg-1)组,每组5只,连续给予相应药物6 d,每日1次,末次给药后建立局灶性脑缺血模型,于大鼠清醒后进行神经功能缺损评分,缺血24 h后检测各组大鼠大脑皮层MMP-2、MMP-9的表达情况。结果:与假手术组比较,模型组神经功能缺损评分明显更高,MMP-2、MMP-9表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,阳性对照组和前列地尔中、高剂量组神经功能缺损评分明显较低,MMP-2、MMP-9表达明显降低(P<0.05)。结论:前列地尔预处理对局灶性脑缺血模型大鼠具有神经保护作用,其机制可能与抑制大脑皮层MMP-2、MMP-9的表达有关。     

PKD1/HDAC5轴在心肌梗死大鼠损伤心肌组织修复中的作用

摘要：目的 分析蛋白激酶D1（PKD1）/Ⅱa类组蛋白去乙酰化酶5（HDAC5）轴对受损心肌梗死大鼠心肌修复的 影响。方法 根据随机数字表法把40只Wistar大鼠划分为4组：假手术组、模型组、PKD1（2 mg·kg-1·d-1 PKD1）用药组和阻断剂CID755673（2 mg·kg-1·d-1 PKD1+10 ng·kg-1·d-1 CID755673）组,每组10只。模型组采用经典的左冠状动脉结扎术复制心肌梗死模型,假手术组开胸手术但没有进行结扎处理。模型组和假手术对照组均给予治疗组相同剂量的生理盐水。采用间隔1日1次的尾静脉注射方式给药,共28 d。采用HE染色分析心肌组织病理变化,Masson染色分析心肌组织的胶原变化,TUNEL法检测心肌细胞的凋亡程度,免疫印迹法和免疫组化染色检测心肌细胞HDAC5、肌细胞增强因子2（MEF2）和心肌肌钙蛋白I（cTn I）的表达。结果 心肌组织病理变化表明,假手术组大鼠心肌组织正常,无坏死和炎症浸润,胶原占比很低,偶见凋亡的心肌细胞,HDAC5和MEF2阳性细胞数量较少,cTn I阳性细胞数量较多;和假手术组相比,模型组大鼠心肌组织坏死明显,伴炎症浸润,胶原占比、凋亡的心肌细胞数量和MEF2阳性细胞数量均显著增加（P＜0.05）,cTn I阳性细胞数量显著减少（P＜0.05）。和模型组相比,PKD1治疗能显著改善心肌梗死大鼠心肌坏死程度,使受损心肌组织胶原占比、凋亡的心肌细胞数量和MEF2阳性细胞数量均显著减少（P＜0.05）,cTn I阳性细胞数量显著升高（P＜0.05）;而CID755673可以阻断PKD1的这一治疗作用。结论 PKD1可能具有结合HDAC5促心肌梗死大鼠损伤心肌组织修复的作用,这一作用能够被CID755673所阻断。