知母皂苷B-Ⅱ抗抑郁作用及其机制研究

目的研究知母皂苷B-Ⅱ抗抑郁的作用,并初步探讨其作用机制。方法采用小鼠悬尾实验、小鼠强迫游泳实验、开野实验;阿朴吗啡致小鼠刻板行为实验;抑制单胺（去甲肾上腺素NE和多巴胺DA）重摄取实验;育亨宾毒性增强实验;以及5-羟色胺酸（5-HTP）致甩头作用等动物模型来考察知母皂苷B-Ⅱ抗抑郁作用及其可能的机制。分别以小鼠不动时间、自主活动数、刻板行为评分、死亡率作为评价指标。结果在小鼠悬尾实验中,知母皂苷B一Ⅱ（100、150mg／kg）能够明显缩短小鼠的不动时间;在小鼠强迫游泳实验中,知母皂苷B-Ⅱ（50、100、150mg／kg）均能够明显缩短小鼠的不动时间;对开野实验中小鼠的自主活动次数无明显影响。在抑制NE和DA重摄取实验中,知母皂苷B-Ⅱ高剂量（150mg／kg）显著增加多巴胺（DA）致小鼠死亡作用,但对去甲肾上腺素（NE）重摄取抑制作用不明显。阿朴吗啡致小鼠刻板运动实验显示,知母皂苷B-Ⅱ（100、150mg／kg）对注射阿朴吗啡后的小鼠刻板运动有显著增强作用,差异具有显著意义（P〈0．05）;具有增加5-羟色胺酸（5-HTP）致甩头作用;知母皂苷B-Ⅱ不具有增加育亨宾毒性的作用。结论知母皂苷B-Ⅱ有抗抑郁活性,其作用机制可能与增强脑内5-HT、DA神经系统作用有关。     

知母皂苷及其苷元在中枢神经系统的药理作用

知母为百合科植物知母的干燥根茎,知母皂苷及其苷元在治疗中枢神经系统疾病中发挥重要作用. 知母皂苷及其苷元通过促进脑M受体生成,对神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）的影响,对脑内自由基代谢的影响,对学习记忆的影响等发挥抗衰老作用;同时,知母皂苷及其苷元具有明显抗抑郁作用和抗脑缺血-再灌注损伤的作用.     

知母中的两种新呋甾皂苷

目的研究知母根茎的化学成分。方法采用水煎提取、大孔吸附树脂SP825柱色谱、反相C₁₈柱色谱等进行分离，并通过化学手段和光谱分析(FAB-MS，¹H NMR，13C NMR，¹H-¹H COSY)鉴定其化学结构。结果从知母根茎中分离得到6种甾体皂苷，分别鉴定为：(25S)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-22-羟基-5β-呋甾-2β，3β，26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(知母皂苷N，1)，知母皂苷E_l(2)，(25S)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-22-甲氧基-5β-呋甾-2β，3β，26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(知母皂苷O，3)，知母皂苷E₂(4)，(25R)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-22-羟基-5α-呋甾-2α，3β，26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-［β-D-吡喃木糖基-(1→3)］-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷(purpureagitosid，5)，marcogenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside (6)。结论化合物1和3为新化合物，命名为知母皂苷N和知母皂苷O，化合物5为首次从知母中分离得到。     

知母皂苷对谷氨酸致老年性痴呆模型小鼠的作用

目的：研究知母皂苷对谷氨酸所致痴呆模型小鼠学习记忆能力、脑内胆胺类递质和海马内pAPP阳性神经元的影响，以期探讨知母皂苷抗老年性痴呆的作用机制。方法：用谷氨酸致老年性痴呆模型小鼠为实验对象，以其学习记忆能力、脑内胆胺类递质含量、背海马和齿状回内β-APP阳性神经元的数量为指标，全面考察知母皂苷抗老年性痴呆的作用。结果：知母皂苷（100，200mg·kg^-1，ig），能明显对抗老年性痴呆模型小鼠学习记忆能力的下降，增加脑内胆胺类递质的含量，抑制背海马和齿状回内β-APP阳性神经元的生成。结论：知母皂苷对谷氨酸所致的老年性痴呆有明显的改善作用。     

知母的皂苷成分

目的：研究知母的化学成分,寻找新的活性物质。方法：利用大孔树脂柱色谱、硅胶柱色谱及高效液相色谱等手段进行分离,根据化合物的理化性质及光谱(IR,FAB-MS,ESI-MS,¹HNMR,¹³CNMR,DEPT,HMQC,HMBC,NOESY和ROESY)数据鉴定结构。结果：从中药知母分离得到两种甾体皂苷,确定其结构是：(5β,25S)-螺甾烷-3β,15α,23α-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(1)和(5β,25S)-螺甾烷-3β,23α-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(2)。结论：1和2均是新化合物,分别命名为知母皂苷F和知母皂苷G。     

