二甲双胍激活AMPK促进顺铂对肝癌细胞凋亡的初步研究

目的 探讨二甲双胍与顺铂合用对肝癌细胞的作用,为进一步的体内研究奠定基础.方法 MTT法检测不同浓度、不同时间二甲双胍、顺铂单用及两者合用于SMMC7721、HepG2肝癌细胞所致细胞增殖及凋亡;Hoechst33258检测二甲双胍、顺铂单用及合用对HepG2细胞核形态变化的影响.Western blot检测细胞内AMPK/p-AMPK的表达.结果 二甲双胍、顺铂单用及合用于SMMC7721、HepG2,随着作用时间及浓度增加抑制率增加,呈时间-浓度依赖性;Hoechst33258结果显示合用组细胞凋亡最严重;Western blot结果显示二甲双胍、顺铂单用及合用均激活AMPK,联合用药组p-AMPK上调最明显.结论 二甲双胍联合低浓度顺铂可激活AMPK,增加其对SMMC7721、HepG2癌细胞的毒性.     

腺病毒重组人白细胞介素24对肾癌细胞株786-O 细胞生长和凋亡的影响

目的探讨腺病毒重组人白细胞介素24(IL-24)对肾癌细胞株786-O细胞的生长和凋亡的影响。方法将培养的肾癌细胞株786-O细胞随机分为空白对照组、阴性对照组(转染腺病毒重组人IL-24对照组)及实验组(转染腺病毒重组人IL-24组)。取对数生长期肾癌细胞株786-O,构建腺病毒重组人IL-24及对照并转染至肾癌细胞株786-O实验组细胞及阴性对照组细胞。使用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测肾癌细胞株786-O生长能力;采用流式细胞术检测肾癌细胞株786-O凋亡情况;应用Western Blot检测肾癌细胞株786-O中MMP-9蛋白的表达水平。结果实验组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞表面磷脂酰丝氨酸表达水平高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞中MMP-9蛋白表达水平低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力、细胞膜表面磷脂酰丝氨酸表达水平、MMP-9蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论转染腺病毒重组人IL-24可抑制肾癌细胞株786-O细胞的生长并诱导细胞凋亡,腺病毒重组人IL-24可能通过下调MMP-9诱导肾癌细胞株786-O细胞的凋亡。     

姜黄素对肾癌786-O细胞增殖及凋亡的实验研究

目的观察姜黄素对肾癌786-O细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP蛋白)表达水平以及细胞凋亡的影响,研究姜黄素对肾癌细胞的生长抑制作用并探讨其分子机制,进一步揭示姜黄素对肾癌的治疗作用。方法不同浓度姜黄素作用人肾癌786-O细胞24、48、72 h后,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测姜黄素对人肾癌786-O细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测姜黄素诱导细胞的凋亡率;免疫细胞化学检测姜黄素对786-O细胞HIF-1α和XIAP表达的影响。结果姜黄素对人肾癌786-O细胞有明显的抑制作用,可引起细胞凋亡,并且存在剂量和时间依赖;不同浓度姜黄素作用细胞48 h后,HIF-1α和XIAP蛋白表达量下降。结论姜黄素通过下调HIF-1α和XIAP的表达抑制人肾癌786-O细胞的增殖,诱导人肾癌786-O细胞的凋亡。     

Livin反义寡核苷酸诱导人肾癌细胞凋亡及其机制的研究

目的 探讨Livin反义寡核苷酸(ASODN)对人肾癌细胞株786.O Livin mRNA及蛋白表达的抑制作用以及对细胞凋亡的影响.方法 设计合成全硫代磷酸化修饰的Livin ASODN,脂质体辅助转染至786-O细胞内.采用RT-PCR检测转染后Livin mRNA的变化,细胞免疫化学、激光扫描共聚焦显微镜观察Livin蛋白在细胞内的分布、转染后表达的变化及细胞形态的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,激酶法测定Caspase3活性的变化.结果 转染Livin ASODN后,RT-PCR显示786-O细胞表达Livin mRNA减少(P＜0.01),激光扫描共聚焦显微镜下见细胞表达Livin蛋白减少、细胞形态发生变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率显著增加(P＜0.01),Caspase3活性明显增加(P＜0.01).结论 Livin ASODN能明显下调786-O细胞Livin基因的表达,诱导细胞凋亡.抑制Caspase3活性是Livin抑制细胞凋亡的途径之一.     

