金欣口服液含药血清抗呼吸道合胞病毒作用研究

目的：观察金欣口服液对呼吸道合胞病毒（RSV）感染的人喉癌上皮细胞（Hep-2）细胞的抑制作用。方法：通过体外抗病毒实验采用MTT法检测病变抑制率及以上清滴度观察金欣口服液含药血清对RSV的抑制作用。结果：MTT法测定病毒抑制率均高于75％,含药血清组上清滴度与空白血清组和病毒对照组比较有显著差异,滴度低于后两组。结论：金欣口服液对呼吸道合胞病毒引起的细胞病变有明显抑制作用。     

金欣口服液对感染RSV大鼠血清IL12表达水平的影响

目的?观察金欣口服液对感染呼吸道合胞病毒（RSV）大鼠血清IL12表达水平的影响,以寻找更有效的抗RSV感染方式。方法?将96只SD大鼠随机分为12组,分别为空白对照组,模型组,金欣高、中、低灌胃组,金欣高、中、低灌肠组,利巴韦林灌肠、灌胃组,金欣预先灌胃、灌肠组。用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组SD大鼠血清IL12的水平。结果? 与空白对照组比较,模型组感染RSV后血清IL12水平明显下降(P<0.01）;金欣组的高剂量灌胃组、中剂量灌胃组、中剂量灌肠组及预先灌胃组的IL12水平较模型组显著升高(P<0.01）,且与利巴韦林组有明显差异(P<0.01）。灌胃组中预先给药的IL12含量比其他给药组相比显著增加(P<0.01）。与灌肠给药相比,灌胃给药的预先组和金欣高剂量组的IL12较高(P<0.01）。 结论?金欣口服液能提高血清IL12的表达,且以灌胃方式提前给药能够更有效地抑制大鼠感染RSV。      

金欣口服液阻断呼吸道合胞病毒入侵的实验研究

目的 研究金欣口服液含药血清时呼吸道合胞病毒入侵宿主细胞环节的影响.方法 在病毒和细胞接触期间采用转换温度方法观察金欣口服液含药血清对 RSV 黏附、侵入的影响.观察药物作用前后宿主细胞表面F蛋白的表达.结果 温度转换前(黏附阶段)加入金欣口服液含药血清,实验组和对照组OD值无差异;温度转换后(侵入阶段)加入金欣口服液含药血清组OD值明显升高,与对照组比有显著性差异.荧光标记的F蛋白位于感染细胞表面,RSV 感染后,细胞发生融合的部位荧光明显增强,金欣口服液含药血清作用后荧光减少.结论 金欣口服液拮抗呼吸道合胞病毒的机制之一是抑制病毒的膜融合,作用位点是病毒的F蛋白或其受体.     

金欣口服液对呼吸道合胞病毒感染人胚肺成纤维细胞胞内钙离子的影响

目的:探讨金欣口服液对呼吸道合胞病毒(RSV)感染细胞内的钙离子影响.方法:体外建立RsV A型LONG株攻击体外培养的人胚肺成纤维细胞模型,设正常细胞组、病毒组、空白血清组、利巴韦林组和金欣口服液组.采用激光共聚焦技术检测其对感染细胞不同时间点的胞内钙离子的变化.结果:RsV感染24 h细胞内钙离子与正常细胞组相比无显著性差别(P>0.05).空白血清、利巴韦林、金欣口服液组和病毒组相比无显著性差异(P>O.05).RSV感染48、72 h均高于细胞组(P0.05).72 h低于病毒组(P<0.05);利巴韦林组和金欣口服液组48、72 h均低于病毒组,且有显著性差异(P<0.05).金欣口服液组和利巴韦林组相比.48 h有显著性差异(P<0.05),但72 h无显著性差异(P>0.05).结论:金欣口服液可能抑制成纤维细胞的钙离子内流,这也许是金欣口服液抑制RSV感染细胞凋亡的一个因素.金欣口服液可作为早期抗RSV感染治疗药物.     

