全外显子组测序分析中预处理方法和变异识别方法的比较

目的：比较全外显子组数据分析中不同的预处理方法和变异过滤方法对变异识别的影响。方法：利用２例全外显子组测序数据,从使用不同的预处理方法（FASTX-Toolkit、Trimmomatic及未做预处理）、修饰后不成对读长（single-end reads,SE）取舍策略以及变异过滤方法[Hard过滤和变异质量得分重新校正（variant quality score recalibration,VQSR）]3个方面,通过数据覆盖深度（depth of coverage,DP）、识别变异的数目、转换/颠换比值和基因型一致性等特征,比较他们对全外显子组变异识别结果的影响。结果：Trimmomatic预处理后的读长测序ＤP与未预处理的原始数据接近,但明显高于FASTX-Toolkit预处理方法。当DP≥10×且基因型质量分数（genotype quality score,GQ）≥20时,经Trimmomatic预处理后识别到的单核苷酸变异（single nucleotide variant,SNV）数量比FASTX-Toolkit多,与未预处理组接近。当包含SE时,FASTX-Toolkit组多识别出的SNV数量高于（28%）Trimmomatic组（5%）。当样本量较少时,在所有实验组中Hard过滤方法滤掉的SNV要少于VQSR。结论：Trimmo－matic修饰（过滤）原始序列更温和,而FASTX-Toolkit可能过度过滤了原始数据。保留SE有利于下游变异识别。Hard过滤相较于VQSR表现出了更高的容忍度。     

儿童青少年双相情感障碍相关基因的生物信息学分析

目的　揭示儿童青少年双相情感障碍（PBD）的发病机制,为PBD的基础研究和临床治疗提供新思路。方法　2018年2—7月,分别以“pediatric bipolar disorder sequencing”“youth bipolar disorder sequencing”为关键词,在PubMed检索2014年1月—2018年7月的文献,共获得32篇文献。挑选其中应用全外显子组测序或转录组测序研究且纳入患者例数超过10例的数据集,经检索筛选共得到5套完整数据集,包含4套全外显子组测序研究（去重之后共计包含175个潜在与PBD风险相关的基因）及1套转录组测序研究（包含41个潜在与PBD风险相关的重要基因）。去重之后的基因按照不同组学方法分成两组：来自全外显子组测序的175个基因（全外显子组）与来自转录组测序的41个基因（转录组）,分别使用生物信息软件DAVID、KEGG、Panther、WebGestalt进行每组基因生物学功能（BP）的富集分析,通过KEGG、Panther数据库计算其所富集的通路。结果　全外显子组基因富集分析结果显示,共得到9个显著富集的BP分类,发生重要影响功能变异基因的主要作用与阴离子跨膜转运、氯离子运输、胚胎发育、神经管发育模式相关,另有少量基因显著富集与肾上腺发育功能相关。转录组基因富集分析结果显示,共得到10个显著富集的BP分类,发生异常表达的基因主要集中在组蛋白泛素化、甲状腺素合成与水解、蛋白折叠、组蛋白修饰等蛋白合成或水解相关的功能。全外显子组基因在KEGG数据库中显著富集的通路主要为肌醇磷酸盐代谢、磷脂酰肌醇信号系统通路;转录组基因在KEGG数据库中显著富集的通路主要为泛素化调控的蛋白水解通路。全外显子组基因在Panther数据库中显著富集的通路主要包括血管生成相关通路与帕金森疾病类通路;转录组基因在Panther数据库中未见显著富集的通路。结论　PBD患者异常突变的PLCD3、DAG1、APLNR、EPAS1等基因与胚胎发育相关,且该类变异属于遗传自父母的胚系突变;PBD患者中异常突变或表达的基因与磷脂酰肌醇信号系统以及血管生成相关。     

肿瘤相关基因ADAM15在结肠癌中一个非同义变异对细胞黏附及侵袭的影响

目的 解析ADAM15基因单核苷酸变异(single nucleotide variant, SNV)在结肠癌肿瘤发生发展相关的细胞学过程中的具体功能作用。方法 首先对具有侵袭表型的结肠癌患者癌组织及癌旁组织全外显子组测序,然后进行野生型/突变型ADAM15结肠癌HCT-8细胞系细胞功能实验,进而完成野生型/突变型ADAM15细胞系的转录组测序分析。结果 采用全外显子组测序在预后不良的患者中检出ADAM15基因SNV rs6427128,提示可能影响结肠癌的进展。细胞功能实验显示,rs6427128损失了ADAM15所具有的上调细胞侵袭能力的作用,而使细胞黏附能力增加约26%。转录组测序分析显示,与野生型相比,rs6427128过表达细胞的差异表达基因富集在细胞黏附、DNA的复制与转录、炎症反应等多种细胞生物学过程,提示rs6427128变异可能通过促进肿瘤细胞的黏附参与调节肿瘤微环境的重塑,从而影响结肠癌的进展。结论 结合适当的细胞模型和较为精细的分析方法,深入解析临床样本中所检出的一些高频非同义潜在功能性变异体,可以为肿瘤相关基因的结构功能关系提供有益的提示性实验室数据。     