二甲双胍通过抑制MAPK信号通路增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性

目的:探讨二甲双胍是否可以提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性及相关的作用机制。方法:BRDU ELISA方法检测顺铂联合或者不联合二甲双胍对SKOV3细胞增殖的影响;二甲双胍联合或者不联合MAPK信号通路阻断剂后BRDU ELISA方法检测细胞增殖的变化。Western blotting检测二甲双胍作用下卵巢癌细胞系SKOV3的磷酸化AMPK/总AMPK水平和磷酸化p38 MAPK/总MAPK水平的变化。结果:(1)二甲双胍不仅能抑制卵巢癌细胞系SKOV3细胞的增殖,而且能提高对顺铂的敏感性,并且这种作用是依赖于AMPK激活的;(2)p38 MAPK阻断剂SB203580能够抑制SKOV3的增殖,二甲双胍能够增强这种抑制作用。结论:二甲双胍可增强顺铂对卵巢癌细胞的抑制作用,并且二甲双胍可能通过激活AMPK信号通路进而抑制MAPK信号通路增加顺铂对卵巢癌细胞的抑制增殖作用。     

Osimertinib联合二甲双胍对非小细胞肺癌PC 9/GR细胞的协同效应

目的 研究Osimertinib联合二甲双胍对吉非替尼获得性耐药的非小细胞肺癌PC 9/GR细胞的生长抑制效应及其可能机制.方法 Osimertinib和二甲双胍单药或联合作用于PC 9/GR细胞后,应用MTT法检测不同药物处理组处理后对PC 9/GR细胞的抑制率影响;荧光染色法观察和流式细胞术检测Osimertinib和二甲双胍单药或联合诱导细胞凋亡的变化;Western blot法检测各药物处理组细胞磷酸化及非磷酸化的AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)和70 ku核糖体蛋白S6激酶(P70S6K)蛋白的表达水平.结果 Osimertinib和二甲双胍双药联合作用可显著抑制PC 9/GR细胞的增殖,作用强于各单药(P<0.05),表现为协同作用(联合指数<1);双药联合时相较于单药表现出更强的诱导细胞凋亡的作用;二甲双胍可上调细胞内p-AMPK蛋白的表达,Osimertinib和二甲双胍均可下调p-P70S6K蛋白,且双药联合较单药下调p-P70S6K蛋白水平更为显著.结论 Osimertinib和二甲双胍联合用药对PC 9/GR细胞的增殖有显著抑制作用并可以促进其凋亡的发生,具有协同作用.     

高浓度二甲双胍通过JNK通路抑制MIN6细胞增殖和迁移

目的本研究从细胞生物学角度检测二甲双胍对小鼠胰岛瘤MIN6的影响,并探讨此过程中包含的分子生物学机制。方法 MTT法检测不同浓度二甲双胍(1、2、5、10、20 mmol/L)对MIN6细胞活力的影响,细胞划痕实验检测二甲双胍对MIN6细胞迁移的影响,免疫印记实验检测此过程中细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase3表达的变化,及AMPK和JNK信号通路蛋白磷酸化水平的变化。结果二甲双胍浓度大于10 mmol/L时可以抑制MIN6细胞的活力(P<0.01),降低其迁移能力(P<0.01),高浓度二甲双胍可以上调细胞内凋亡蛋白Bax(P<0.05)和p-AMPK的表达(P<0.05),降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,增加caspase3剪切体(P<0.05)。同时,二甲双胍可以降低MIN6细胞内JNK信号通路的磷酸化水平(P<0.05)。结论高浓度二甲双胍可以抑制MIN6细胞的增殖和迁移,其作用可能与降低了JNK信号的通路活化有关。     

