免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117

目的：探讨用免疫磁珠分离法（magnetic activated cell sorting,MACS）从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。方法：收集小鼠骨髓细胞,台盼蓝染色观察其活力,用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表达阳性率。结果;未分选前CD117细胞纯度为（41.56±18.77）%,MACS分选CD117细胞纯度（88.68±4.74）%,纯化前后有明显差异（P〈0.05）。结论：MACS阳性选择法分选系统能有效分选骨髓造血干细胞CD117。     

免疫磁珠法分离骨髓CD34~+细胞的方法研究

目的 探讨免疫磁珠法分离CD34 细胞的方法. 方法 应用密度梯度离心法分离骨髓单一核细胞,后采用免疫磁珠法从单一核细胞中分选出CD34 细胞,流式细胞仪鉴定其纯度. 结果 各样品分离出的CD34 细胞占骨髓单一核细胞含量的(2.19±0.12)%,经流式细胞仪鉴定应用免疫磁珠分离的CD34 细胞纯度为(94.6±2.1)%. 结论 免疫磁珠法是分离CD34 细胞较理想的方法.     

汉黄芩素体外对胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭的实验性研究

目的探讨汉黄芩素对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及可能分子机制。方法不同浓度(20、50、100μmol/L)汉黄芩素分别作用于人胃癌SGC7901细胞24、48、72 h,空白对照不进行任何处理。采用MTT法检测细胞增殖能力;采用划痕实验观察细胞迁移能力;采用Transwell法观察细胞侵袭能力;采用流式细胞仪检测细胞周期与凋亡情况; RT-qPCR和Western blot分别对细胞基质金属蛋白酶2、9(MMP2、MMP9)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)以及金属蛋白酶抑制剂2(TIMP2)的mRNA和蛋白表达水平进行检测。结果 MTT实验结果显示,不同浓度的汉黄芩素抑制人胃癌SGC7901细胞呈浓度和时间依赖性;作用48 h后,汉黄芩素s期比例上升,诱导细胞凋亡(P0. 05); Transwell实验结果显示,汉黄芩素呈浓度依赖性抑制人胃癌SGC7901细胞侵袭; RTq PCR和Western blot检测结果显示,汉黄芩素能够抑制SGC7901细胞中ICAM-1、MMP9、MMP2的mRNA和蛋白表达水平,但上调TIMP2 mRNA和蛋白表达(P0. 05)。结论汉黄芩素能够抑制人胃癌SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭,阻滞细胞在S周期,诱导其凋亡。     

小鼠c-Kit+lin-骨髓细胞移植生成肝细胞的实验研究

目的 评价小鼠c-Kit^＋Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能，为骨髓源性肝干细胞的临床运用提供可行性实验依据。方法 供体为纯系BALB／C雄性小鼠．c-Kit^＋Lin-骨髓细胞采用免疫磁珠分选法分离细胞。受体为行35Gy全肝照射处理后的同龄同系BALB／C雌性小鼠，立即移植供体c-Kit^＋lin-骨髓细胞。接受c-Kit^＋lin-骨髓细胞移植1月后，活杀取肝做常规病理学检查、Y染色体的原位杂交检查、甲胎蛋白与白蛋白的免疫组化检测。结果 移植1月后小鼠肝脏的组织结构已恢复正常．肝组织细胞中存在原位杂交和免疫组化均呈阳性反应的双阳性细胞。结论 小鼠c-Kit^＋Lin-骨髓细胞具有肝干细胞潜能，移植后可以在肝内定居并分化形成肝细胞。可做为肝病细胞移植疗法的种子细胞。     

肝纤维化小鼠骨髓源性肝干细胞动员及确定

目的 建立小鼠四氯化碳性及酒精性肝纤维化模型并初步探讨干细胞动员情况,确定骨髓源性肝干细胞的表面标记.方法 四氯化碳皮下注射和酒精灌胃法使小鼠形成肝纤维化,分别取其骨髓干细胞,采用流式细胞仪检测肝纤雏化模型中不同干细胞标记的细胞群体包括c-kit Lin-,Thy1.2 Lin-,CD34 Lin-,Sca 1 Lin-的数量变化,寻找可能的肝干细胞动员情况.结果 与对照组相比,两组纤维化模型小鼠骨髓内c-kit Lin-细胞显著增高,其他干细胞类型细胞数量变化小.结论 c-kit Lin-细胞的数量在肝纤维化模型小鼠中存在明显动员情况,可能参与肝脏的修复,并成为肝干细胞的标记物.     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离与纯化培养的实验研究

