复方斑蝥含药血清抑制人肝癌Bel-7402细胞增殖的机制研究

目的 探讨复方斑蝥抑制人肝癌Bel-7402细胞增殖的作用机制.方法 血清药理学方法制备复方斑蝥血清并处理人肝癌Bel-7402细胞,MTY方法观察其对人肝癌Bel-7402细胞增殖的抑制作用,RTPCR技术检测其对c-Myc、p53基因表达的影响.结果 复方斑蝥含药血清能够显著抑制Bel-7402细胞的增殖,并下调c...     

siRNA介导核干因子基因沉默抑制肝癌细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 核干因子(nucleostemin, NS)是最近发现的一个GTP结合蛋白,在神经干细胞、胚胎干细胞以及某些肿瘤细胞中均有表达。NS在多种肿瘤细胞增殖和凋亡调控中具有重要作用,然而其在肝癌中的作用尚未清楚。本研究通过检测其在不同肝癌细胞系和组织中的表达,并利用siRNA干扰技术,以探究NS在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用。 【方法】 以肝癌组织和多种肝癌细胞系为研究对象,首先通过定量PCR及蛋白质印迹法分析细胞及肝癌组织中NS的表达。接着通过siRNA瞬时转染的方法降低NS的表达,并通过定量PCR和蛋白质印迹法检测干涉效果,利用MTT试验和细胞增长实时监控技术检测细胞增殖情况,流式细胞术探究紫外线(ultraviolet, UV)或血清饥饿诱导下细胞凋亡情况。 【结果】 蛋白质印迹及定量PCR结果显示NS在多种肝癌细胞系及肝癌组织中都有较高的表达,且在MHCC97H和Bel7402细胞中,MTT试验和细胞增长实时监控显示降低NS的表达能够抑制细胞增殖,流式细胞术和蛋白质印迹结果显示NS基因沉默能够促进UV和血清饥饿诱导的细胞凋亡。即NS可能具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。 【结论】 NS在肝癌组织和细胞中都有较高的表达,在MHCC79H和Bel7402细胞中,降低NS表达可抑制细胞增殖,促进UV及血清饥饿诱导的细胞凋亡。     

量子点标记自杀基因靶向脂质体在肝癌诊治一体化中的应用研究

【目的】 自杀基因/前体药物系统抗肿瘤作用效果显著,但自杀基因肿瘤靶向识别性差而限制其临床应用。基于叶酸偶联脂质体(FL)的生物相容性及靶向性、量子点(QD)荧光标记的高灵敏性及光稳定性、HSV-tk自杀基因独特的旁观者效应,本研究拟开发多功能纳米载体-叶酸靶向量子点标记的HSV-TK基因脂质体(FL/QD-TK),并检测此载体系统在肝癌诊治一体化中作用。 【方法】 构筑FL/QD-TK并进行表征后,利用MTT法、激光共聚焦荧光显微镜、活体荧光成像仪及裸鼠移植瘤模型等方法对其体内外靶向性成像和治疗肝癌的作用及生物安全性进行研究。 【结果】 多功能纳米载体FL/QD-TK合成方法稳定,形貌均一,对叶酸受体高表达的Bel-7402肝癌细胞表现出较强的选择性杀伤作用,而对叶酸受体低表达的HepG2细胞靶向杀伤作用较弱。FL/QD-TK可实时示踪TK基因在Bel-7402荷瘤裸鼠体内的运输与分布,实现了在肿瘤部位的靶向富集,系统性给药并联合GCV取得了良好的抗肿瘤效果,同时对各脏器组织形态学和血清学指标无影响。 【结论】 新型多功能纳米载体FL/QD-TK可在体外靶向和选择性杀伤叶酸受体高表达肝癌细胞,在体内可视化示踪TK基因治疗肿瘤并具备了较好的生物安全性,FL/QD-TK作为一种潜在的高效低毒的纳米药物有望应用于肝癌的诊治一体化。     

生长激素促进体外培养的Bel-7402肝癌细胞增殖

  【目的】 了解重组人生长激素(rhGH)对体外培养的Bel-7402肝癌细胞增殖的影响｡【方法】 应用放射性配体法了解GHR在Bel-7402肝癌细胞株的表达情况;采用肿瘤细胞计数､噻唑蓝比色法和集落形成实验了解Bel-7402肝癌细胞株在不同浓度rhGH(0､1､10､100､1 000､10 000 ng/mL)作用下的药物敏感性,计算细胞生长率,集落形成率;并用3H-TdR渗入法了解肿瘤细胞DNA代谢情况｡【结果】 放射配体法发现Bel-7402肝癌细胞表达GHR, rhGH对体外培养的7402肝癌细胞的生长具有一定程度的刺激作用,表现为rhGH在100 ng/mL的浓度时促进肝癌细胞的增殖较为显著,而rhGH在其它浓度时(1､10､1 000､10 000 ng/mL)的部分时段,对肝癌细胞的增殖虽也能表现出一定程度的促进作用,但总体效果较rhGH 在100 ng/mL浓度时为弱｡【结论】 一定浓度范围的rhGH对7402肝癌细胞的增殖有促进作用,原因可能与7402肝癌细胞表达GHR有关｡     