CDAN1基因突变导致的胎儿期非免疫性水肿的家系遗传学分析

目的 对一例因不明原因胎儿期水肿的流产组织进行临床和遗传学分析,为该家系产前诊断以及遗传咨询提供可靠的理论依据。方法 采集孕妇外周血进行血常规、Rh血型和TORCH检测。采集羊水细胞用于细胞培养和G显带核型分析。提取胎儿引产组织基因组DNA行全基因组拷贝数变异测序;采用Agilent's SureSelect XT Human All Exon V6进行文库制备和外显子捕获,并使用Illumina NovaSeq 6000 对胎儿及其家系成员 DNA 行全外显子组测序（trios-WES）,并利用SIFT、I-mutant2、PolyPhen-2 及PROVEAN生物信息学软件对变异位点进行蛋白功能预测。利用Alpha Fold 2和PyMOL软件对CDAN1的结构进行建模和可视化分析;用Sanger测序对先证者及家系成员进行突变检测和验证。结果 胎儿17周超声提示胎儿全身皮下广泛水肿,右侧胸腔大量积液,肝脾增大,胎盘增厚,心包缺损。染色体核型分析检测和染色体拷贝数变异测序结果均正常;全外显子组测序显示CDAN1基因：c.2140C>T（p.Arg714Trp）和c.1264_1265delCT（p.Leu422Glyfs*16）复合杂合突变,分别来自先证者父亲和母亲,生物信息学预测为可能致病性突变,对应的疾病为先天性红细胞生成障碍性贫血1型。结论 全外显子组测序结果显示,该胎儿为先天性红细胞生成障碍性贫血（CDAN1基因突变）导致的胎儿期非免疫性水肿,其中CDAN1基因c.1264_1265delCT为首次报道的突变。     

一例GNB1基因突变致神经发育障碍患儿的临床及基因突变分析

目的：应用全外显子测序技术（whole exome sequencing, WES）对患有语言运动发育迟缓及严重智力障碍的患儿及其父母进行分析,探讨基因水平的遗传学病因并明确临床诊断,进一步指导妊娠。方法：提取患儿及其父母外周血DNA,采用外显子捕获结合高通量测序技术进行检测。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG, 2015）标准对患儿及父母检测出的变异进行致病性判定,结合患儿表型寻找致病基因及位点。利用Sanger测序法对致病位点进行验证。结果：患儿GNB1基因第7号外显子c.346 G>A (p.G116S)位点杂合错义突变为致病位点,患儿父母该位点均为野生型,此变异为患儿的新发突变。Sanger测序验证结果与外显子捕获测序结果一致。患儿为常染色体显性智力低下42型（Autosomal dominant mental retardation-42, MRD42）患者。结论：应用全外显子测序技术可对语言运动发育迟缓伴严重智力低下的患儿进行诊断,明确了该患儿的致病原因,有助于家系的遗传咨询并为再生育提供指导。     

糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23多态性与支气管哮喘的相关性研究

目的检测糖皮质激素受体（GIucoeorticoid Receptor，GR）基因外显子2／1密码子23多态性，从而探讨糖皮质激素受体基因外显子2／1密码子23与激素敏感型支气管哮喘的相关性。方法按标准方法从外周血白细胞中提取DNA，采用聚合酶链反应／单链构象多态性（Polymerase chain reaction／Single-strand cordormation polymorphism，PCR／SSCP）和基因测序技术，结合琼脂糖凝胶电泳，对20例哮喘患者（研究组）及20例健康对照组的糖皮质激素受体基因外显子2／1密码子23的基因型进行检测和分类．统计两组的各基因型频率，判断两组之间有无差异．统计学处理用X^2检验．结果经琼脂糖凝胶电泳显示哮喘组（20例）与健康对照组（20例）样本PCR产物片断长度约356bp。SSCP分析显示哮喘组（20例）与健康对照组（20例）样本的电泳速率相同，提示无变异存在．行基因测序糖皮质激素受体外显子2／1密码子23基因型均为AGG。结论江西籍汉族人种中糖皮质激素受体基因外显子2／1密码子23基因未发现多态性的存在。糖皮质激素受体基因外显子2／1密码子23与激素敏感型支气管哮喘之间无明显联系．     