目的 探索小鼠骨髓间充质干细胞的体外纯化培养方法.方法 先采用直接贴壁法培养的小鼠股、胫骨髓细胞,再用免疫磁珠法分选第3代中的CD11b-细胞.取分选纯化细胞进行形态学观察,并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞的分化能力.结果 ①原代及传代培养的小鼠骨髓贴壁细胞多呈梭形,部分呈不规则型,其中含有较多的CD11b 细胞;磁珠分离后的纯化细胞呈现纺锤型、星型及不规则型等多种形态,细胞质丰富,核仁明显,细胞平行排列或漩涡状生长;②成骨诱导3周后mMSCs分化为成骨细胞,茜素红S染色有橘红色磷酸盐胞外基质沉积;③随着成脂化诱导时间的延长,细胞逐渐增大,油红O染色可见胞质内大量橙红色脂肪空泡.结论 单纯的贴壁及传代培养不能纯化小鼠骨髓间充质干细胞,贴壁与免疫磁珠分离相结合才是一种有效的mMSCs体外分离和纯化方法.     

免疫磁珠法分离提纯骨髓造血干细胞方法的建立

目的 :为了建立免疫磁珠法体外分离提纯骨髓造血干细胞的方法。方法 :采用免疫磁珠阴性选择法分选 CBA(H - 2 K)小鼠骨髓细胞的 CD34+ CD38- Scal+ 细胞群 ,台盼蓝染色观察活力 ,流式细胞仪检测荧光标记的 CD34+ CD38- Scal+ 表达阳性率 ,骨髓造血干细胞 (HSCs)在体外克隆形成的分析 ,HSCs在体内造血功能重建的分析。结果 :分选后 CD34+ CD38- Scal+ 表达阳性细胞纯度达 (86 .5± 3.2 ) % ,细胞活力为 (95 .8± 2 .2 ) %。结论 :免疫磁珠阴性选择法分选系统是一种有效的骨髓造血干细胞分离提纯方法 ,省时、简便、纯度高并对细胞的生物活性无明显影响 ,提纯的细胞可直接用于后续实验     

免疫磁珠法纯化小鼠CD34+造血干细胞

目的探讨免疫磁珠法(MiniMACS)能否用于纯化小鼠骨髓CD34+造血干细胞.方法应用免疫磁珠纯化小鼠骨髓CD34+细胞,流式细胞仪(FACS)评估纯化效率,检测纯化后的细胞活力.结果纯化后CD34+细胞纯度81.5%(范围76.80%～85.38%),回收率47.54%(范围40.50%～54.31%),纯化前后细胞活力不受影响(P=0.169).结论应用MiniMACS纯化小鼠骨髓可获得高纯度CD34+细胞,并不影响细胞活力.     

汉黄芩素对小胶质细胞活化和迁移的影响

[目的]观察汉黄芩素对小胶质细胞活化和迁移的影响.[方法]建立小胶质细胞体外培养模型,给予脂多糖(LPS,100μg/L)及不同浓度的汉黄芩素(10,20,30μmol/L)后再培养12 h,采用ELISA法测定分泌到细胞外液中的单核细胞趋化因子(MCP-1)和激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)的含量.采用Transwell细胞培养室检测小胶质细胞的迁移,观察汉黄芩素对MCP-1诱导的小胶质细胞迁移的影响.[结果]LPS高度激活小胶质细胞并使MCP-1和RANTES分泌增加,汉黄芩素明显抑制MCP-1和RANTES的分泌(P<0.05).MCP-1诱导小胶质细胞增加迁移率,而汉黄芩素显著抑制MCP-1诱导的小胶质细胞迁移(P<0.01).[结论]汉黄芩素可抑制小胶质细胞的迁移率,其机制可能与抑制趋化因子MCP-1和RANTES的分泌有关.     