知母商品药材中的皂苷类成分含量测定

目的：考察市场流通商品知母药材的品质。方法：采用高效液相-蒸发光散射法测定不同流通地区的商品知母药材中皂苷类成分的含量、结果：知母皂苷E1、知母皂苷B-Ⅱ、知母皂苷B、知母皂苷AⅢ的平均回收率分别为100．31％（RSD为1．93％）、99．22％（RSD为1．72％）、101．80％（RSD为2．04％）、101．54％（RSD为1．76％），4种皂苷类成分的含量之和为4．4502％～6．2854％。结论：知母商品药材中皂苷类成分含量存在一定的差异，其品质差异的影响因素有待进一步考察。     

知母皂苷对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的保护作用

目的 在大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型中,初步研究知母皂苷对水通道蛋白4（aquapo rin-4,AQP-4）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）表达的影响。方法 240只SD大鼠分为6组（40只/组）：假手术组、模型组、知母皂苷低、中、高剂量组（SA,10,20,40 mg·kg^-1）和尼莫地平组（12 mg·kg^-1）。采用"插线法"造模。再灌注48 h后,观察每组大鼠的神经症状,并进行神经行为学评分;测定脑梗死范围、脑含水量;采用伊文思蓝法对各组血脑屏障的通透性进行检测;采用酶联免疫吸附实验（ELISA）对各组TNF-α、IL-6和IL-1β的含量进行测定;采用Western blot法对各组AQP-4的含量进行测定;采用HE染色法观察各组大鼠脑组织病理形态的变化。结果 知母皂苷组能改善造模后造成的神经功能缺损、脑组织病理形态学改变;降低脑含水量、脑梗死面积和血脑屏障的通透性;下调AQP-4、TNF-α、IL-6、IL-1β的表达。结论 知母皂苷对脑缺血/再灌注SD大鼠能起到一定的保护作用,这可能是由于AQP-4和TNF-α、IL-6、IL-1β表达下调,从而维持血脑屏障的稳定性有关。     

知母皂苷对学习记忆障碍模型小鼠的作用

目的　研究知母皂苷对化学药物导致小鼠学习记忆能力下降的对抗作用,探讨知母皂苷的促智作用及其机制。方法　以化学药物导致学习记忆障碍模型小鼠为实验对象,以其学习记忆能力为指标,全面考察知母皂苷的促智作用。结果　知母皂苷(10 0、2 0 0、4 0 0mg·kg-1,ip)能对抗记忆障碍模型小鼠学习记忆能力的下降。结论　知母皂苷能有效地促进记忆障碍模型小鼠的学习记忆能力。     

HPLC-CAD法测定盐制前后知母中知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元

目的 利用HPLC-电雾式检测器（charged aerosol detector,CAD）联用技术建立知母中知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元的测定方法,并比较知母盐制前后两种成分的变化。方法 知母皂苷BⅡ以乙腈-水（25：75）为流动相,进样量为10 μL;菝葜皂苷元以甲醇-水（95：5）为流动相,进样量为20 μL;其他色谱条件均采用Thermo C₁₈柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）,体积流量为1 mL/min,柱温为30℃;Corona参数：氮气压力为241.3 kPa,Filter：High,Range：200 pA。结果 知母皂苷BⅡ在0.305～4.880 μg线性关系良好,r=0.999 4,平均回收率为99.1%,RSD值为1.2%;菝葜皂苷元在0.490～7.840 μg线性关系良好,r=0.999 1,平均回收率为98.0%,RSD值为1.3%。知母中知母皂苷BⅡ为3.16%～5.92%,盐制后为4.15%～7.20%;知母中菝葜皂苷元为0.42%～1.39%,盐制后为0.52%～1.54%。结论 CAD检测器具有较为平稳的基线和较高的灵敏度,更加适用于知母皂苷类及含有较弱或无紫外吸收成分的测定,知母盐制后知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元的量均有所升高。     

