自鳕鱼皮中制备流感病毒神经氨酸酶抑制活性肽

目的自鳕鱼皮中制备流感病毒神经氨酸酶抑制活性肽。方法选用9种蛋白酶对鳕鱼皮胶原蛋白进行酶解,以神经氨酸酶抑制率为指标进行比较,选择最佳水解蛋白酶,用响应面法对酶解条件进行优化。结果与结论胃蛋白酶水解产物的抑制活性最高,且呈剂量依赖性,IC50值为8.86mg.mL-1。响应面分析确定最佳酶解条件为加酶量1600U.g-1,底物浓度22mg.mL-1,酶解时间6.8h。在此最佳条件下,胃蛋白酶水解产物IC50值为7.95mg.mL-1。抗H1N1流感病毒活性的细胞实验结果显示,10mg.mL-1的胃蛋白酶酶解物病毒抑制率可达66.6%。     

红非鲫(Oreochromis niloticus)鱼皮胶原蛋白酶解条件的研究

目的研究单酶和复合酶水解红非鲫鱼皮胶原蛋白制备具有抑制血管紧张素转换酶(ACE)生物活性的寡聚肽的工艺条件。方法根据6种单酶的水解产物对ACE抑制作用的测定结果,确定了两种酶即菠萝蛋白酶和alcalase 2.4L碱性蛋白酶组成复合水解酶。采用正交试验确定了这两种酶单独水解鱼皮胶原蛋白的最适酶解条件。结果与结论菠萝蛋白酶和alcalase 2.4L蛋白酶的最适酶解温度,pH,酶/底物,时间,底物浓度分别为45℃,pH4.5,4000U.g-1,4h,6%和55℃,pH7.5,6000U.g-1,2h,4%。在此基础上,进行复合酶水解实验,结果表明先采用菠萝蛋白酶水解,再用alcalase 2.4L蛋白酶水解,效果更佳。采用该双酶复合水解工艺,所得水解产物的水解度为30.43%,体外对ACE的抑制率达68.6%。     

不同水产原料中抑制流感病毒神经氨酸酶活性多肽的研究

目的选用不同种类的水产原料用胰蛋白酶酶解,制备出具有抑制神经氨酸酶(NA)活性的多肽。方法选用中国毛虾、鲢鱼、鳀鱼、鳕鱼皮4种原料采用胰蛋白酶酶解,通过体外检测抑制NA活性和MDCK细胞感染H1N1病毒实验,得到能够抑制NA活性的多肽,考察了酶的种类、酶解时间、加酶量、料液比对活性的影响。结果与结论筛选出中国毛虾为原料,通过单因素实验确定酶解时间为5.5h,加酶量为2000U/g,料液比为1∶7(质量浓度)是胰蛋白酶酶解中国毛虾的最优条件。测得IC50值为1.32mg/mL。MDCK细胞感染H1N1病毒实验显示,浓度为250ug/mL的中国毛虾多肽的抑制效果较为明显。通过氨基酸分析推测多肽中高含量极性氨基酸能提高NA抑制活性。     

海地瓜蛋白酶解物类蛋白反应修饰及其对ACE活性的影响

目的研究海地瓜酶解物类蛋白反应修饰及其对ACE活性的影响。方法采用复合酶酶解海地瓜体壁蛋白,得到具有降血压活性的酶解物,利用类蛋白反应进行修饰,考察酶的种类、底物浓度、温度、酶添加量对类蛋白反应的影响,得到不同修饰程度的产物,测定其ACE抑制活性。结果与结论经过类蛋白反应修饰后,显著提高了酶解液的ACE抑制活性。体系中游离氨基的减少量呈不规则变化,修饰产物的IC50值也呈不规则下降,其中反应1h和4h的修饰产物IC50值最低,分别是0.62mg.mL-1和0.75mg.mL-1。分析体系中游离氨基酸的组成,发现脯氨酸的结合能显著提高海地瓜体壁蛋白酶解物的ACE抑制活性。     

