建立稳定表达人有机阴离子转运体OAT1细胞的活性检测方法及抑制剂的筛选

摘 要 目的：建立稳定表达人有机阴离子转运体OAT1的细胞（hOAT1）中6-羧基荧光素浓度测定的荧光分析方法,并用于hOAT1细胞活性的测定及其抑制剂的筛选。方法：采用荧光分光光度法,检测波长为激发波长485 nm,发射波长520 nm,BCA法检测样品蛋白浓度。以6-羧基荧光素的荧光强度对蛋白浓度的比值作为衡量转运体OAT1活性的指标。结果：在hOAT1细胞中,6-羧基荧光素检测浓度的线性范围为0.08～3.2 μmol·L－1（r ＝ 0.999 1）,低、中、高浓度6-羧基荧光素溶液测定的日内RSD分别为6.08%、 2.66%、0.86%,日间RSD分别为7.83%、3.73%、0.72%,绝对回收率分别为（111.35 ± 9.8）%、（86.61 ± 3.89）%、（100.15 ± 1.10）%。抑制剂筛选结果显示 1 mmol·L－1缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦、辛伐他汀、瑞舒伐他汀对hOAT1抑制率分别为103.45%、110.34%、93.41%、90.33%、79.84%、95.22%。结论：本方法简单易行,可用于hOAT1细胞活性测定,缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦、辛伐他汀、瑞舒伐他汀对hOAT1存在抑制作用。     

薄层荧光扫描法测定心可舒片中葛根素的含量

用薄层荧光扫描法测定心可舒片中葛根素含量。以甲醇为溶剂,超声处理样品,氯仿－甲醇－醋酸乙酯－水（8．1：9：4：26：4）为展开剂,激发波长为320nm,进行单波长反射法线性扫描测定,平均加样回收率为98．93％,RSD为1．78％,RSD为1．78％（n＝5）。     

咪达唑仑与人血清白蛋白结合的荧光光谱研究

目的:研究咪达唑仑与人血清白蛋白(HSA)的结合作用。方法:分析咪达唑仑与HSA结合的荧光猝灭光谱和同步荧光光谱(激发波长和发射波长的间距(Δλ)分别为15nm和60nm);由Stern-Volmer方程确定咪达唑仑对HSA17℃和37℃时的荧光猝灭速率常数(Kq)及机制,Lineweaver-Burk双对数方程确定17℃和37℃时猝灭反应结合常数(KA)和结合位点数(n);根据反应前后的焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小判断咪达唑仑与HSA之间的主要作用力类型。结果:荧光猝灭光谱显示咪达唑仑与HSA有荧光猝灭作用,Δλ=15nm波长的同步荧光光谱显示咪达唑仑对酪氨酸残基发生作用,未对色氨酸残基发生作用;在17℃和37℃时的Kq分别为5.0246×1011和4.757×1011L·mol-1·s-1;17℃和37℃时猝灭反应KA和n分别为2.1717×104、8.7438×103mol·L-1,1.1895、1.0769个;反应前后的ΔH和ΔS均<0。结论:咪达唑仑对人血清白蛋白的猝灭过程为静态猝灭,咪达唑仑与HSA间的作用力主要为范德华力或者氢键作用力。     

秦皮素与人血清白蛋白相互作用研究

目的：采用荧光光谱法分析秦皮素与人血清白蛋白(HSA)的相互作用及分子结构特征。方法：应用荧光分光光度计,通过荧光淬灭分析、同步荧光分析、三维荧光分析、疏水探针分析,获得秦皮素与HSA相互作用的光谱学信息。结果：荧光淬灭分析结果显示,秦皮素通过结合HSA引起HSA荧光淬灭,荧光猝灭机制属于单一静态猝灭;计算得出的热力学参数熵变和焓变均为正值,表明疏水力是驱动秦皮素结合HSA的主要作用力。同步荧光分析表明,秦皮素对HSA分子中Trp残基微环境影响明显,可使其特征光谱峰发生蓝移,再次表明疏水力在秦皮素结合HSA中起到重要作用。三维荧光分析结果表明,秦皮素与HSA相互作用改变了HSA的空间结构、氨基酸残基的微环境以及荧光发射峰强度;疏水探针分析结果显示,疏水探针能够显著影响秦皮素与HSA的结合,进一步验证了疏水力是秦皮素结合HSA的主要作用力。结论：秦皮素能够与HSA相互作用结合,导致HSA分子结构及光谱特性发生改变。     