蛇葡萄素对肾癌786-O细胞增殖和凋亡的作用

目的 探讨蛇葡萄素(AMP)对人肾癌786-O细胞株增殖与凋亡的作用.方法 将不同浓度的AMP作用于体外培养的肾癌786-O细胞株,采用MTT法检测不同浓度的AMP对肾癌786-O细胞增殖的作用的影响;采用Annexin V/PI双染法检测不同浓度的AMP对肾癌786-O细胞凋亡的作用.结果 MTT结果显示AMP能显著抑制肾癌786-O细胞增殖,半数抑制浓度(IC50)为17.23 μg/mL;经不同浓度的AMP作用7h后,肾癌786-O细胞凋亡率明显增加,AMP浓度为10 μg/mL和20 μg/mL作用于肾癌786-O细胞后,细胞凋亡率升高(P＜0.05);而AMP浓度为40μg/mL和80 μg/mL作用细胞后,细胞凋亡率显著升高(P＜0.01).结论 AMP在体外能显著抑制肾癌786-O细胞增殖,且能促进肾癌786-O细胞凋亡.     

siRNA干扰BIRC6对肾癌786-O细胞凋亡和自噬的影响

目的 研究杆状病毒IAP重复序列蛋白6（BIRC6）在肾癌组织中的表达,并探讨BIRC6沉默对786-O细胞凋亡和自噬的影响。方法 收集2016年2月~2018年12月梅州市人民医院肾癌手术切除标本20例,通过免疫组化检测BIRC6蛋白在肾癌组织中的表达水平。将肾癌786-O细胞分为两组,对照siRNA组和BIRC6 siRNA组;通过lipofectamine 2000将BIRC6小干扰RNA（BIRC6-siRNA）及其对照siRNA（con-siRNA）转染到肾癌786-O细胞,Western blot检测转染后BIRC6蛋白表达水平,CCK8和流式细胞术分别检测BIRC6-siRNA和5-FU人肾癌786-O细胞活力和凋亡的影响,Western blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin和LC3A/B的表达水平。结果 免疫组化结果显示BIRC6蛋白在肾癌组织中的表达显着高于正常肾组织,转染BIRC6-siRNA后786-O细胞的BIRC6蛋白表达水平显著降低。12.5、25、50、100和200 μg/mL的5-FU诱导786-O细胞后,BIRC6-siRNA组细胞增殖抑制率显著高于con-siRNA组,差异具有统计学意义（P<0.01）;流式检测结果显示,BIRC6-siRNA组肾癌786-O细胞凋亡率显著高于con-siRNA组,差异具有统计学意义（P<0.01）;BIRC6-siRNA组肾癌786-O细胞Beclin和LC3A/B蛋白表达显著低于con-siRNA组。结论 siRNA干扰BIRC6能够抑制肾癌786-O细胞自噬,促进5-FU诱导的细胞凋亡,促进肾癌786-O细胞对5-FU的敏感性。     

AMPK对高糖环境下人牙周膜细胞中RANKL表达的调节作用

目的：高糖可在一定程度上影响牙周膜细胞的生物学功能。本研究皆在探讨高糖对人牙周膜细胞中RANKL表达的影响及该影响是否可被AMPK活化所调节 方法：Real-time PCR和Western blot方法检测细胞中RANKL和 OPG表达,并通过检测AMPK活化特异性底物SAMS及Westernblot检测AMPK磷酸化,观察细胞中AMPK活性变化。此外,通过通过Real-time PCR和Western blot方法检测AMPK活化对牙周膜细胞中RANKL表达的影响 结果：高糖作用下人牙周膜细胞中RANKL mRNA和蛋白表达增高,且AMPK活性明显下降;Compound C可通过抑制AMPK活性上调RANKL表达,而二甲双胍可通过激活AMPK下调RANKL表达;另外,我们还发现二甲双胍可通过激活AMPK显著减少高糖环境下牙周膜细胞中RANKL表达 结论：结果提示高糖作用下牙周膜细胞中RANKL表达升高与AMPK的磷酸化及活性受到抑制有关,且AMPK活化可参与调节牙周膜细胞中RANKL表达     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖?迁移和凋亡的影响?【方法】 构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株?实验分5组:CLU-RNAi-LV1(KD1)?CLU-RNAi-LV2(KD2)?CLU-RNAi-LV3(KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组)?应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化?用细胞划痕实验?MST-1?流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖?迁移?凋亡等生物学行为的改变?【结果】 成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒?Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1?KD2?KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4%~96.5%和0?Western blot结果显示KD1?KD2?KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24%?46.26%和58.91%,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达?划痕实验显示24 h时 KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43 ± 25.92)小于NC组(101.35 ± 6.05)和CON组(68.13 ± 6.64,P < 0.05)?WST-1法检测转染后72 h KD3(si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P < 0.05),各组间差异(P < 0.05),均有统计学意义?流式细胞仪检测KD3(si-CLU)组与NC组?CON组细胞凋亡率分别为(6.23 ± 2.51)%?(1.05 ± 0.30)%和(1.17 ± 0.29)%,KD3(si-CLU)组与NC组?CON组相比凋亡率增加(P < 0.05),差异有统计学意义?肾癌786-O细胞的增殖?迁移受到抑制,而凋亡率增加?【结论】 筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株?CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖?迁移并促进细胞凋亡?     

