hnRNPA2B1通过抑制转铁蛋白受体增强胰腺癌细胞对铁死亡的抵抗

目的:探讨异质核核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1,hnRNPA2B1)对胰腺癌细胞铁死亡的影响及其潜在机制。方法:将3种胰腺癌PaTu8988、MIA-paca2、PANC1细胞用不同浓度Erastin处理3 d, CCK8法检测细胞活性,计算3种细胞Erastin半数抑制浓度(IC₅₀)并比较其对Erastin的抵抗力;荧光实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法分别检测3种胰腺癌细胞中hnRNPA2B1 mRNA和蛋白的相对表达。通过GEPIA平台分析hnRNPA2B1在胰腺癌组织和正常组织中的差异性表达,通过GEO数据库下载临床数据集分析差异性表达hnRNPA2B1患者的预后。在PaTu8988细胞中干扰hnRNPA2B1表达,分别转染sh-Control、sh-hnRNPA2B1质粒;在PANC1细胞中过表达hnRNPA2B1,分别转染Vector、Flag-hnRNPA2B1质粒;分别采用qRT-PCR和蛋白免疫印迹检测转染效率,通过Transwell实验检测hnRNPA...     

PPARγ2表达促毛囊bulge细胞向皮脂腺定向分化的研究

目的探讨毛囊bulge细胞向皮脂腺细胞分化的机制。方法构建携带过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(peroxisomeproliferatoractivationreceptorγ2,PPARγ2)基因的绿色荧光蛋白(GFAP)质粒,通过质脂体转染到体外分离培养毛囊bulge细胞中,以转染空质粒的毛囊bulge细胞为对照,观察细胞的分化情况,运用免疫细胞化学检测细胞PPARγ和上皮膜抗原(epithelialmembraneantigen,EMA)的表达,油红O染色观察细胞脂滴合成情况。结果荧光显微镜下观察到已转染质粒的细胞呈现绿色荧光,能稳定表达PPARγ2mRNA,该细胞分化3周左右,部分细胞胞浆内出现脂滴,PPARγ、EMA及油红O染色阳性,而对照组为阴性,细胞内未见脂滴。结论毛囊bulge细胞可以分化为皮脂腺细胞,PPARγ2基因在其中起着重要作用。     

ES细胞来源的神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后的分化及对学习记忆的改善

目的 观察来源于小鼠胚胎干细胞的神经前体细胞移植Aβ海马损伤大鼠后的存活、分化以及细胞移植对模型大鼠的治疗作用.方法 采用改良的无血清方法将表达绿色荧光的小鼠胚胎干细胞定向诱导为神经前体细胞,移植至单侧海马注射Aβ1-40损伤模型大鼠注射处;免疫荧光双染观察移植细胞的存活、分化.结果 胚胎体在改良的N3选择性培养基生长5 d后,90%以上的小鼠胚胎干细胞分化为nestin阳性神经前体细胞.移植到模型大鼠海马后神经前体细胞存活良好,EGFP荧光显示移植细胞呈集落生长,Cy3荧光显示大部分细胞分化为GFAP阳性细胞,移植区周围可见一定数量NF200阳性细胞,其中部分发出类似神经元的长突起.行为学结果显示移植大鼠记忆能力较对照组明显改善.结论 胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植Aβ1-40损伤模型大鼠海马后能有效存活,大部分移植细胞分化为胶质细胞,小部分分化为神经元,细胞移植能改善模型大鼠学习记忆功能障碍.     

大鼠视网膜共培养诱导神经干细胞分化为视网膜神经节细胞

目的:研究新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养对干细胞分化的影响.方法:采用机械分离、无血清培养基选择培养的方法从孕14 d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并传代培养.使用组织-细胞共培养系统将出生4 d的乳鼠视网膜组织与上丘源神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较.结果:从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可以持续传代培养,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞.新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养促进干细胞的分化,并诱导分化出Thy1.1阳性细胞.结论:从胚胎大鼠上丘可以分离培养神经干细胞,与新生鼠视网膜组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化出视网膜神经节细胞.     