鳖甲煎丸化裁方对肝癌HCCLM3细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨鳖甲煎丸化裁方对肝癌HCCLM3细胞增殖和凋亡的影响。方法采用SD大鼠每天灌胃鳖甲煎丸化裁方(21 g/kg),7 d后腹主动脉取血离心获得含药血清。96孔板加入不同浓度鳖甲煎丸化裁方含药血清,分别干预24、48、72 h后,每孔加入10μL MTT溶液,继续培养4 h,检测各含药血清对HCCLM3增殖的影响;培养HCCLM3细胞后,向各孔内分别加入5%、10%、20%的鳖甲煎丸化裁方含药血清及葫芦素I培养24、48 h后,Annexin V-FITC/PI法检测含药血清对HCCLM3凋亡的影响。结果鳖甲煎丸化裁方各浓度含药血清在干预24 h后5%、10%含药血清对细胞增殖的影响不大,与对照组相比较,差异无统计学意义(P0.05)。在各给药组干预48 h后,10%、20%含药血清组的增殖率分别为87.86%和84.60%,与对照组相比较,对细胞的增值率影响具有统计学差异(P0.05)。各给药组在干预24 h后,5%含药血清组对细胞造成的凋亡与对照组相比较,无统计学差异(P0.05),而10%、20%含药血清及葫芦素I(0.5μmol/L)的凋亡率分别为7.90%,12.22%和15.36%,具有统计学差异(P0.05)。各给药组在干预48 h后,鳖甲煎丸代裁方含药血清5%、10%、20%组及葫芦素I(0.5μmol/L)的凋亡率分别为8.08%,11.95%,13.89%和19.02%,与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论鳖甲煎丸化裁方含药血清具有明显抑制HCCLM3增殖并促进其凋亡的作用,作用效果随剂量增加而增强。     

探索薄层色谱法在桉叶油含药血清制备中的应用

【立项依据及设计思路】 跟随指导教师做实验发现,所制备的桉叶油含药血清品质因为没有相关检测数据而不能保证,甚至是否真的含有研究的药物都值得怀疑。查阅文献发现液/气-质联用法可以检测,但仪器昂贵,上机样品要求高,需要专业技术人员,且桉叶油成分复杂使得检测所需的标准品难以配置而放弃此方法检测。在《有机化学》学习中了解到薄层色谱法(TLC)是一种快速分离和定性分析少量物质的实验技术,其优点是操作方便、设备简单、结果显示快速。结合其原理,与指导教师讨论其应用于判定桉叶油含药血清品质及指导桉叶油含药血清制备方案选择的可行性。拟探索TLC定性和半定量检测性能能否满足桉叶油含药血清制备过程中判定血清中是否含有原药成分和新生成分,指导给药剂量、方式和采血时间的选择的实验要求。 【实验内容】 (1)TLC能否制备桉叶油浓度比色卡。(2)TLC能否检测出桉叶油含药血清中是否含有原药成分和新生成分,并运用液相色谱检测验证实验结果。(3)TLC半定量检测性能能否满足指导桉叶油含药血清制备过程中给药剂量、方式及采血时间选择的实验要求。 【材料】 清洁级小鼠,薄层硅胶板,液相色谱仪,桉叶油。 【可行性】 (1)研究者具有较强的动手能力和灵敏的思维能力,指导教师多年从事桉叶油研究,有丰富的科研经历,可以保证实验顺利开展。(2)预实验和实验结果表明:①TLC可以定性检测桉叶油含药血清含有原药成分。②其他条件一致,不同时间点收集的血清TLC显色存在颜色梯度差。③其他条件一致,不同剂量桉叶油灌胃所制备血清TLC显色也存在颜色梯度差。提示TLC可以用于指导桉叶油含药血清制备的方案选择和血清品质的定性鉴定,满足了实验要求。 【创新性】 用实验验证了经济、简便、快速易行的TLC可以取代液/气-质联用技术,满足桉叶油含药血清制备中血清制备的方案选择和血清品质的定性鉴定的实验要求,也为TLC推广应用到制备其他中药含药血清提供了参考方法和实验依据。     