美洲大蠊抗肝纤维化活性提取物的酶解制备工艺研究

目的 优选中性蛋白酶酶解美洲大蠊脱脂膏制备抗肝纤维化活性提取物的工艺。方法 以美洲大蠊脱脂膏的水解度、活性提取物的得率和体外活性为评价指标,在单因素考察（酶用量、酶解时间、pH值、酶解温度、底物浓度）的基础上,采用L₉（3⁴）正交试验优化中性蛋白酶酶解制备抗肝纤维化活性提取物的工艺。结果 最佳酶解工艺为酶用量0.3%,酶解时间2 h,pH值8.5,酶解温度45℃,底物密度1.07 g·mL^-1。工艺验证试验结果表明,美洲大蠊脱脂膏的水解度为15.8%,活性提取物的得率从0.54%提高到0.72%,其24,48,72 h的IC₅₀值分别为（118.37±3.12）,（115.16±2.48）,（105.00±6.35）μg·mL^-1。结论 研究得到美洲大蠊抗肝纤维化活性提取物的酶解制备工艺,该工艺得率较高,简单可行,为美洲大蠊抗肝纤维化药物的研发奠定基础。     

酶解法制备可口革囊星虫抗菌物质的研究

目的 确定可口革囊星虫体壁中抗菌物质的最佳酶解工艺。方法 以可口革囊星虫体壁为原料，利用筛选出的木瓜蛋白酶酶解可口革囊星虫体壁蛋白，获得含可口革囊星虫体壁的酶解产物，并用抑菌圈法比较不同条件下酶解产物对大肠埃希菌活性的影响。在单因素试验的基础上，应用四因素三水平正交设计分析法，探讨酶解温度、pH值、酶解时间、加酶量及底物浓度对酶解产物抑菌活性的影响。结论 木瓜蛋白酶最适合水解可口革囊星虫体壁制备抗菌物质，其最佳工艺条件为：底物浓度为4g/L、加酶量为4000U/g、温度为55℃、pH值为8.0的条件下酶解4h，获得平均抑菌圈大小为(15.78±0.5)mm。     

星点设计-效应面法优化复合酶解酪蛋白制备抗凝血肽的工艺研究

目的 本文利用星点设计-效应面法优化复合酶解酪蛋白制备抗凝血肽的工艺条件,并测定其体外抗凝血活性与溶栓效果。方法 首先运用星点设计-效应面法来确定菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶和木瓜蛋白酶这四种酶各自酶解酪蛋白的最佳反应条件,然后在各酶的最佳反应条件下对酪蛋白进行复合酶解,制得酪蛋白复合酶解液,再运用凝血酶滴定改进法来测定其体外抗凝血活性,并用抗凝血活性最高的酪蛋白复合酶解液进行体外溶栓实验。结果 四种酶酶解酪蛋白的最佳反应条件分别如下:菠萝蛋白酶:pH为6.50、温度为60.00 ℃、酶用量为12 000.00 U/(g底物)、时间为3.00 h、料水比为1:7(m/V);胰蛋白酶和胰糜蛋白酶均为:pH为8.00、温度为50.00 ℃、酶用量为6 000.00 U/(g底物)、时间为3.00 h、料水比为1:7(m/V);木瓜蛋白酶:pH为6.50、温度为60.00 ℃、酶用量为4 000.00 U/(g底物)、时间为3.00 h、料水比为1:7(m/V)。结论 本实验条件下,加酶组合为“菠萝蛋白酶-胰蛋白酶-胰糜蛋白酶-木瓜蛋白酶”的复合酶解制备的酪蛋白酶解液具有最高的体外抗凝血活性,为100.0 ATU/mL;新西兰大白兔的血栓线用100.0ATU/mL的酶解液浸泡24 h后全部溶解,且兔血与100.0 ATU/mL酪蛋白酶解液的比例(V/V）为1:1和4:6的样品组放置48 h仍不凝固。     

酶法制备牡蛎抗氧化肽研究

目的优化牡蛎酶解制备抗氧化肽的工艺。方法通过正交试验法确定胃蛋白酶、胰蛋白酶及这两种蛋白酶的酶解液抗氧化(Fenton体系)的最佳工艺条件;采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱层析法对酶解液中抗氧化肽进行分离纯化。结果胃蛋白酶最佳酶解条件:温度35℃、加酶量2.5%、时间6h、pH 2.0,在此条件下清除率达到50%时的酶解液浓度(EC50)为1.929mg.mL-1;胰蛋白酶最佳酶解条件:温度45℃、加酶量2%、时间8h、pH 7.5,EC50为1.165mg.mL-1;胰蛋白酶、胃蛋白酶分步酶解法的酶解液EC50为0.869mg.mL-1。双酶酶解液经纯化后,得相对分子质量为751的抗氧化活性肽组分(BPO-Ⅱ),其EC50为0.529mg.mL-1。结论双酶酶解法优于单酶酶解法,从双酶酶解液中分离纯化得抗氧化肽BPO-Ⅱ。     