基于高分辨率质谱的金欣口服液治疗小鼠RSV感染的血清脂质组学研究

目的 基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS高分辨率质谱,观察RSV诱发的肺炎模型小鼠的血清中脂质代谢的变化,分析金欣口服液对RSV肺炎小鼠中脂质代谢紊乱的调节作用,探讨金欣口服液治疗RSV诱发的病毒性肺炎的潜在机制。方法 用RSV诱导小鼠病毒性肺炎,灌胃金欣口服液予以治疗,分别采集对照组、模型组、金欣口服液组小鼠的血清样本,提取脂质成分,采用LC-MS分析,采用主成分分析法（PCA）、聚类分析法（CA）等多元统计方法,对小鼠血清脂质代谢轮廓进行分析,同时进行Kruskal–Wallis test以及fold change法进行统计,寻找差异性脂质。结果 RSV感染导致小鼠肺部炎性细胞浸润及不同程度的肺炎,血清中多种脂质代谢物代谢紊乱,具体表现多数PC、PE出现明显上调,金欣口服液均能改善小鼠肺炎症状且显著恢复血清中异常紊乱的脂质。结论 RSV感染可导致小鼠血清中脂质代谢紊乱,而金欣口服液可一定程度恢复RSV模型中代谢紊乱的脂质,提示金欣口服液可通过调节脂质改善RSV诱发的肺炎。      

金欣口服液不同给药途径对呼吸道合胞病毒肺炎大鼠模型SIgA的影响

目的:探讨金欣口服液不同给药途径对呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎模型幼年大鼠支气管肺泡及大肠、小肠灌洗液中模型免疫球蛋白(SIgA)的影响。方法:将88只幼年大鼠随机分为正常组,模型组,金欣口服液高剂量、中剂量、低剂量灌胃组(金高胃组、金中胃组、金低胃组),金欣口服液高剂量、中剂量、低剂量灌肠组(金高肠组、金中肠组、金低肠组),预先给药灌胃组(预灌胃组),预先给药灌肠组(预灌肠组),利巴韦林组共11组。RSV滴鼻3 d后灌胃给药,连续用药7 d后处死。ELISA法测定各组大鼠支气管肺泡及大肠、小肠灌洗液中SIgA的水平。结果:模型各组黏膜SIgA的含量表达水平均高于正常组(P<0.01)。与模型组相比,预先给药,高剂量、中剂量组的支气管肺泡及小肠灌洗液中的SIgA水平均显著高于模型组(P<0.01)。与利巴韦林组比较,金欣口服液预先给药、高、中剂量组的支气管肺泡中SIgA水平高于利巴韦林组(除金中灌胃组P<0.05外,其余均为P<0.01),在小肠灌洗液中SIgA表达水平方面,金欣高剂量组显著高于利巴韦林组(P<0.01)。两种给药途径比较,预先给药及高剂量给药时,灌胃组的支气管肺泡中SIgA水平高于灌肠组(P<0.05);在小肠灌洗液中SIgA方面,预先给药时,灌胃组高于灌肠组(P<0.05),而高剂量给药时,灌胃组则低于灌肠组(P<0.05)。结论:金欣口服液可有效增加RSV肺炎模型幼年大鼠SIgA的分泌,与利巴韦林比较,具有调节机体免疫抗病毒之优势,是治疗RSV感染的有效方剂。在灌胃、保留灌肠两种给药途径方面,两者差异不明显。     

金欣口服液不同化学部位对呼吸道合胞病毒感染的影响

目的 观察金欣口服液不同化学部位在体内的抗呼吸道合胞病毒（RSV）作用。方法 小鼠经滴鼻感染RSV建立肺炎模型,随机分为正常对照组、模型对照组、利巴韦林组、金欣口服液组、金欣口服液石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取液组及母液组,光镜下观察肺组织的炎症病变情况,计算小鼠肺指数和肺指数抑制率、脾指数、胸腺指数、死亡保护率。结果 金欣口服液石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取液对RSV感染后小鼠的肺指数增高均有显著的降低作用(P<0.01),减轻感染小鼠肺组织炎症病变,同时能增加脾指数和胸腺指数(P<0.01)。金欣口服液正丁醇提取液能降低RSV感染小鼠的死亡率。结论 金欣口服液石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取液对RSV具有一定的抑制作用,并且能提高RSV感染小鼠的免疫功能。正丁醇提取液对RSV感染小鼠具有一定的死亡保护作用。     