西陵知母中甾体皂苷的分离与鉴定

目的:从新鲜西陵知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge.)根茎中分离出有生理活性的化学成分—甾体皂苷。方法:用柱色谱法分离纯化,通过理化方法及光谱分析(UV,IR,¹HNMR,¹³CNMR,EI-MS,ESI-MS,HMBC,HMQC)鉴定化学结构。结果:从新鲜西陵知母根茎的乙醇提取物中分离得到西陵知母皂苷A与B,其化学结构分别为萨尔萨皂苷元-3-O-β-D-葡糖基(1→2)-O-β-D-半乳糖苷和萨尔萨皂苷元-3-O-β-D-葡糖基(1→3)-O-β-D-葡糖基(1→2)-O-β-D-半乳糖苷。结论:西陵皂苷B为一新化合物。     

Preparation of cardiovascular disease-related genes microarray and its application in exploring ligustrazine-induced changes in endothelial gene expression

To study the molecular mechanism of action of ligustrazine, a low-density oligonucleotide microarray for cardiovascular disease-related genes, was constructed, and the preparation and hybridization protocols were optimized. Under the optimized conditions, the molecular mechanism of action of ligustrazine was analyzed with human umbilical vein endothelial cells. After 4 h of treatment with 100 microg/ml of ligustrazine, calcium-ATPase gene, sodium channel gene, P450c11 gene in human umbilical vein endothelial cells were up-regulated while apolipoprotein C-III gene was down-regulated. The results were shown to be reproducible. RT-PCR confirmed the results from microarray. These results suggest that ligustrazine may act on the function of human umbilical vein endothelial cells via modulating the expressions of cardiovascular disease-related genes. This also demonstrates the use of oligonucleotide microarray technology as an approach to studying targets of active components of Traditional Chinese Medicine.     

MG132诱导人血管内皮细胞凋亡及对caspase-3表达的影响

目的　观察蛋白酶体抑制剂MG132对人血管脐静脉内皮细胞(ECV -304)的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3表达的影响。方法　采用两个浓度(2, 5μmol·L-1 )的蛋白酶体抑制剂MG132处理ECV -304细胞;DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率;RT -PCR检测细胞内凋亡相关基因caspase -3的转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达。结果　对照组ECV -304细胞凋亡率低于5%,在2μmol·L-1MG132作用下,凋亡率为11. 3%,MG132浓度升至5μmol·L-1,细胞凋亡率增致44 .5%,MG132诱导ECV 304细胞凋亡具有量-效关系;RT -PCR检测发现细胞内凋亡相关基因caspase 3mRNA表达上调;免疫细胞化学检测细胞caspase- 3蛋白表达水平升高。结论:蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导血管内皮细胞凋亡,其机制可能与MG132抑制UPP活性,促进caspase- 3基因转录,使细胞内caspase -3增加而促进细胞凋亡。     

脂质体介导的肝细胞生长因子基因在脐静脉内皮细胞中的表达与鉴定

目的构建含肝细胞生长因子(HGF)基因真核表达载体pEGFP-N1-HGF,观察HGF基因在人脐静脉内皮细胞中的表达。方法由重组质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,应用脂质体将重组质粒pEGFP-N1-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达克隆,采用荧光显微镜观察、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学方法鉴定。结果经G418筛选后可形成抗性细胞克隆;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR能扩增出HGFmRNA预期的699bp片段;免疫细胞化学证实转染HGF基因的细胞有HGF蛋白的表达。结论重组质粒pEGFP-N1-HGF能够在细胞株ECV304转录、表达。     

应用cDNA微阵列对MDS骨髓细胞基因表达谱的初步研究

目的应用cDNA微阵列初步研究骨髓增生异常综合征(MDS)的基因表达谱。方法将2例患骨髓单个核细胞RNA各取等量混合后进行逆转录Cy5标记，和Cy3标记的正常对照cDNA混合，然后与H141微阵列杂交。结果H141s芯片中共点样13484个基因克隆，其中1064个靶克隆是针对同一基因内不同序列的cDNA片段，重复点样至少2次，表达结果在2张芯片内各自完全一致的分别为625个(58．7％)和630个(59．2％)，而2张芯片之间对应位置点检测结果完全相同的为783个(73．6％)。MDS患存在表达差异的基因为409个，其中101个基因参与造血调控，主要涉及转录因子、细胞周期调节蛋白、代谢相关基因、表面黏附分子等。结论cDNA微阵列可高效提供丰富的基因表达信息，并为深入研究MDS的发病分子机理提供线索。重复点样实验可降低微阵列操作过程引起的表达偏差。     