腹膜间皮瘤组织体细胞突变的分析

［摘要］目的：探讨临床标本全基因组测序中体细胞突变测定技术的应用。方法：对1例手术切除的腹膜间皮瘤肿瘤组织和其癌旁组织进行了第二代全基因组测序,并将结果与人类基因组数据库的参考序列进行比对。结果：发现639 717个肿瘤组织和癌旁组织细胞共有的单核苷酸变异（single nucleotide variation,SNV）,20 302个肿瘤组织独有的SNV和2 185个癌旁组织独有的SNV,还有223个位点,在肿瘤组织和癌旁组织以及人类基因组参考序列三者之间均不相同。结论：仅仅对个体2种组织样本和人类基因组参考序列比对,尚不能准确定位病变细胞的所有体细胞突变。因此,建立个体出生时的全基因组序列或预留出生时的DNA样本有助于排除正常组织体细胞突变的干扰。     

COL4A3基因2个新无义变异致Alport综合征的临床和遗传分析

目的探讨COL4A3基因突变所引起的常染色体隐性遗传Alport综合征的临床特点和基因变异特点。方法用基因测序和生物信息学分析方法分析1个常染色体隐性遗传Alport综合征患者的临床表型和基因型。结果男性患者,14岁发现水肿、肉眼血尿、蛋白尿、低蛋白血症伴有听力障碍,治疗、随访不规律,20岁进展至终末期肾病。应用全外显子组测序发现COL4A3基因2个新的无义变异,40号外显子上c.3508GT(p.G1170X)杂合变异,51号外显子上c.4825CT(p.R1609X)杂合变异,Sanger测序验证患者母亲携带c.3508GT(p.G1170X)杂合变异,父亲携带c.4825CT(p.R1609X);患者的哥哥未携带这2个基因变异。这2个无义变异均导致蛋白质表达提前终止,系致病变异。结论 COL4A3基因无义变异导致的常染色体隐性Alport综合征在青少年时期进展至终末期肾病;新发现2个COL4A3基因的无义变异;全外显子基因测序是确诊Alport综合征的重要手段。     

核苷（酸）类药治疗慢性乙肝患者HBV逆转录酶区基因耐药的变异分析

目的：了解核苷（酸）类药物治疗慢性乙型肝炎过程中HBV耐药变异特点。方法：收集163份长期核苷（酸）类药物治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本,用半巢式聚合酶链反应-直接测序法获得HBV全长逆转录酶区序列,用生物信息学技术筛查该区内6个经典耐药变异位点并鉴定基因型,分析慢性乙型肝炎核苷（酸）类药物耐药特征及与HBV基因型关系。结果：163份慢性乙型肝炎患者血清标本中有64份（占39.26%）发现了已知耐药位点变异。拉米夫定（1amivudine,LAM）治疗组耐药性变异比例高于阿德福韦（adefovir dipivoxil,ADV）治疗组。单用LAM组和单用ADV组发现已知耐药位点变异比例分别为39.40%和12.90%。19例LAM和ADV序贯治疗的患者中出现5例（占26.32%）多药耐药变异特征,而LAM与ADV联合治疗的16例患者中未发现后续ADV耐药变异。耐药变异与HBV基因型相关性分析显示,存在RT基因耐药位点变异的单用LAM组、单用ADV组、LAM和ADV序贯治疗组和LAM治疗后加用ADV组间的HBV基因型比例差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：慢性乙型肝炎长期核苷（酸）类药物治疗,耐药变异复杂,对LAM耐药的患者,改用ADV比加用ADV更易导致多重耐药变异。核苷（酸）类药物耐药变异与HBV基因型别无关。     

广西地区壮族2型糖尿病患者脂联素基因多态性研究

目的：研究脂联素基因外显子2单核苷酸多态性（SNP）＋45T→G多态性与广西地区壮族2型糖尿病（T2DM）、肥胖及胰岛素抵抗（IR）的关系。方法：运用PCR-RFLP的方法对303例无亲缘关系的广西地区壮族人群[正常糖耐量者（NGT）98例、糖耐量减低者（IGT）108例、T2DM者97例]中检测脂联素基因外显子2的多态性。结果：广西地区壮族人群中脂联素基因＋45位有SNP＋45T→G存在。含脂联素基因外显子2的SNP＋45GG基因型的人群BMI、FPG、PPG、FINS、HOMA-IR高于含TT基因型的人群（P〈0.05）.T2DM组的含GG基因型人数高于NGT、IGT组，GG基因型比TT基因型增加了3.077倍T2DM的危险性（95％CI：1.240-7.634）。结论：脂联素基因外显子2SNP＋45GG变异与肥胖、IR及T2DM相关。