金欣口服液调控心磷脂代谢抗呼吸道合胞病毒感染的机制研究

目的 研究金欣口服液及其主要成分黄芩苷对呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)诱导心磷脂代谢异常的影响及可能的作用机制。方法 将BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组和金欣口服液给药组。前3 d以RSV混悬液滴鼻建立RSV感染模型,从第3天下午开始,金欣口服液组予金欣口服液(27.6 g·kg^-1·d^-1)连续灌胃给药3 d。体外实验采用RSV感染Raw264.7细胞的方式建立病毒感染模型,黄芩苷组给予黄芩苷(100 mg·kg^-1·d^-1)干预。采用色谱质谱联用的方式分别检测小鼠肺组织及Raw264.7细胞心磷脂代谢谱的变化。qPCR法检测RSV表面蛋白RSV-F、RSV-G,炎症因子IL-6、IL-1β、Tnf-α,心磷脂代谢酶Tafazzin(TAZ)、心磷脂合成酶1(Crls1)、心磷脂转运酶(PLSCR3)以及自噬受体蛋白SQSTM1/P62(p62)的转录水平。Western blot法检测p62蛋白表达水平,分子对接检测p62与CL14∶0-...     

金欣口服液对呼吸道合胞病毒感染的肺巨噬细胞及BALB/c小鼠IL-1β表达的调控作用

[目的]探讨金欣口服液对呼吸道合胞病毒(RSV)感染肺巨噬细胞(Raw264.7)及BALB/c小鼠白介素-1β(IL-1β)表达的调控作用。[方法]体外实验:培养Raw264.7细胞,共分4组(n=6),分别是正常细胞组,RSV感染模型组,利巴韦林注射液组,金欣口服液组。进行含药血清干预,收集24h的上清以酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组IL-1β的含量;体内实验:分为A组(感染前高剂量及等效剂量给药)、B组(感染前感染后高剂量及等效剂量给药)、C组(感染后高剂量及等效剂量给药)三大组,观察金欣口服液不同剂量、不同给药时间对RSV感染BALB/c小鼠24h、72h、144h时IL-1β表达的调控作用。[结果]RSV感染Raw264.7细胞后24h上清中未检测到IL-1β的表达。其中RSV感染BALB/c小鼠24h后IL-1β的表达量显著增加,A组中金欣口服液高预防组和等效预防组均能下调其表达且以等效预防组的下调作用明显;RSV感染BALB/c小鼠72h后IL-1β的表达量也显著增加,但较RSV感染24h时的表达量稍有减少,B组中金欣高预防组和治疗组IL-1β的表达均下调;RSV感染BALB/c小鼠144h后IL-1β的表达量显著减少,而C组中的金欣治疗组均能上调其表达。[结论]金欣口服液预防和治疗组在RSV感染BALB/c小鼠早期能显著下调其表达,防止机体因过度免疫而致肺损伤,随着感染时间持续延长IL-1β的表达开始急剧下降,而金欣口服液又能将其恢复到合适的水平,以增强机体的免疫力。     

银黄清肺胶囊含药血清体外抗呼吸道合胞病毒实验研究

目的 研究银黄清肺胶囊含药血清体外抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的作用.方法 采用观察CPE及MTT法,观察在银黄清肺胶囊含药血清干预下,感染RSV Hep-2细胞的CPE及光密度值,从而比较不同给药方式(预防给药、治疗给药、直接杀灭)及不同药物剂量下银黄清肺胶囊对RSV的抑制作用. 结果 在三种给药方式中,与相应浓度空白血清比较,各浓度银黄清肺胶囊与利巴韦林片含药血清OD值均明显增高(P<0.05);其中稀释度为3.13%的利巴韦林片含药血清和稀释度为6.25%的银黄清肺胶囊含药血清相比本组其他浓度含药血清OD值均明显增高(P<0.05).结论 银黄清肺胶囊含药血清对RSV有直接灭活作用,对RSV侵入Hep-2细胞有阻断作用,对RSV在Hep-2细胞内增殖有抑制作用. 其中稀释度为3.13%的利巴韦林含药血清和稀释度为6.25%的银黄清肺胶囊含药血清相比本组其他浓度含药血清体外抗RSV活性强.     