免疫磁珠法纯化小鼠CD34^＋造血干细胞

目的 探讨免疫磁珠法（MiniMACS)能否用于纯化小鼠骨髓CD34^ 造血干细胞。方法 应用免疫磁珠纯化小鼠骨髓CD34^ 细胞，流式细胞仪（FACS）评估纯化效率，检测纯化后的细胞活力。结果 纯化后CD34^ 细胞纯度81．5％（范围76．80％－85．38％），回收率47．54％（范围40．50％－54．31％），纯化前后细胞活力不受影响（P＝0．169）。结论 应用MiniMACS纯化小鼠骨髓可获得高纯度CD34^ 细胞，并不影响细胞活力。     

Liposome-mediated functional expression of multiple drug resistance gene in human bone marrow CD34<Superscript>+</Superscript> cells

Summary The expression and functional activity of multiple drug resistance (MDR1) gene in human normal bone marrow CD34⁺ cells was observed. Human normal bone marrow CD34⁺ cells were enriched with magnetic cell sorting (MACS) system, and then liposome-mediated MDR1 gene was transferred into bone marrow CD34⁺ cells. Fluorescence-activated cell sorter was used to evaluate the expression and functional activity of P-glycoprotein (P-gp) encoded by MDR1 gene. It was found that the purity of bone marrow CD34⁺ cells was approximately (91±4.56) % and recovery rate was (72.3±2.36) % by MACS. The expression of P-gp in the transfected CD34⁺ cells was obviously higher than that in non-transfected CD34⁺ cells. The amount of P-gp in non-transfected CD34⁺ cells was (11.2±2.2) %, but increased to (23.6±2.34) % 48 h after gene transfection (P<0.01). The amount of P-gp was gradually decreased to the basic level one week later. The accumulation and extrusion assays showed that the overexpression of P-gp could efflux Rh-123 out of cells and there was low fluorescence within the transfected cells. The functional activity of P-gp could be inhibited by 10 μg/ml verapamil. It was suggested that the transient and highly effective expression and functional activity of P-gp could be obtained by liposome-mediated MRD1 transferring into human normal bone marrow CD34⁺ cells. CAO Wenjing, female, born in 1968, Doctor in Charge     

Shkbp1缺失对小鼠T淋巴细胞系亚群的影响

目的探讨Shkbp1缺失小鼠(Shkbp-1~(-/-))的血液、骨髓、脾脏中血液细胞分类和T细胞亚群的变化。方法采用Shkbp-1~(-/-)转基因小鼠,经PCR鉴定基因型;利用全自动血液检测仪测定血液细胞分类;采用流式细胞仪检测Shkbp-1~(-/-)和对照组小鼠血液、骨髓、和脾脏中T淋巴细胞亚群。结果血常规结果:中性粒细胞和嗜酸性粒细胞有增高趋势,且有显著差异。淋巴细胞未见显著差异。流式结果显示:对照组血液中CD4~+CD8~+双阳性细胞降低,骨髓中CD3~+、CD4~+升高。但脾脏组织中,其CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD4~+CD8~+双阳性细胞均呈下降趋势。结论 Shkbp1参与血液细胞的成熟分化,影响了免疫细胞数量,本研究为探索Shkbp1如何参与血液细胞的分化奠定了研究基础。     