荧光素钠注射液的制备及质量控制

本文研究了荧光素钠静脉注射液的制备,并就注射液的荧光强度与浓度、酸度、荧光激发波长、某些离子间的关系进行了较深入的研究。结果表明:本制备工艺科学合理,产品质量好,注射液的荧光强度、荧光寿命、显影清晰度可与美国产品相媲美,而在国内具有领先水平,荧光素钠水溶液的浓度在1.4×10~(-5)～1.8×10~(-5)mol.L~(-1),PH值介于8～9之间受最大荧光激发波长(489nm)激发后,所产生的荧光强度最强,一些重金属离子强烈地影响着荧光强度。     

血清中脱甘氨酸米多君的液相色谱-荧光检测法测定

建立了血清中脱甘氨酸米多君的反相高效液相色谱－荧光检测法。血清样品经C2小柱固相萃取后，采用Diamonsil C18分析柱，甲醇－0．1％三氟醋酸溶液（28：72）为流动相，荧光激发波长为288nm，发射波长为328nm。以甲氧明为内标。脱甘氨酸米多君在0．5－32ng/ml范围内线性关系良好。方法的检测限为5pg，提取回收率大于86％，批内、批间精密度为1．2％－5．4％。     

高效液相色谱—荧光检测法测定贯叶连翘中金丝桃素的含量

目的：建立高效液相色谱－荧光检测法测定贯叶翘中金丝桃素的含量。方法：色谱柱为18柱（5μm,4．6mmx200mm),流动相为甲醇－pH6．5的磷酸盐缓冲液（55：45）,流速为1．0mL.min^-1,柱温为30℃,荧光检测波长λEX＝580nm,λEM＝600nm。结果：该方法的线性范围为2．55－102ng(r=0.9999)。平均加样回收率为101．1％,RSD为1．4％（n =5)。最低检测限为80pg。结论：本方法快速,简单,灵敏度极高。     

荧光分光光度法测定大山楂丸中黄酮类化合物的含量

设定荧光激发/发射波长为281/352 nm,激发和发射光狭缝宽度为5 nm,在300~500 nm波长范围内测定荧光光谱。对酸度、表面活性剂、温度、反应时间及铝离子浓度等影响因素进行考察,优化试验条件。结果：在盐酸酸性介质中、无表面活性剂、常温下、反应时间30 min、铝离子浓度为2×10-4mol/L时,体系的荧光强度最大且稳定。当槲皮素的浓度范围在0.2×10-5~1.5×10-5mol/L之间时,荧光强度（F）和槲皮素浓度（c）呈良好的线性关系;检测限为2.4×10-8mol/L。3批大山楂丸中总黄酮的平均含量分别为24.56、27.85、25.13 mg/g,与《中国药典》方法测定结果基本一致。结论：本方法操作简便、快速、准确,可用于测定大山楂丸中总黄酮的含量。     

高效液相荧光法测定人尿液中儿茶酚胺含量

目的：建立高效液相色谱－荧光检测（ HPLC－FD）法同时测定人尿液中儿茶酚胺（去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺）含量,用于嗜铬细胞瘤的诊断。方法自制活性氧化铝,在弱碱性Tris缓冲液条件下吸附尿液样本中儿茶酚胺,使用 ZORB-AX－SB （4．6 mm ×250 mm,5μm）色谱柱,以甲醇－20 mmol· L－1磷酸二氢钾溶液为流动相;流速：0．8 mL· min－1,柱温25℃;激发波长（EX）为286 nm,检测波长（EM）为318 nm。结果重酒石酸去甲肾上腺素、肾上腺素、盐酸多巴胺在1．56～1000μg· L－1浓度范围内线性关系良好（r＝0．9995、0．9997、0．9998）;日内及日间精密度RSD在0．31％～8．02％之间;高、中、低三个浓度的平均方法回收率在94．22％～108．69％之间。结论该方法准确,稳定性较好,线性范围广,为嗜铬细胞瘤的诊断及围手术期治疗提供依据。     