不同RNA提取及反转录方法对环状RNA聚合酶链反应的影响

［摘要］ 目的 比较不同总RNA提取方法及不同反转录引物对喉鳞状细胞癌细胞株Hep2细胞环状RAN扩增的影响,进一步为环状RNA鉴定与扩增提供可靠的实验方法。 方法 使用Trizol抽提法和miRNeasy Mini试剂盒提取Hep2细胞中的总RNA;Nanodrop 2000对总RNA进行定量及纯度测定;使用随机引物和通用引物分别对总RNA进步反转录;实时定量聚合酶链反应检测Hep2细胞中环状RNA-circHIPK3及circFLNA的表达。 结果 Trizol抽提法提取的RNA浓度和RNA总量高于miRNeasy Mini试剂盒提取的RNA总浓度结果（P＜0.01）,但应用miRNeasy Mini试剂盒提取的RNA纯度要高于Trizol抽提法（P＜0.05）,应用随机引物反转录,能扩增出circHIPK3和circFLNA,而利用通用引物进行反转录,circHIPK3及circFLNA不能被扩增;另外,利用miRNeasy Mini试剂盒法提取总RNA后所扩增出circHIPK3及circFLNA的相对表达量明显高于Trizol抽提法（P＜0.01）。 结论 miRNeasy Mini试剂盒提取总RNA纯度更高,更有利于环状RNA的扩增,利用随机引物进行反转录而非通用引物,可顺利扩增出环状RNA。     

cAMP对lac基因启动子体外转录影响的研究

目的：研究ｃＡＭＰ对ｌａｃ基因启动子体外转录的影响作用。方法：以含ｌａｃ基因启动子及其Ｚ结构基因的线性ｐＵＲ２２２ＤＮＡ为模板，观察Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡ聚合酶受ｃＡＭＰ作用后的转录强度。结果：０．１０～０．８０ｍｍｏｌ／Ｌ的ｃＡＭＰ对ｌａｃ基因启动子体外转录有明显的促进作用，低于０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ对体外非特异性转录有促进作用；浓度进一步增高对转录起抑制作用。ｃＡＭＰ作用下特异性与非特异性转录产物放射活性间无相关性。结论：ｃＡＭＰ对转录有双重作用，这种作用可能与启动子区的构象特点及ＲＮＡ聚合酶与启动子的特异结合有关。     

一种快速诊断呼吸道合胞病毒感染的方法

应用引物设计原则，选择呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）基因组中高度保守的Ｆ基因作为扩增靶序列，独立设计合成了两对引物，建立了一个逆转录套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测ＲＳＶＲＮＡ的方法。结果：对引物进行敏感度实验，其检测敏感度为每ｍｌ１０ＴＣＩＤ５０ｓ（５０％ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ）的病毒量；用副流感病毒１型、甲型流感病毒、乙型流感病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒和腺病毒２型作对照，均无预期扩增产物出现，证实了设计引物的特异性；用建立的逆转套式ＰＣＲ方法对５例急性下呼吸道感染患儿的鼻咽部分泌物标本进行检测，发现３例阳性，２例阴性；同时用病毒培养法检测，结果完全相同。提示：该方法具有快速、敏感、特异和观察结果客观等优点。     