肝癌细胞株Bel-7402中侧群细胞的分离和致瘤能力

【目的】 分选肝癌Bel-7402细胞中的侧群(SP)细胞并分析其生物学特性?【方法】 采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术将Bel-7402细胞分为SP细胞和非侧群(NSP) 细胞2亚群?实验分组:SP组与NSP组?细胞生长曲线法和平板克隆法比较SP细胞和NSP细胞的增殖能力和克隆形成能力;RT-PCR法检测SP细胞和NSP细胞的CD133?三磷酸腺苷结合盒转动蛋白G2(ABCG2)表达;流式细胞术分析细胞凋亡率;无血清培养法检测SP细胞及NSP细胞成球率;非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内成瘤实验比较SP细胞和NSP细胞的致瘤性?【结果】 Bel-7402细胞中分选出的SP细胞比例为(2.4 ± 0.0)%?生长曲线表明SP细胞的增殖速度快于NSP细胞(P < 0.05)?SP?NSP细胞的克隆形成率分别为(20.5 ± 2.6)%?(5.1 ± 0.9)%,两者差异明显(P < 0.05)?SP细胞ABCG2 mRNA和CD133 mRNA平均表达水平分别是NSP细胞的3.03倍(P < 0.01)和1.98倍(P < 0.01)?SP细胞凋亡率为(0.89 ± 0.23)%,低于NSP细胞 (P < 0.05)?在无血清培养基中,SP细胞成球率为(14.1 ± 1.9)%,高于NSP细胞(P < 0.05)?1 × 103?104?105数量的SP细胞形成皮下移植瘤(P > 0.05,P < 0.05,P < 0.05),而1 × 105 NSP细胞则还不能成瘤?【结论】 肝癌 Bel-7402细胞中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞?     

鳖甲煎丸调控EGFR/MAPK/ERK通路对MHCC-97H肝癌细胞的影响

目的 探讨鳖甲煎丸通过miR-885-5p对表皮生长因子受体(EGFR)/丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路的靶向调控对MHCC-97H肝癌细胞的影响及作用机制。方法 SPF级SD大鼠10只随意分为空白组和鳖甲煎丸(1.1 g/kg)组,制备空白及鳖甲煎丸含药血清。取对数生长期的MHCC-97H细胞,分为模型组、不同质量分数(5%、10%、15%、20%)空白血清梯度组和鳖甲煎丸含药血清梯度组,以及不含细胞的空白组。CCK-8法检测细胞增殖,筛选含药血清最佳干预时间及质量分数。将MHCC-97H细胞分为空白对照组(不做任何处理)、鳖甲煎丸含药血清组(20%鳖甲煎丸含药血清)、miR-885-5p mimics组(转染miR-885-5p mimics)、miR-NC组(转染miR-885-5p阴性对照物)、鳖甲煎丸含药血清+miR-885-5p mimics组(20%鳖甲煎丸含药血清和转染miR-885-5p mimics),各组细胞均培养72 h。采用双荧光素酶报告实验验证miR-885-5p与EGFR的靶向关系。CCK-8法检测细胞增殖,细胞划痕实...     

鳖甲煎丸对HepG2裸鼠移植瘤的抑制作用及瘤体组织中β-catenin、Tbx3表达水平的影响

目的通过研究鳖甲煎丸对人肝癌HepG2裸鼠移植瘤生长的抑制作用及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响,探
讨鳖甲煎丸抗肝细胞癌的分子机制。方法裸鼠成瘤实验观察鳖甲煎丸对人肝癌HepG2裸鼠移植瘤生长的抑制作用,免疫组织
化学法检测人肝癌HepG2裸鼠移植瘤组织中PCNA的表达水平,TUNEL法检测人肝癌HepG2裸鼠移植瘤细胞凋亡,Western
blot检测人肝癌HepG2裸鼠移植瘤组织中β-catenin和Tbx3的表达水平。结果鳖甲煎丸能够显著抑制人肝癌HepG2裸鼠移植
瘤的生长（P<0.05）;和阴性对照（NC）组（5.5±0.90）相比,高剂量（H）组（22.9±1.22）、中剂量（M）组（14.7±0.50）移植瘤细胞凋亡率
显著增加（P<0.05）;H（40.9±2.31）、M（53.5±2.41）、低剂量（L）组（62.3±1.80）与NC组（93.5±1.70）相比,PCNA阳性细胞比例显
著降低（P<0.05）;同时,鳖甲煎丸能够抑制Wnt/β-catenin信号通路的信号分子β-catenin和Tbx3的表达。结论鳖甲煎丸抗肝细
胞癌的作用机制可能与抑制PCNA的表达以及调控Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平有关。
     

参芍消瘤方含药血清对人肝癌细胞生物学行为的影响

目的探讨参芍消瘤方含药血清对人肝癌细胞Bel-7402增殖、凋亡、细胞周期等生物学行为的影响及其作用机制。方法使用SD大鼠制备参芍消瘤方含药血清。将Bel-7402分为对照组、含药血清组（25%含药血清）、顺铂组（5mmol/L顺铂）、含药血清+顺铂组（25%含药血清+5mmol/L顺铂）。采用5-乙炔基-2''脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色法检测细胞增殖情况;采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率;采用划痕法检测细胞迁移能力;采用Transwell法检测细胞侵袭能力;采用Westernblot法检测细胞磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白表达水平。结果与对照组比较,含药血清组和顺铂组细胞增殖数量减少,侵袭能力下降,磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达水平降低,划痕速度减慢,凋亡率、S期细胞占比升高,Caspase-3蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与顺铂组比较,含药血清+顺铂组细胞增殖数量减少,侵袭能力下降,p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平降低,划痕速度减慢,凋亡率、S期细胞占比升高,Caspase-3蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论参芍消瘤方含药血清可抑制Bel-7402细胞增殖、迁移、侵袭,诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关。