BTG1在HK-2和786-O细胞株中的表达及其对细胞周期和细胞凋亡的影响

目的：探讨B细胞易位基因1（ BTG1）在人肾小管上皮细胞株（ HK-2）和肾透明细胞腺癌细胞株（786-O）中的表达及BTG1基因对HK-2和786-O细胞周期、细胞凋亡的影响。方法：采用Western blotting方法检测BTG1蛋白在HK-2、786-O细胞株中的表达,构建BTG1表达质粒转染786-O细胞,合成BTG1干扰RNA转染HK-2细胞,通过流式细胞仪（ FACS）观察BTG1对HK-2、786-O细胞周期和细胞凋亡的影响。结果：Western blotting检测显示,BTG1蛋白在HK-2中的表达高于786-O。786-O中高表达BTG1蛋白能够促进其凋亡,增加其G0/G1期比率;HK-2中低表达BTG1蛋白能够抑制其凋亡,减少其G0/G1期比率。结论：BTG1可能通过对细胞凋亡及细胞周期的调控抑制肾细胞癌的生长。     

PDE5基因沉默对肾透明细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨PDE5基因对肾透明细胞癌细胞株786-O细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计、合成PDE5 siRNA序列,按照HiPerFect转染试剂盒操作手册转染786-O细胞.采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)和Western blot法检测转染后PDE5 基因的表达,通过WST-1法检测细胞增殖情况,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性.结果 与空白对照组和阴性对照组相比较,PDE5 siRNA转染组的mRNA及蛋白表达水平显著降低,786-O细胞增殖能力明显受到抑制,caspase-3活性明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论 siRNA干扰PDE5基因表达可抑制肾透明细胞癌细胞株786-O细胞的增殖并促进凋亡.     

BTG1在肾透明细胞癌组织中的表达及对786-O细胞株增殖和凋亡的影响

目的:探讨B细胞易位基因1(BTG1)在肾透明细胞癌组织中的表达及对肾透明细胞癌细胞株786-O增殖和凋亡的影响.方法:采用免疫组化法检测20例肾透明细胞癌及其癌旁组织中BTG1蛋白的表达.构建BTG1表达质粒及合成BTG1的干扰RNA分别转染786-O细胞,通过MTT法实验观察BTG1对786-O细胞体外增殖的影响,...     

反义硫代寡核苷酸对786-O细胞survivin基因的表达及生长抑制作用

目的研究survivin反义寡核苷酸对肾透明细胞癌786O细胞表达survivin蛋白、细胞凋亡、增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向survivin的反义寡核苷酸(ASODN)。肾透明细胞癌细胞株786O分为6组:空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、200、400和600nmol/LASODN转染组。作用24h后收获各组细胞。倒置显微镜及透射电子显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测各组细胞survivin表达情况和流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数,MTT法检测survivin反义寡核苷酸对各组细胞的生长抑制率。结果电镜下可以见到典型凋亡样改变,而各对照组细胞生长良好;各ASODN转染组细胞survivin表达有不同程度减弱;各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05),以600nmol/LASODN转染组最为明显(P<0.05),而各对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论不同浓度survivinASODN转染后能下调survivin蛋白表达,诱导肾透明细胞癌786O细胞凋亡,抑制786O细胞增殖。     