棉酚与人血清白蛋白相互作用及其分子模拟研究

摘 要 目的： 探讨棉酚与人血清白蛋白(HSA)的相互作用。方法: 采用荧光光谱方法研究在生理条件下,棉酚与人血清白蛋白（HSA）的相互作用,并采用分子对接软件模拟棉酚与人血清白蛋相互作用。结果:棉酚与HSA的结合常数为2.390 6×10⁵ L·mol^-1 (293K) 和3.576 8×10³ L·mol^-1（303K）, 具有一个结合位点,结合反应的主要作用力为氢键和范德华力,结合位置更接近于人血清白蛋白的酪氨酸残基,分子模拟分析也证实此结果。结论: 棉酚对人血清白蛋白的荧光猝灭机制属于静态荧光猝灭。     

四环素类药物与人血清蛋白的结合作用研究

目的:探讨四环素类药物(土霉素、美他环素、四环素、多西环素)与人血清蛋白(HSA)的相互作用。方法:利用紫外吸收光谱和荧光光谱研究不同温度下四环素类药物与HSA的结合常数和结合点数,计算焓变(ΔH)、熵变(ΔS);依据Frster非辐射能量转移理论,得到供体与受体间的临界距离R0。结果:热力学参数ΔH<0,ΔS>0;R0分别为土霉素1.82nm,美他环素2.31nm,四环素2.98nm,多西环素2.26nm。结论:四环素类药物都能使HSA的荧光发生猝灭,其猝灭机制为静态猝灭;二者之间的主要作用力为静电引力。     

光谱法研究野漆树苷与人血清蛋白的结合作用

目的研究野漆树苷与人血清蛋白(HSA)的结合作用及机制。方法通过光谱法研究野漆树苷与HSA的作用机制。以能量传递原理及Lineweaver-Burk双倒数方程计算野漆树苷与HSA反应的结合常数和结合距离;以热力学参数判断其与HSA间的作用力类型;以同步荧光光谱考察野漆树苷对HSA构象的影响。结果野漆树苷与HSA反应的结合常数随温度的升高而降低;野漆树苷与HSA之间的结合距离为4.16 nm;野漆树苷与HSA的互相作用以氢键和范德华力结合为主;酪氨酸残基和色氨酸残基的特征荧光光谱峰随野漆树苷浓度的增加而产生猝灭。结论野漆树苷能与HSA结合,其荧光猝灭以静态猝灭为主。     

Binding studies of phloridzin with human serum albumin and its effect on the conformation of protein

In this study, the binding mode of phloridzin with human serum albumin (HSA) was established under physiological condition. The binding study is important to understand the pharmacokinetics and toxicity of phloridzin. The results proved the mechanism of fluorescence quenching of HSA by phloridzin was due to the formation of HSA-phloridzin complex. The binding constants, the number of binding sites and thermodynamic parameters were calculated. In addition, the alterations of HSA secondary structure in the presence of phloridzin were confirmed by the evidences from Fourier transform infrared (FT-IR), UV-visible absorption, circular dichroism (CD), synchronous and three-dimensional fluorescence spectroscopy. Alterations of protein conformation were observed with reduction of α-helix from 54% (free HSA) to 50% in the HSA-phloridzin complexes, indicating a partial protein unfolding. The distance between phloridzin and HSA was 3.74 nm according to fluorescence resonance energy transfer theory. In addition, the effects of common ions on the constants of HSA-phloridzin complex were also discussed.     

表柔比星与人血白蛋白的相互作用特点

目的研究表柔比星与人血清白蛋白的相互作用特点。方法用荧光猝灭光谱及同步荧光光谱技术测定在不同温度下表柔比星对人血清白蛋白荧光的猝灭规律。结果表柔比星对人血清白蛋白荧光呈规律性猝灭,17℃时的n为1.113,K为5.87×10~4,37℃时的n为1.128,K为6.85×10~4。表柔比星使白蛋白的同步光谱中最大发射峰红移。结论表柔比星与人血清白蛋白只有1个结合位点,表现为疏水作用,两者结合使白蛋白的极性略有增加。     

阿柔比星与人血白蛋白相互作用的特点

目的研究阿柔比星与人血清白蛋白的相互作用特点。方法用荧光猝灭光谱及同步荧光光谱技术测定在不同温度下阿柔比星对人血清白蛋白荧光的猝灭规律。结果阿柔比星对人血清白蛋白荧光呈规律性猝灭,17℃时的n为1.11,K为6.21×104,37℃时的n为1.12,K为6.41×104。阿柔比星使白蛋白的同步光谱中最大发射峰红移。结论阿柔比星与人血清白蛋白只有一个结合位点,表现为疏水作用,两者结合使白蛋白的极性略有增加。     