过量表达LMO2对成血管细胞增殖和造血分化的作用

目的利用小鼠胚胎干细胞进行体外造血细胞分化,研究LMO2蛋白在成血管细胞分化过程中的作用。方法构建小鼠成血管细胞特异性表达lmo2或绿色荧光蛋白的表达载体,分别转染小鼠胚胎干细胞。经过筛选获得细胞克隆进行自发分化以形成胚胎体。收集分化0～12 d的胚胎体细胞,检测造血细胞相关基因的表达;利用EB细胞进行细胞集落形成实验及血细胞集落形成单位实验,并统计集落形成数。结果成功构建了成血管细胞特异性表达目的基因的表达载体,转染目的基因的小鼠胚胎干细胞在其分化中产生的成血管细胞可特异表达目的基因。过量表达lmo2能够促进造血相关基因的表达,所产生细胞集落数是对照组的2倍,晚期造血分化的血细胞集落形成单位总数是对照组的2.5倍,其中红系集落单位数是对照组的3倍。结论在成血管细胞中过量表达LMO2,促进其细胞增殖及其造血细胞分化。     

小鼠胚胎干细胞诱导为甲状腺细胞的实验研究

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞（ESCs）分化为甲状腺细胞的可行性。方法E14小鼠ESCs诱导发育为拟胚体，再逐步添加促甲状腺素（TsH）、胰岛素（insulin）、KI等共培养。观察细胞分化过程的形态学变化，并以体外培养的成年小鼠甲状腺细胞为阳性对照；RT—PCR法检测甲状腺细胞分化相关基因TSHR、PAX8、NIS、TPO、Tg等表达情况：激光共聚焦显微镜双色荧光检测甲状腺细胞分化标记物PAX8和TTF-1的共表达；在荧光检测得甲状腺细胞分化率的基础上。送检电镜观察分化细胞的超微结构。结果诱导培养第6d分化细胞中有甲状腺细胞特有基因PAX8、NIS、TPO、Tg、TSHR的表达；第8d检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TSHR、TTF-1、PAX8、TTF-2的表达；细胞形态类似对照甲状腺细胞。结论ESCs经胚胎体发育阶段，在特定条件下可定向分化为甲状腺细胞。     

外胚间充质细胞向神经胶质/雪旺细胞的诱导分化及在BAM生物材料的存活研究

目的 探讨体外诱导外胚间充质细胞向神经胶质/雪旺细胞分化的潜能,观察细胞在不同材料上的生长状况,利用分化细胞观察在BAM生物材料的复合情况,为进一步构建组织工程神经提供理论依据.方法 取妊娠10.5d胎鼠颌突外胚间充质细胞,纯化后分别用8.5mg/L牛脑垂体提取物BPE、50μmol/L弗司扣林(forskolin)及联合应用诱导细胞分化.相差显微镜下观察细胞的形态变化,免疫组化鉴定细胞性质,将诱导后的细胞种植于胶原膜及胶原凝胶,并于培养3、6d后分别进行光镜、HE染色及扫描电镜观察细胞的生长情况.结果 培养3d后外胚间充质细胞形态发生变化,细胞形态为梭形,突起变长.而对照组细胞形态未见明显改变;免疫组化显示外胚间充质细胞表达S-100蛋白,但无GFAP的表达.而诱导分化后出现GFAP的表达,其中BPE及Forskolin联合应用后分化效果最好,约为79.2%.而在BAM凝胶和膜上细胞都可伸展并增殖.结论 BPE和Forskolin可不同程度诱导外胚间充质细胞向神经胶质细胞分化.在BAM膜上分化细胞生长状态良好,为该细胞与BAM生物材料构建组织工程神经导管提供了理论依据.     