食源性ACE抑制肽体外活性检测方法的改进及应用

目的建立一种快速、准确地测定食源性ACE抑制肽体外活性的检测方法。方法通过在不同时间对ACE酶解液中马尿酸含量的测定,确定ACE酶与底物HHL的反应时间;以海参肽为ACE抑制剂,反应液中生成的马尿酸为检测指标,Zorbax SB-C_(18)分析柱为固定相,乙腈/超纯水为流动相,建立一种测定食源性ACE抑制肽体外活性的RP-HPLC法。结果ACE酶与底物HHL的反应时间确定为60min;RP-HPLC的洗脱条件为柱温25℃,流动相乙腈/超纯水的体积比为1:1(各含0.1%三氟乙酸),流速0.4 mL·min~(-1),检测波长228 nm。应用该方法对马尿酸浓度与峰面积的相关性进行分析,结果表明马尿酸浓度在0～200μg·mL~(-1)和200～800μg·mL~(-1)范围内与峰面积呈现良好的相关性;经卡托普利、牡蛎酶解液、鳀鱼酶解液验证,表明该方法不仅适用于食源性ACE抑制肽体外活性的测定,而且也适用于化学合成的降压药物。结论该方法操作简便、重复性好、准确性高,可作为食源性ACE抑制肽体外活性的检测方法。     

哇巴因多克隆抗体F(ab)_2片段的制备及其分子量测定

目的制备哇巴因多克隆抗体F(ab) 2 片段 ,并对其进行分子量的测定。方法免疫家兔制备哇巴因多克隆抗体 ,在适宜的条件下 ,用胃蛋白酶酶解哇巴因多克隆抗体 ,制备F(ab) 2 片段。酶解产物经HPSEC分析、纯化 ,ELISA法检测其免疫学活性。并在适宜的色谱条件下 ,分别测定三种标准蛋白的洗脱体积 ,绘制标准曲线 ,测定其分子量。结果 10 0mg哇巴因多克隆抗体在 2mg胃蛋白酶消化 18h ,反应体系pH 3 .0的条件下消化 ,制备出了活性的F(ab) 2 片段 ,其相对分子质量为 10 7kD。结论用胃蛋白酶消化哇巴因多克隆抗体 ,可制备出活性的F(ab) 2 片段 ,同时其相对分子质量的测定为其进一步研究提供了依据。     

扇贝边酶解物抗氧化作用研究

目的探讨不同蛋白酶酶解扇贝边所得酶解物对羟自由基(·OH)的清除效果及酶解物的体内抗氧化作用。方法通过胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合风味酶、枯草杆菌蛋白酶的扇贝边酶解物对·OH的清除活性筛选酶种,并优化其酶解条件。用酶解物灌胃小鼠,测定小鼠血液中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力和肝脏中的丙二醛(MDA)含量。结果枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解扇贝边所得酶解物具有较好的·OH清除效果,其清除率分别为84 .37%和79.93% ,这两种酶解物均可提高小鼠血液中GSH-PX活力和SOD活力,并降低小鼠肝脏中的MDA含量。结论扇贝边酶解物具有不同程度的体内抗氧化活性作用     

美洲大蠊抗肝纤维化活性部位酶解制备工艺的水解蛋白酶筛选

目的:优选美洲大蠊脱脂膏酶解工艺的最佳水解酶,以提高美洲大蠊中抗肝纤维化活性部位的提取得率和活性。方法:以美洲大蠊脱脂膏为对照,采用茚三酮法和福林酚法考察胰蛋白酶(TR)、胃蛋白酶(PE)、碱性蛋白酶(AL)、木瓜蛋白酶(PA)、中性蛋白酶(NE)对脱脂膏的水解度;采用大孔树脂分离纯化法,分别以50%、60%、70%、95%乙醇为洗脱溶剂,考察各酶解液不同溶剂洗脱部位的得率;借助大鼠肝星状细胞HSC-T6体外抑制试验,考察各酶解液洗脱部位的抗肝纤维化活性。结果:PA、NE对美洲大蠊脱脂膏的水解度分别为14.15%、15.70%,具有较强的酶解能力。PA、NE、AL酶解液的95%乙醇洗脱部位得率分别为(0.73±0.04)%、(0.65±0.01)%、(0.64±0.05)%,分别较不加酶的脱脂膏提高了30.36%、16.07%、14.29%。细胞体外抑制试验结果显示,各酶解液分离纯化所得的50%、60%、70%乙醇洗脱部位对HSC-T6细胞抑制率较低或呈现促增长现象;其95%乙醇洗脱部位对HSC-T6细胞的抑制率总体均在20%以上,其中PA、NE酶解液分离纯化所得的95%乙醇洗脱部位作用24～72 h时的半数抑制浓度(IC_(50))分别为94.5～112.3、117.1～120.0μg/mL,总体小于不加酶的脱脂膏的IC50(116.1～123.0μg/mL)。结论:综合水解度、纯化洗脱部位得率及对HSC-T6细胞的体外抑制活性3个指标,确定PA为美洲大蠊脱脂膏抗肝纤维化活性部位酶解工艺的最佳水解酶;NE、AL效果次之;PE、TR效果较差,不适于该酶解工艺。     