荧光光谱法研究Ca2+存在下左氧氟沙星与人血清白蛋白的结合作用

目的：研究左氧氟沙星对人血清白蛋白以及在ca^2＋存在下左氧氟沙星与人血清白蛋白的结合作用。方法：通过荧光光谱法分析了左氧氟沙星对人血清白蛋白以及ca^2＋存在条件下左氧氟沙星对人血清白蛋白荧光淬灭光谱、同步荧光光谱,根据热力学方程讨论两者间主要的作用力类型。结果：在生理条件（pH=7．4,37℃）下,根据Stem—Volmer方程和荧光淬灭双倒数图,确定了左氧氟沙星对人血清白蛋白淬灭类型为静态淬灭,左氧氟沙星对人血清白蛋白的结合常数K=1．46×10^5L·mol^-1,结合位点n=1．1,根据热力学方法确定作用力类型为疏水作用力;在ca^2＋存在条件下,淬灭类型和作用力类型不变,结合常数K=2．38×10^4L·mol^-1,结合位点n：1．02。结论：在ca^2＋存在条件下,左氧氟沙星对人血清白蛋白的荧光淬灭减弱,结合常数和结合位点均变小。为研究左氧氟沙星的生物学效应,以及左氧氟沙星和Ca^2＋对蛋白质构象的影响等提供了重要信息。     

Phagocytosis of Nanoparticles by Human Immunodeficiency Virus (HlV)-Infected Macrophages: A Possibility for Antiviral Drug Targeting

Human monocytes/macrophages (MO/MAC) were isolated from peripheral blood and cultivated on hydrophobic Teflon membranes. This culture system is suitable for HIV infection of MO/MAC in vitro. After transfer into 24-well plates the mature macrophages (infected or uninfected) were used for measurements of phagocytosis. The uptake of different, radioactively labeled nanoparticles (NP) made of polyalkylcyanoacrylate, polymethylmethacrylate (PMMA), and human serum albumin (HSA) by the macrophages was determined. In addition, the influence on phagocytosis of size and composition, concentration, and surface of the NP was studied. Further, macrophages of different state of activation were tested. NP made of polyhexylcyanoacrylate (PHCA) or human serum albumin with a diameter of about 200 nm were found most useful for targeting antiviral substances such as azidotymidine to macrophages. Cells infected in vitro with HIV-1_D117/III, a monocytotropic HIV isolate from a perinatally infected child, possessed an even higher phago-cytotic activity than noninfected cells. Macrophages isolated from HIV-infected patients also showed good incorporation of NP. Thus, the concept of a specific targeting of antiviral substances to macrophages in HIV-infected individuals appears quite promising.     

荧光光谱法研究顺铂对表柔比星与人血白蛋白结合作用的影响

目的研究顺铂对表柔比星与人血清白蛋白(HSA)结合作用的影响。方法通过荧光光谱法研究顺铂和表柔比星对HSA的荧光猝灭光谱,同步荧光光谱。由Lineweaver-Burk双倒数作图法确定反应的解离常数,根据热力学方程讨论两者间主要的作用力类型。结果荧光猝灭光谱显示,顺铂和表柔比星与HSA都有荧光猝灭作用。顺铂、表柔比星对HSA的猝灭过程为静态猝灭。表柔比星与HSA的结合点数为1,主要作用力为疏水作用力。顺铂不影响表柔比星对HSA的内源荧光猝灭作用,但能增加表柔比星与HSA的结合常数(KA)。结论顺铂不影响表柔比星的血药浓度,但能增加表柔比星与HSA的结合力。     

顺铂对阿霉素与人血清白蛋白结合的相互作用光谱研究

目的 研究顺铂对阿霉素与人血清白蛋白结合的相互作用。方法 采用荧光光谱法研究不同浓度顺铂对阿霉素与人血清白蛋白结合的相互作用。结果 顺铂与阿霉素对人血清白蛋白都有猝灭作用。顺铂对白蛋白的猝灭方式为动态猝灭,而阿霉素对白蛋白的猝灭方式为静态猝灭。结论 温度为17℃和37℃时,阿霉素与白蛋白的结合常数分别为2.13×104,2.76×10^4 L.mol l,2者的结合位点数为1。当加入不同浓度的顺铂后,阿霉素与白蛋白的结合常数有所变化,而结合位点数仍然为1。