头皮原发性皮肤神经节细胞瘤

神经节细胞瘤是一种神经内分泌肿瘤，其发生与自主神经系统的交感或副交感神经节有关。罕见发生于膀胱、前列腺和子宫。本文作者报道1例发生于儿童头皮的原发性皮肤神经节细胞瘤。对此肿瘤进行了组织学、免疫组化和超微结构研究。该病例可能代表神经嵴细胞向鳃弓发育过程中的一种异常迁移。此外，研究结果还强调在胚胎发育过程中神经嵴和鳃弓／裂之间有复杂的相互作用。     

增强型绿色荧光蛋白基因在鸡胚盘细胞中的表达

从鸡胚发育为X期的鸡蛋中取胚盘细胞,经原代培养后用带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为标记基因的真核表达质粒pLEGFP-C1转染鸡胚细胞观察GEFP基因的表达情况,结果在不同条件下的活细胞均见有EGFP基因的稳定表达,这提示通过EGFP基因转染鸡胚盘细胞可连续且直接观察活细胞中的表达,为转基因鸡的研究提供一实用的标记基因。     

miR-125b介导胰岛素促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化

目的 探讨miR-125b是否介导胰岛素促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化,为治疗糖尿病患者动脉钙化提供实验性依据.方法 采用real-time PCR检测胰岛素对血管平滑肌细胞miR-125b表达的影响.采用脂质体2000将miR-125b mimics转染至血管平滑肌细胞,然后给予胰岛素干预,检测碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌.结果 胰岛素可呈时间和剂量依赖性抑制miR-125b的表达,在血管平滑肌细胞过表达miR-125b可逆转胰岛素的促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的作用.结论 胰岛素通过抑制miR-125b的表达,进而促进血管平滑肌细胞向成骨细胞分化.     

细胞间接触诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的实验研究

目的通过两种细胞的共培养探讨细胞间接触对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化的影响。方法分别采用密度梯度离心法和胶原酶消化法分离培养了骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和膀胱平滑肌细胞(bladder smooth muscle cells,BSMCs)。并对其进行了鉴定。在此基础上以单独培养的BMSCs和BSMCs分别作为阴性和阳性对照组,将获得的BMSCs和BSMCs在体外通过接触与非接触共培养作为实验组,对诱导后的BMSCs是否向平滑肌(smooth muscle cells,SMCs)分化通过免疫荧光和Western blot进行鉴定。结果对BMSCs进行流式细胞术检测结果显示CD90、CD44表达阳性率分别为99.78%,60.27%,CD45表达阴性,阳性率为0.21%。在BMSCs与BMSCs共同培养的实验中,Western blot结果显示:BMSCs本身表达少量calponin蛋白,接触组calponin的表达随培养时间的延长逐渐增多,非接触组无明显变化;免疫荧光显示:接触组在共培养第8天...     

PTEN在胚胎早期心脏发育过程中作用的研究

目的 胚胎早期原肠胚形成期PTEN表达在原条及其而后发生的中胚层组织,本实验通过过表达PTEN探讨其在早期心脏发生发育过程的作用和意义。方法 《改良滤纸鸡胚胎整体培养法》取胚,37℃孵箱孵育待其发育到HH4期,对鸡胚心肌干细胞（Cardiac Stem Cell）进行PTEN电转染,转染成功后一部分鸡胚37℃孵箱继续培养30 h,待其发育形成心管,观察过表达PTEN对心管发生的影响;另一部分鸡胚在超净台内完成心肌干细胞的离体,体外培养使其分化发育成心肌组织[1],主要研究PTEN在细胞增殖、分化和凋亡过程中的作用。结果 30 h后鸡胚整体的免疫组织化学（N-cadherin）结果显示,PTEN-WT组和PTEN-G129E组鸡胚心管出现了反向环化、多囊化等畸形,GFP组和PTEN-C124S组心管发育受到的影响较小;转染后离体培养得到的心肌组织的跳动频率与GFP组下降的速度加快,且维持时间缩短,GFP组与PTEN-WT组有显著差异（P<0.05）,PTEN-WT组与PTEN-C124S组、PTEN-G129E组无显著差异（P＞0.05）。结论 PTEN蛋白酯酶可能参与早期胚胎心肌干细胞之间的粘附分子的表达从而调节细胞迁移、分化发育,并加速了心肌组织的衰老。     

胎儿冠状动脉平滑肌细胞的超微结构及形态计测学研究

本文在透射电镜下观察并计测了胎儿冠状动脉平滑肌细胞(SMCs)从中膜向内膜迁移过程中表型的改变和细胞器占细胞面积百分比(Vs)改变。结果表明,内膜游离平滑肌细胞的Vs值略高于弹力肌层和中膜,但未见明显差异。中膜平滑肌细胞向内膜迁移和Vs值的改变,考虑可能是由于细胞间某种物质的作用,使中膜平滑肌细胞向内膜迁移的同时发生了表型的改变。     