一种改良的5-羟色胺转运体活性化合物高内涵筛选方法

[目的]建立一种改良的5-羟色胺转运体(SERT)活性化合物高内涵筛选(HCS)方法,包括构建稳定转染h SERT细胞株和优化SERT活性化合物HCS条件。[方法]应用聚乙烯亚胺(PEI)将质粒h SERT-pc DNA3转染入HEK293细胞,采用遗传霉素(G418)筛选获得稳定转染细胞系,以实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting)方法分别从转录和翻译水平验证h SERT表达,采用SERT荧光底物4-(4-二甲氨基)苯基-1-甲基吡啶(APP+)在高内涵系统上验证SERT摄取功能并优化其检测条件,应用选择性SERT抑制剂Fluoxetine和SERT增强剂Tianeptine验证SERT HCS方法可靠性。[结果]经PEI转染和G418筛选获得了稳定转染h SERT-HEK293细胞株。与HEK293细胞相比,h SERT-HEK293细胞中h SERT m RNA和蛋白表达量均显著性增加,APP+摄取实验表明h SERT-HEK293细胞摄取APP+显著性增加,并可被Fluoxetine特异性抑制。实验优化了高内涵检测APP+摄取实验中APP+浓度、孵育时间、数据分析方法等条件。Fluoxetine显著地抑制h SERT-HEK293对APP+的摄取,Tianeptine显著地增强h SERT-HEK293对APP+的摄取,证实此HCS方法的可靠性。[结论]本研究首次优化了应用APP+检测SERT活性的HCS条件,显著提高了SERT荧光检测方法灵敏度,并首次证实此HCS方法适用于SERT促进剂筛选,因此,建立了一种改良的SERT活性化合物HCS方法。     

活血化瘀注射液(HHI-I)对TNF-α诱发大鼠肺微血管内皮细胞黏附分子mRNA表达的影响

[目的]从调节白细胞内皮细胞过度黏附角度研究活血化瘀中药的作用机制。[方法]体外培养肺微血管内皮细胞,RT-PCR方法观察活血化瘀注射液对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱发的体外培养大鼠肺微血管内皮细胞E-选择素、P-选择素、细胞间黏附分子ICAM-1mRNA表达的影响。[结果]肺微血管内皮细胞与含TNF-α培养基共同孵育后,可显著增加内皮细胞E-选择素、P-选择素、ICAM-1mRNA表达,在培养基中加入活血化瘀注射液含药血清后,则内皮细胞E-选择素、P-选择素、ICAM-1mRNA过度表达被明显抑制。[结论]抑制内皮细胞E-选择素、P-选择素、ICAM-1mRNA过度表达是活血化瘀重要的作用机制之一。     

条件培养液体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究*

[目的]观察乳鼠心室肌成纤维细胞条件培养液干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.[方法]分离培养及鉴定大鼠MSCs,对其进行分组诱导:单纯条件培养液组(TJ)、条件培养液1组(TJ-ZY)、条件培养液2(TJ-XFK),诱导,24h后继续培养4周,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和α-actin mRNA的表达.[结果]免疫细胞化学结果显示单纯条件培养液诱导后的MSCs不表达心肌特异性蛋白cTnT,心复康参与组则表达.实时荧光定量(RT-PCR)结果显示各组均表达心肌分化早期基因,心复康参与组诱导后的MSCs的心肌分化早期基因表达明显高于单纯条件培养液组.[结论]微环境在MSCs向心肌样细胞的分化过程中起了重要作用,心复康能够提高MSCs向心肌样细胞的分化和特化作用.     

芍药苷ApoE-/-对小鼠血脂及主动脉斑块的影响

[目的]观察芍药苷对ApoE^-/-小鼠血脂及主动脉斑块形成的影响。[方法]6周龄ApoE^-/-雄性小鼠经普通饲料饲养4周,髙脂饲料饲养12周后,随机分为ApoE^-/-模型组及芍药苷60 mg/kg、30 mg/kg剂量组,相同遗传背景的同龄正常C57BL/6J小鼠作为空白对照组。药物干预12周后,检测血脂的变化,并测量主动脉弓部、胸段、腹段斑块面积。[结果]ApoE^-/-模型组甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）显着高于C57BL/6J组（P<0.01）,芍药苷60 mg/kg、30 mg/kg组的血脂水平显着低于ApoE^-/-模型组（P>0.05,P<0.01）,并且不同程度减小主动脉各段斑块的面积。[结论]芍药苷具有降脂和抑制主动脉斑块形成的作用,表明芍药苷具有抗动脉粥样硬化作用。     

救心胶囊对缺氧损伤内皮细胞黏附分子表达的影响*

[目的]以内皮细胞(EC)为研究对象,观察救心胶囊对缺氧损伤内皮细胞黏附分子释放的影响.[方法]运用免疫细胞化学技术,通过进行内皮细胞培养,观察内皮细胞缺氧损伤后,黏附分子(VCAM-1、ICAM-1)在细胞浆的表达情况.[结果]缺氧损伤使VCAM-1、ICAM-1表达显著升高.救心胶囊组,VCAM-1、ICAM-1表达显著降低.[结论]救心胶囊能显著降低黏附分子表达,保护内皮细胞免受炎症介质损伤.     