呼吸道合胞病毒感染大鼠脊髓背根节信号转录因子的研究

目的：研究反复呼吸道合胞病毒（RSV）感染大鼠脊髓背根节感觉神经细胞转录因子的活化状态变化。 方法：1～2周龄 SD大鼠幼鼠共80只,区组随机分为对照组和RSV感染组,每组40只。 RSV感染组采用每周1次RSV(浓度5 ×105 U/mL)滴鼻法制作RSV慢性感染模型,对照组采用无病毒培养上清液滴鼻。8周后每组取5只大鼠进行气道反应性测定。原位杂交检测肺组织RSV RNA以证明呼吸道合胞病毒感染模型的可靠性。用TranSignal蛋白质/DNA活性芯片筛选C7~T5脊髓背根节组织中活性改变的转录因子。Western印迹对筛选结果中改变最明显的因子进行验证。结果：RSV感染组气道阻力增幅显著大于对照组(P＜0.05)。原位杂交显示RSV感染组肺组织有大量呼吸道合胞病毒存在,HE染色示肺部存在明显炎症细胞浸润,说明呼吸道合胞病毒感染模型建立成功。TranSignal蛋白/DNA组合芯片检测筛选：RSV反复感染大鼠背根节55个转录因子活性上调(RSV感染组/对照组>2),43个活性下调(RSV感染组/对照组<0.5)。Western印迹验证结果与芯片结果一致,并进一步明确蛋白/DNA组合芯片筛选的IRF转录因子是IRF-1,而不是IRF-2。结论：反复RSV感染可引起气道反应性增高和脊髓背根节感觉神经细胞内多种转录因子活性发生改变,可能与气道反应性增高的神经调控异常有关。     

大鼠血红素氧化酶 1的基因克隆和原核表达

目的：从大鼠脾中克隆出血红素氧化酶1（RHO-1）基因，构建其原核表达载体，并在大肠杆菌中表达其蛋白。方法：用RT-PCR从大鼠脾总RNA中扩增出RHO-1 cDNA，并将其克隆入pMD18-T载体， 经TA克隆测序分析后,将阳性TA克隆RHO-1片段亚克隆入pET28a(+)原核表达载体，转化大肠杆菌BL-21，经限制性内切酶图谱鉴定后，阳性菌株经IPTG诱导，SDS-PAGE分析。结果：TA克隆测序分析证实该基因全长870 bp,编码289个氨基酸,所克隆的基因序列与GenBank中登录的RHO-1基因序列完全一致；限制性内切酶图谱结果表明成功构建了RHO-1的原核表达载体；SDS-PAGE结果显示RHO-1基因在大肠杆菌中获得表达。结论：用RT-PCR正确克隆RHO-1基因，构建pET28a(+)/RHO-1表达载体，并成功表达RHO-1融合蛋白。     

人CDC2基因的克隆和原核表达及鉴定

目的：从人肝癌组织中克隆出人细胞分裂周期基因2（ CDC2）,并在大肠杆菌中表达CDC2蛋白。方法：从人肝癌组织中提取RNA,采用RT-PCR法扩增CDC2 cDNA,用DNA凝胶回收试剂盒纯化并回收RT-PCR产物,将RT-PCR产物插入pET28a(+)载体NdeⅠ和 XhoⅠ两酶切位点之间,转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导表达人CDC2蛋白。结果：RT-PCR扩增出约894 bp的DNA片段,与GenBank中的CDC2基因序列完全一致。经限制性内切图谱和测序鉴定,成功构建了pET28a(+)/CDC2原核表达载体。SDS-PAGE分析结果显示人CDC2蛋白在大肠杆菌中得已表达。结论：从人肝癌组织中成功地扩增出CDC2基因,并在大肠杆菌中表达。     

RNA INTERFERENCE OF ANNEXIN II GENE IN PC3 CELLS BY USING SMALL INTERFERENCE RNA SYNTHESIZED WITH IN VITRO TRANSCRIPTION

RNA interference (RNAi) has become a powerfuland widely used tool for the analysis of genefunction in invertebrates and plants.1Recently, ithas been reported that RNAi also works in mammaliancellswhen small interfering RNAs ( siRNAs) are used toavoid acti…     

二重RT-FCR同时测定HGV与HCV RNA方法学研究

本文对二重RT-PCR同时测定HGV与HCV RNA的反应条件进行了最佳化研究,发现在用于HGV扩增的三组引物中,NS5b区的L与S二组引物较5'NCR区的N组引物有更高的检测敏感度(P<0.01)。不同的样本贮存对HGV与HCV RNA检测结果影响较大,将逆转录与第一次扩增分开进行可使测定敏感度提高约100倍。本法在同一反应体系中可同时检测HGV与HCV RNA,减轻了实验人员的操作强度,可降低测定费用近50％。