白细胞介素4诱导蛋白1促进肾癌进展的实验研究

目的:探讨白细胞介素4诱导蛋白1（IL4I1）在肾透明细胞癌中的表达及在肿瘤发展中的作用。方法:通过数据库分析IL4I1在正常肾组织和肾透明细胞癌组织中的表达及与预后的关系；通过qPCR和FCM比较正常肾细胞HK-2与肾癌细胞系786-O和769-P中IL4I1的表达情况；siRNA干扰786-O细胞系IL4I1表达后通过CFSE增殖实验及细胞划痕实验探究细胞生物学行为的改变；通过GSEA分析和qPCR探究潜在机制。结果:IL4I1在肾透明细胞癌组织中过表达（P＜0.001），提示更短的总生存期（P＜0.001）。IL4I1在肾癌细胞系786-O中mRNA及蛋白水平均过表达（t=16.83、280.40，均P＜0.001）。干扰IL4I1表达后，786-O细胞增殖速度减慢，迁移能力下降（F=97.45，P＜0.001），并伴随细胞间黏附分子-1（ICAM1）、血管内皮生长因子A （VEGFa）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、程序性细胞死亡蛋白-1（PD-L1）表达水平降低（t=9.031、8.613、9.066、12.66，均P＜0.05）。GSEA分析显示，在IL4I1高表达的肾透明细胞癌组中，存在细胞周期、P53信号通路、细胞间黏附分子及VEGF信号通路的富集（FDR＜0.25，P＜0.05）。结论:IL4I1在肾癌中高表达且与患者不良预后正相关；IL4I1促进肾癌细胞的增殖和迁移。     

黄芪皂苷Ⅱ对肾透明细胞癌细胞生长抑制作用及机制

目的 探讨黄芪皂苷Ⅱ(As Ⅱ)对肾透明细胞癌786-O细胞增殖的影响及潜在机制。 方法 噻唑兰(MTT)法和克隆实验检测As Ⅱ对786-O细胞的生长和集落形成的抑制作用。细胞流式术检测AS Ⅱ的凋亡诱导作用。随后,用免疫印迹法检测不同处理组细胞PI3K-AKT-mTOR通路蛋白及凋亡执行蛋白的变化,最后利用PI3K-AKT-mTOR通路激活剂IGF-1与As Ⅱ对细胞共处理后,流式细胞术检测细胞凋亡水平的变化,进一步验证PI3K-AKT-mTOR通路在凋亡诱导中的作用。 结果 As Ⅱ对786-O细胞的增殖抑制效应具有浓度和时间依赖性,时间与浓度之间有交互作用(F时间=513.00, P<0.001;F浓度=1 678.00, P<0.001;F时间×浓度=18.23, P<0.001),并可抑制细胞集落形成。As Ⅱ可诱导细胞凋亡并诱导凋亡执行蛋白cleved caspase-3的表达(P_{0 μmol/L As Ⅱ组 vs 10 μmol/L As Ⅱ组}= 0.013 9,P_{0 μmol/L As Ⅱ组 vs 20 μmol/L As Ⅱ组}<0.001)。As Ⅱ可抑制PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化(p-PI3K: P_{0 μmol/L As Ⅱ组 vs 20 μmol/L As Ⅱ组}=0.032 4;p-mTOR: P_{0 μmol/L As Ⅱ组 vs 10 μmol/L As Ⅱ组}=0.004 1,P_{0 μmol/L As Ⅱ组 vs 20 μmol/L As Ⅱ组}<0.001;p-AKT:P_{0 μmol/L As Ⅱ组 vs 10 μmol/L As Ⅱ组}=0.003 2,P_{0 μmol/L As Ⅱ组 vs 20 μmol/L As Ⅱ组}=0.001 2)。IGF-1可以逆转As Ⅱ对AKT的磷酸化(P=0.006 8),并减弱AsⅡ对786-O细胞的凋亡诱导效应。 结论 As Ⅱ可抑制肾癌780-O细胞的增殖和集落形成,并通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路的磷酸化,上调cleved caspase-3的表达,进而诱导细胞凋亡。