MHP 36神经干细胞体外经Ⅳ型胶原诱导向平滑肌细胞分化的研究

目的研究MHP 36神经干细胞在体外经Ⅳ型胶原诱导向平滑肌细胞的分化潜能。方法体外培养MHP 36神经干细胞,采用Ⅳ型胶原在37℃培养箱促分化,在分化第1、2、4天分别收获细胞并通过PCR和Western免疫印迹分别检测平滑肌细胞特异性标志物(SMαA,SMMHC,SM22,Myocardin)基因和蛋白表达。最后对分化第4天的细胞进行细胞免疫荧光染色来鉴定SMαA、SMMHC的表达。结果 MHP36神经干细胞在37℃培养条件下从第2天开始逐渐变长、呈梭形,并在培养基中形成螺旋状结构。PCR及免疫印迹证实SMαA,SMMHC,SM22,Myocardin的基因和蛋白表达从分化第1天到第4天显著增加(P<0.05)。此外,分化第4天的细胞表达成熟的SMαA,SMMHC胞浆蛋白。结论 MHP36神经干细胞在体外经Ⅳ型胶原诱导可向平滑肌细胞分化,并表达平滑肌细胞的特异性标志物。     

鸡胚鳃器官的扫描电镜观察

用显微解剖术和扫描电镜方法观察第11～21期鸡胚鳃器官的形态结构．鸡胚鳃器官由4对鳃弓、鳃沟、鳃膜和咽囊组成。第11期第1对鳃弓出现于心隆起颅侧。此后，第2—4对鳃弓分别出现在心隆起两侧。相邻鳃弓之间隔以相应的鳃沟，鳃沟与咽囊之间的薄层组织为鳃膜。在原始咽内部，咽囊最初呈圆弧形小坑状，继而加深变窄呈沟缝状。第17期第1、2对咽囊借鳃裂与鳃沟相通。     

Activated focal adhesion kinase involved in adhesion and migration of vascular smooth muscle cells stimulated by fibronectin

Objective To study the effects of focal adhesion kinase (FAK) phosphorylation on smooth mu scle cells (SMCs) adhesion and migration stimulated by fibronectin.Methods Adhesion and migration of cultured SMCs were stimulated by different concentrati ons of fibronectin (FN), FAK and its phosphorylation were detected by immunoprec ipitation and Western blot. FAK antisense oligodeoxynucleotides (ODNs) were tra nsfected into SMCs by cationic lipid to investigate its modulatory effects on ty rosine phosphorylation. SMCs adhesion and migration were also measured by morph ological enumeration and modified Boyden Chambers, respectively.Results FAK were expressed when SMCs adhesion and migration were successfully simulated by different concentrations of FN. FAK phosphorylation were detected only at 20 μg/ml FN or more. FAK antisense ODNs were transfected efficiently by cationi c lipid and FAK phosphorylation was inhibited substantially. The SMCs migration rate in the 5-60μg/ml FN groups was reduced by 17.89%-27.67%. Cell migrat ion stimulated by FN at 10, 20, 40 and 60μg/ml were reduced by 23.26%, 21.6 3%, 19.31% and 17.88%, respectively (P&lt;0.05).Conclusions FAK phosphorylation and FAK-mediated signal transduction play important roles i n SMCs adhesion and migration stimulated by ECM. The process can be inhibited e ffectively by FAK antisense ODNs.     