腺病毒介导CTLA4Ig基因转染骨髓基质细胞及其对CD34+细胞粘附力的影响

目的：通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞）Bone marrow stromal cells,BMSCs）中的表达，探讨CTLA4Ig基因修饰的BMSCs对CD34^ 细胞的粘附力的变化，方法：以CTLA4Ig－重组腺病毒按感染复数（Mutiplicity of infetion,MOI)50转染BMSCs，免疫组的^3H-TdR标记CD34^ 细胞的cpm值观察CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞的粘附力变化，结果：免疫细胞化学染色示CTLA4Ig表达阳性率达85％（MOI＝50），弥漫性定位于细胞质，免疫磁体阳性选择获取的骨髓CD34^ 细胞纯度可高达97．8％，转染组与对照组BMSCs对CD34^ 细胞的粘附力无显著差异（P＞0．05）。结论：CTLA4Ig－重组腺病毒能有效介导CTLA4Ig基因在BMSCs中表达，并对其粘附力无显著影响。     

腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰对骨髓基质细胞功能的影响

目的　通过腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSCs) ,探讨基因修饰对BM SCs主要功能的影响。方法　以CTLA4Ig 重组腺病毒转染BMSCs,通过测定粘附于BMSCs层的3 H TdR标记CD34+ 细胞的cpm值 ,观察基因修饰对其粘附力影响 ;通过观察骨髓基质细胞支持CD34+ 扩增的细胞总数及集落形成细胞数 (colonyformingcell,CFC)的变化 ,评价基因修饰对BMSCs支持CD34+ 细胞扩增能力的影响。结果　转染组与对照组BMSCs对CD34+ 细胞的粘附力及支持CD34+ 细胞扩增的能力均无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论　适当条件下 ,腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰BMSCs不影响其对CD34+ 细胞的粘附力及支持CD34+ 细胞扩增的能力     

消岩汤调整黄芪剂量联合GP方案治疗非小细胞肺癌的临床观察

[目的]观察不同剂量黄芪组方的消岩汤对非小细胞肺癌化疗患者不良反应的影响。[方法]采用完全随机化方法,将90例天津中医药大学第一附属医院非小细胞肺癌患者随机分成治疗组（60 g黄芪组方的消岩汤+GP方案化疗组）和对照组（消岩汤+GP方案化疗组）,观察不同剂量黄芪组方的消岩汤对气虚毒瘀型非小细胞肺癌化疗的骨髓抑制发生率（白细胞水平）及分级、免疫功能、细胞因子、生活质量的影响。[结果]化疗1周期后评价,2组在近期疗效上治疗组有效率为62.2%,对照组为55.6%,比较无统计学差异,（P>0.05）;在骨髓抑制方面,治疗组白细胞下降水平、回升程度及骨髓抑制发生率均优于对照组（P<0.05）,治疗组骨髓抑制分级均明显优于对照组;免疫功能方面,治疗后治疗组与对照组比较,CD3⁺、CD4⁺及CD4⁺/CD8⁺均明显升高（P<0.05）;在细胞因子方面,治疗后治疗组白介素-6（IL-6）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）较对照组升高明显,有统计学差异（P<0.05）;在生活质量方面,两组间患者卡氏评分变化比较具有统计学意义（P<0.05）。[结论]重用黄芪用量的消岩汤联合化疗治疗非小细胞肺癌,对于改善化疗所致的骨髓抑制、免疫功能下降、细胞因子减少疗效更佳,且对生活质量的改善更加明显。