抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建及瞬时表达

目的构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体。方法采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株（克隆号：2F5）中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列。分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构建含有重组基因的pIRES表达质粒pIRES/h2F5。转染293T细胞并用抗性药物G418选择培养。采用流式细胞术,检测瞬时转染细胞后嵌合抗体的表达情况。结果抗人CD28鼠人嵌合抗体得到表达并能与CD28分子特异性结合。结论抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建和瞬时表达是成功的,为后续构建稳定分泌抗人CD28鼠-人嵌合抗体的CHO基因转染细胞株奠定了基础。     

嵌合跨膜型人CD55基因的重组逆病毒表达质粒的构建

目的 构建嵌合跨模型CD55基因的重组逆病毒表达质粒。方法 采用PCR技术扩增编码CD155信号肽及成熟蛋白胞外区（-34-304aa)的DNA片段，双侧引入EcoRI、SspI位点，与编码CD46分子的跨膜区及膜内区（270～350aa)的DNA片段的5′未端自身的Stu I位点连接，构建嵌合跨模型CD55 DNA片段，序列测定后将此嵌合CD55片段与pLXSN逆病毒载体连接构建重组表达质粒，酶切鉴定插入片段的方向。结果 DNA序列测定证实所构建的嵌合跨膜型CD5 DNA阅读框完整、连接部位序列正确；Hind Ⅲ酶切鉴定得到了正向插入的CD55TM-pLXSN重组表达质粒。结论 我们成功构建了嵌合跨膜型CD55 DNA片段及含此片段的重组逆病毒表达载体CD55TM-pLXSN，为进一步在真核细胞中表达嵌合分子，比较研究GPI锚固型CD55分子与细胞活化信号转导的关系建立良好对照并为应用跨膜型的CD55分子对PNH进行基因治疗奠定了分子生物学基础。     

CD133+与CD133-人原代胃癌细胞的差异表达基因及核心基因的筛选

目的 通过生物信息学方法筛选出CD133+与CD133-人原代胃癌细胞的差异表达基因(DEGs),寻找可能参与胃癌发生的关键基因.方法 根据人CD133+和CD133-人原代胃癌细胞的转录组数据,以|log2FC|≥1,P<0.05为标准筛选DEGs;用Metascape对DEGs进行基因本体论(GO)富集及京都基因和...     

人源化抗CD3单链抗体在大肠杆菌中的GST融合表达

目的 为构建新一代的小分子、高效的基因重组抗CD3/抗胶质瘤双特异性抗体提供一个合适的构件。方法 从质粒pZZ3中克隆出人源化抗CD3抗体的VH、HL基因后,构建人源化抗CD3单链抗体基因,将其克隆入表达载体pGEX-5X1中后转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达。结果 SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量为55kd,与其理论推算值相符。表达形式均以包涵体为主,表达量占菌体总蛋白的30%左右。Western blot证实,诱导后菌体总蛋白在55kd处出现特异性显色印迹。结论 人源化抗CD3单链抗体可以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,为构建人源化双特异性抗体奠定了基础。     

人源化抗CD3单链抗体在大肠杆菌中的GST融合表达

目的为构建新一代的小分子、高效的基因重组抗CD3/抗胶质瘤双特异性抗体提供一个合适的构件.方法从质粒pZZ3中克隆出人源化抗CD3抗体的VH、VL基因后,构建人源化抗CD3单链抗体基因,将其克隆入表达载体pGEX-5Xl中后转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达.结果SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量为55kd,与其理论推算值相符.表达形式均以包涵体为主,表达量占菌体总蛋白的30%左右.Westem blot证实,诱导后菌体总蛋白在55kd处出现特异性显色印迹.结论人源化抗CD3单链抗体可以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,为构建人源化双特异性抗体奠定了基础.     

人CD48基因转染细胞株的构建

目的克隆人CD48基因,构建稳定表达CD48分子的基因转染细胞株。方法提取人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR克隆获得人CD48基因,将人CD48基因重组入逆转录病毒载体pEGZ-term,通过293T细胞的包装获得具有感染力的完整重组病毒载体,进而感染L929细胞,构建稳定表达人CD48分子的基因转染细胞株。结果成功克隆人CD48基因和构建PGEZ/CD48逆转录病毒表达载体,进而成功获得稳定表达人CD48的基因转染细胞株L/CD48。结论成功克隆了人CD48基因及其逆转录表达载体,并构建了稳定表达CD48分子的基因转染细胞株,为探讨CD48生物学功能的研究奠定了物质基础。     

外周血细胞膜上CD55和CD59缺陷对鉴别诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿与贫血的意义

目的 探讨患者外周血细胞膜上CD55和CD59缺陷对鉴别诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿(parosysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)与贫血(anemia)的意义.方法 采用荧光素标记的CD55和CD59单克隆抗体,流式细胞术检测30例正常人、32例再生障碍性贫血(AA)、28例阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)或AA-PNH综合征、38例小细胞低色素性贫血(IDA)、24例巨幼细胞性贫血(MA)、12例自身免疫溶血性贫血(AIHA)患者外周血中红细胞及中性粒细胞CD55-和CD59-的百分率.结果 CD55-、CD59-正常人红细胞和中性粒细胞的百分率均＜5%;PNH或AA-PNH患者均＞20%;部分再障患者＞5%(均＜15%).约有40%的小细胞低色素贫血患者CD55-、CD59-红细胞＞5%(均＜20%);但中性粒细胞CD55-、CD59-百分率均＜5%.巨幼贫、自身免疫溶血性盆血患者的CD55-、CD59-红细胞和中性粒细胞均＜5%.结论 利用流式细胞术同时检测患者外周血中红细胞和中性粒细胞膜上CD55和CD59缺陷是临床鉴别诊断PNH、AA-PNH及再障、小细胞低色素性贫血、巨幼贫及自身免疫溶血性贫血可靠,较敏感的方法.     

人CD200基因克隆及pcDNA3-CD200表达质粒的构建

目的：克隆人CD200基因并构建pcDNA3-CD200表达质粒。 方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法,从用200 μg Con A刺激62 h后的正常人外周血白细胞中扩增出CD200基因,与pMD18T载体连接后,做全自动DNA测序,并用亚克隆的方法构建pcDNA3-CD200表达质粒。 结果：从正常人外周血白细胞扩增的人CD200基因与GenBank中人CD200序列（NM -005944）完全相同。 结论：成功地克隆人CD200基因并构建了pcDNA3-CD200表达质粒。     

人CD244基因转染细胞株的构建

目的构建稳定表达人CD244分子转基因细胞株。方法通过RT-PCR克隆人CD244基因,将人CD244基因重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term。将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD244和辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的基因转染细胞。结果成功克隆人CD244基因,并稳定表达人CD244的基因转染细胞株L929/CD244。结论本研究成功构建了稳定表达人CD244的基因转染细胞株,为研究CD244生物学功能奠定了基础。