Deltex-1对骨髓间充质干细胞增殖及其向平滑肌细胞分化的影响

目的 探讨Deltex-1对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bMSCs)增殖及其向平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)分化的影响.方法 分离培养大鼠骨髓bMSCs,采用流式细胞仪检测鉴定.通过Deltex-1过表达腺病毒载体pAd/Deltex-1感染bMSCs后,采用CCK-8(cell count kit-8)法检测Deltex-1过表达对bMSCs增殖的影响;将未感染、经Deltex-1病毒感染及经空病毒感染的bMSCs与SMCs共培养,采用免疫荧光细胞化学、RT-PCR及Western blot分别检测其bMSCs中SMCs标志物平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM-MHC)及Notch信号通路相关因子Notch-1的表达,单纯培养的bMSCs、SMCs的相同检测作正常对照.结果 成功分离、培养大鼠bMSCs.CCK-8检测证实:与对照比较,经Deltex-1病毒感染的bMSCs生长减慢,48 h开始显得更为明显(P＜0.05,P＜0.01);免疫荧光细胞化学、RT-PCR及Western blot检测显示:与对照比较,经Deltex-1病毒感染的bMSCs与SMCs共培养后显著表达SMCs的标志物SM-MHC,较弱表达Notch信号通路相关因子Notch-1 (P ＜0.01).结论 Deltex-1过表达可抑制bMSCs的增殖,并促进其向SMCs分化.     

鼠胚胎干细胞定向诱导为角膜上皮细胞的实验研究

目的建立能够稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的鼠胚胎干细胞系,并研究体外诱导鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell,Es细胞）向角膜上皮细胞分化的可能性及条件,为角膜损伤提供新型的上皮修复组织来源。方法质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠胚胎干细胞,对稳定表达GFP的ES细胞以Ⅳ型胶原作为诱导条件,定向诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞转化,观察培养后形态改变,免疫荧光及RT-PCR检测K12、K14及CD44的表达。结果转染后ES细胞稳定表达GFP,成功诱导出角膜上皮样细胞,呈典型上皮样细胞形态,免疫组化及RT-PCR检测显示,K12及CD44表达阳性,K14表达阴性。结论转染GFP的ES细胞,在Ⅳ型胶原的诱导下,成功向角膜上皮细胞分化。     

犬骨髓间充质干细胞体外诱导分化的平滑肌细胞的组织培养及鉴定

目的：应用条件培养基体外诱导成年犬骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞,探讨其作为构建组织工程血管种子细胞的可行性。方法：应用DMEM添加PDGF-BB和维生素C(VIT-C)体外培养通过密度梯度离心法得到的骨髓单核细胞,通过形态学观察鉴定培养的细胞,采用免疫荧光法检测4～6代细胞中平滑肌细胞特异性标记α-肌动蛋白（α-SMA）和肌球蛋白重链SMMHC,应用流式细胞术检测第5、6代细胞中平滑肌细胞的阳性率。结果：犬骨髓间充质干细胞在条件培养基的诱导下稳定传代至第6代后达到种子细胞的种植数量10⁷～10⁸,单独DMEM培养需要42　d,添加PDGF-BB/VIT-C后时间减少为33　d。细胞免疫荧光结果提示,大部分细胞α-SMA阳性、SMMHC阴性;流式细胞术结果显示,第5、6代细胞的α-SMA阳性率分别为57.8%和66.8%。结论：体外条件培养基能诱导犬骨髓间充质干细胞增殖分化为平滑肌细胞,并可作为组织工程血管构建的种子细胞。     

脑源性神经营养因子对小鼠结肠平滑肌细胞的作用及其机制

目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)对小鼠结肠平滑肌细胞(SMC)钙离子浓度及α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)的影响及其相关调节机制。方法 Western blotting法检测BDNF基因敲除(BDNF^+/-)小鼠与正常野生型(BDNF^+/+)小鼠α-SMA表达水平的差异。培养原代小鼠结肠SMC,免疫荧光法检测SMC中酪氨酸激酶B(TrkB)受体的表达。同时以BDNF、TrkB受体阻滞剂(K252a)干预SMC,Western blotting法检测α-SMA和TrkB-PLC-Ca²⁺信号通路蛋白表达水平的变化,钙离子成像法检测SMC内钙离子浓度的变化。结果 与BDNF^+/+小鼠相比,BDNF^+/-小鼠结肠α-SMA表达水平明显降低。SMC表达TrkB受体,在BDNF作用下,SMC中α-SMA、TrkB-PLC-Ca²⁺信号通路蛋白表达量和细胞内钙离子浓度增加,且加入K252a可阻断以上变化。结论 BDNF可能通过TrkB-PLC-Ca²⁺信号通路作用于SMC,影响细胞内钙离子浓度及α-SMA的表达水平,进而影响肠道动力。