腺病毒介导的TSP1f基因转移对脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的影响

目的探讨腺病毒介导的凝血酶敏感蛋白1（TSP1）抗血管新生衍生物（TSP1f）基因转移对人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的影响。方法应用RTPCR方法从正常人外周血单个核细胞扩增TSP1f cDNA序列构建TSP1f重组腺病毒（ADV-TSP1f）;Western blot方法检测ADV-TSP1f介导TSP1f在K562细胞中的表达;台盼蓝拒染检测经ADV-TSP1f感染的K562细胞条件培养基对ECV304细胞增殖的抑制作用。结果K562细胞经ADV-TSP1f感染可高效表达／分泌TSP1f多肽;经ADV-TSP1f感染的K562细胞条件培养基可显著抑制ECV304细胞增殖,以ADV-LacZ及PBS作对照,抑制率分别为51．6％和53．8％。结论ADV-TSP1f可显著抑制人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖,可望成为有效的恶性肿瘤血管新生抑制剂。     

血管内皮生长因子受体-3在血管内皮细胞和平滑肌细胞中的表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子受体-3（VEGFR-3）在血管内皮细胞和平滑肌细胞中的表达。方法分离人脐带中的脐静脉和脐动脉,冰冻切片后以免疫荧光法检测VEGFR-3的表达。结果VEGFR-3荧光信号表达于脐静脉内皮细胞和平滑肌细胞,以及脐动脉内皮细胞、平滑肌细胞和外周细胞。结论血管内皮细胞和平滑肌细胞均表达VEGFR-3。     

三氧化二砷对人脐静脉内皮细胞作用的研究

目的以人脐静脉内皮细胞作为血管新生内皮细胞的模拟物,通过研究As2O3对人脐静脉内皮细胞的影响,探讨As2O3的抗血管新生作用机制。方法分离和培养人脐静脉内皮细胞,以不同浓度和时间的As2O3和VEGF作用于脐静脉内皮细胞,应用流式细胞技术测定As2O3和VEGF对脐静脉内皮细胞增殖、细胞凋亡和癌基因bcl-2表达的影响。结果As2O3以时间和剂量依赖的方式抑制内皮细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制癌基因bcl-2表达,而VEGF可拮抗As2O3的部分作用。结论As2O3可以通过直接作用于内皮细胞而抑制血管新生。     

Inhibition of vascular endothelial growth factor activity by transfection with the soluble FLT-1 gene

Vascular endothelial growth factor (VEGF)-induced angiogenesis is involved in the etiology of some cardiovascular diseases. The soluble form of VEGF receptor, FLT-1 (sFLT-1), is a potent antagonist of VEGF. Therefore, we investigated whether transfection with the sFLT-1 gene could inhibit VEGF-induced angiogenesis. Human embryonic kidney (HEK)-293 cells were transfected with plasmids containing VEGF and sFLT-1 (pCMV-VEGF and pCMV-sFLT-1) by the calcium-phosphate co-precipitation method. VEGF- and/or sFLT-1-transfected HEK-293 cells were incubated for 24 h, and then conditioned medium was collected. The effects of conditioned medium on angiogenesis were tested by incorporation of [3H]thymidine into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Expression of VEGF protein was determined by Western blotting. The conditioned medium from sFLT-1 gene-transfected HEK-293 cells significantly inhibited recombinant VEGF-induced increase in [3H]thymidine incorporation by HUVECs. VEGF gene-transfected HEK-293 cells secreted VEGF protein into conditioned medium. This conditioned medium increased [3H]thymidine incorporation by HUVECs, which was significantly inhibited by co-transfection of sFLT-1 gene with VEGF gene. These observations suggested that sFLT-1 gene transfer could inhibit VEGF-induced DNA synthesis of vascular endothelial cells.     

The role of fractalkine in the recruitment of monocytes to the endothelium

Recombinant fractalkine possesses both chemoattractive and adhesive properties in vitro. Previous studies have demonstrated an upregulation of this molecule on the membranes of activated human endothelial cells and hypothesised that fractalkine plays a role in the recruitment and adherence of monocytes to the activated endothelium. Here we present data analysing both the adhesive and chemoattractive properties of this chemokine expressed by activated human umbilical vein endothelial cells. We demonstrate that both recombinant fractalkine and endogenously produced fractalkine function as adhesion molecules, tethering monocytes to the endothelium. However, our data demonstrate that although recombinant fractalkine has the potential to function as a potent monocyte chemoattractant, the endogenous fractalkine cleaved from activated human umbilical vein endothelial cells is not responsible for the observed chemotaxis in this model. Instead, we show that monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), secreted from the activated human umbilical vein endothelial cells, is responsible for the chemotaxis of these monocytes.