抑胃酶剂的药理作用

1970年日本Umezawa等人产先从S.tetaceus等放线菌的发酵液中发现胃蛋白酶的抑制剂——pepsatin,它是一种酸性蛋白酶的抑制剂,具有广泛的生理活性。福建省微生物研究所从链霉菌属分离到的一株新种的培养液中提出一种淡黄色粉末,经体外试验具有抑制胃蛋白酶活性,称抑胃酶剂。本文报道其体内的抗实验性胃溃疡、关节炎和对高血压蛋白原酶(PRA)活性的影响。     

哇巴因多克隆抗体F（ab）2片段的制备及其分子量测定

目的：制备哇巴因多克隆抗体F（ab)2片段,并对其进行分子量的测定。方法：免疫家兔制备哇巴因多克隆抗体,在适宜的条件下,用胃蛋白酶酶解哇巴因多克隆抗体,制备F（ab)2片段,酶解产物经HPSEC分析,纯化,ELISA法检测其免疫学活性,并在适宜的色谱条件下,分别测定三种标准蛋白的洗脱体积,绘制标准曲线,测定其分子量。结果100mg哇巴因多克隆抗体在2mg胃蛋白酶消化18h,反应体系pH3.0的条件下消化,制备出了活性的F（ab)2片段,其相对分子质量为107kD。结论：用胃蛋白酶消化喹巴因多克隆抗体,可制备出活性的F（ab)2片段,同时其相对分子质量的测定为其进一步研究提供了依据。     

ACE 2350 G/A基因多态性与高血压左心室肥厚的关系

目的:探讨血管紧张素转换酶(ACE)2350G/A基因多态性与原发性高血压及合并左心室肥厚(LVH)的关系。方法:利用聚合酶链反应(PCR)及限制性酶切技术对194例健康人(对照组)与246例原发性高血压病患者(高血压组)ACE2350G/A基因多态性进行检测;利用二维超声心动图对178例未治疗原发性高血压患者检测左心室质量(LVM),计算左心室质量指数(LVMI)。结果:高血压组与对照组的ACE2350G/A基因分型及等位基因的频率差别无统计学意义;但原发性高血压伴LVH组基因分型及等位基因的频率与非LVH组差别有统计学意义;左心室肥厚A等位基因的频率(58.09%)高于非左心室肥厚的频率(42.27%,P=0.0037)。结论:原发性高血压患者ACE2350A等位基因与左心室肥厚密切相关。     

蜈蚣粉酶解工艺最佳用酶的初步筛选

目的分别利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶对蜈蚣粉进行酶解并选取最佳用酶来制备抗肿瘤多肽。方法利用4种酶对蜈蚣粉进行酶解,采用MTT体外抗肿瘤实验方法,以蛋白质的水解度及酶解提取液对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率为指标,同时以蜈蚣粉的水溶性蛋白质含量为标准,评价4种酶对蜈蚣粉的酶解效果并筛选出最佳用酶。结果胃蛋白酶对蜈蚣粉的水解度为10.44%;胰蛋白酶对蜈蚣粉的水解度为28.29%,在0.125 mg·m L~(-1)及0.25 mg·m L~(-1)的较小浓度下对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率低于对照组,但随浓度的增大抑制率逐渐增大,在0.5~2 mg·m L~(-1)浓度时,胰蛋白酶在4种酶中达到最大抑瘤效果;胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的水解度分别为50.45%、44.16%,当浓度>0.5 mg·m L~(-1)时其对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率高于对照组,在浓度为0.5mg·m L~(-1)时抑制率分别为2.86%、36.37%,且随浓度增大抑制率增大。结论蜈蚣粉酶解工艺最佳用酶为胰蛋白酶,其次是胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶,而胃蛋白酶活性较低可以去除。     

响应面法优化紫贻贝免疫活性肽的制备工艺

目的 探讨紫贻贝免疫活性肽的酶解制备工艺。方法 本研究以紫贻贝(Mytilus edulis)为原料,选用五种不同的蛋白酶对其进行酶解,以小鼠RAW264.7巨噬细胞的相对增殖率为指标,在单因素试验基础上通过响应面法优化制备紫贻贝免疫活性肽(Mytilus edulis immunomodulatory peptides, MIP),同时采用CCK-8和中性红吞噬实验对其免疫活性进行初步研究。结果 实验数据表明,胰蛋白酶为最适蛋白酶,最佳酶解条件为：酶解温度43.7 ℃,pH 8.9,时间3.2 h,加酶量3000 U/g。在此条件下,100 μg/mL 的MIP对RAW264.7巨噬细胞的相对增殖率为92.4%。CCK-8结果显示,MIP对RAW264.7细胞无毒性作用且能显著促进细胞增殖。当MIP浓度为100 μg/mL时,中性红吞噬指数可提高至1.22。同时,形态学观察结果显示MIP可以刺激细胞分化形成伪足,细胞形态以不规则多边形为主。由此可知,MIP 对RAW264.7细胞具有较好的免疫调节活性。     

血管紧张素转换酶基因多态性与原发性高血压血栓前状态的关系

目的　探讨血管紧张素转换酶 (ACE)基因I/D多态性与原发性高血压 (EH)及高血压血栓前状态 (PTS)的关系。方法　PCR检测 6 1例原发性高血压病人和正常对照组 2 8例的ACE基因I/D多态性 ;发色底物法测t PA、PAI 1活性 ,酶联免疫吸附双抗夹心法 (ELISA)测vWF含量。结果　高血压组DD基因型频率显著高于对照组 (P <0 0 5 ) ,但D等位基因频率分布在高血压组和正常组之间差异无显著意义 (P >0 0 5 )。高血压组t PA活性降低 ,PAI 1活性、vWF含量升高 (P均 <0 0 0 1)。高血压组DD型t P活性明显低于ID、II型 (P <0 0 0 1) ,而ID、II型之间差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ,DD型PAI 1活性明显高于ID、II型(P <0 0 0 1) ,而ID、II型之间差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ,vWF在DD、ID、II型三者之间差异无显著意义 (P>0 0 5 )。结论　DD型是原发性高血压发病的危险因素。原发性高血压存在血栓前状态。t PA、PAI 1的变化与血管紧张素转换酶基因I/D多态性有关 ,DD基因型可引起血栓前状态。     

HIV-1整合酶3'端加工抑制剂筛选方法的建立与优化

目的建立与优化HIV-1整合酶3'端加工抑制剂筛选方法。方法利用荧光共振能量转移原理建立筛选方法,用DNaseⅠ切割底物DNA确定底物检测波长,在该检测波长下,对缓冲液成分、底物浓度、酶浓度、金属离子浓度等影响整合酶活性的条件进行优化,并用阳性药物雷特格韦和杨梅黄素进行方法验证。结果检测波长为495 nm/525 nm,使用缓冲液1、底物浓度500 nmol·L-1,整合酶浓度1μmol·L-1,镁离子浓度20 mmol·L-1时整合酶3'端加工活性最强。在此反应条件下雷特格韦和杨梅黄素能有效地抑制整合酶3'端加工活性。用所建立的方法筛选到2个有较强抑制整合酶3'端加工活性的抑制剂。结论该文成功建立并优化了HIV-1整合酶3'端加工抑制剂筛选方法。     

鹿骨保健食品原料的工艺研究

以鹿骨初酶解产物为研究对象,以水解度为特征性指标,采用甲醛滴定法检测酶解进程,分析对比不同酶解条件对样品水解度的影响,确定了碱性蛋白酶和胰蛋白酶分步水解为最佳酶解条件。结果：采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶分步水解的最佳,条件为酶底比1∶200和1∶240,料液比为1∶40,起始pH值为9.0,碱性蛋白酶45℃酶解1.5h后,加入胰蛋白酶37℃下酶解2h,水解度为21.37%。