洛伐他汀对大鼠系膜细胞增殖及TGF-β1基因启动子活性的调控

目的:观察洛伐他汀对大鼠系膜细胞增殖及对人TGF-β1基因启动子活性的作用.方法:(1) 应用MTT法观察洛伐他汀(10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)对大鼠系膜细胞增殖的作用;(2)将不同长度的人TGF-β1基因启动子片段与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成重组体phTGF2.14和phTGF1.12,采用脂质体法转染至大鼠系膜细胞中,分别加入不同浓度的洛伐他汀(10-7、10-5mol/L)进行干预,用ELISA方法检测报告基因CAT的活性.结果:(1)不同浓度洛伐他汀对大鼠系膜细胞增殖均有明显的抑制作用,与对照组比较有明显差异(P<0.01).(2)洛伐他汀浓度为10-7mol/L时对重组体phTGF2.14及phTGF1.12的表达活性无影响,当增大洛伐他汀浓度为10-5mol/L时对重组体phTGF2.14及phTGF1.12的表达活性有抑制作用,与对照组比较有显著差异(P<0.01).结论:洛伐他汀能够抑制系膜细胞增殖,当浓度为10-5mol/L时对人TGF-β1基因启动子活性也具有抑制作用.     

丹参酮II_A对大鼠系膜细胞增殖及TGF-β1启动子活性的调控

目的观察丹参酮IIA对大鼠系膜细胞增殖及对人TGF-β1基因启动子活性的作用。方法应用MTT法观察丹参酮IIA对大鼠系膜细胞增殖的作用;将不同长度的人TGF-β1基因启动子片段与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成重组体phTGF 2.14,采用脂质体法转染至大鼠系膜细胞中,分别加入不同浓度的丹参酮IIA(1、5、10 mg/L)进行干预,用ELISA方法检测报告基因CAT的活性。结果10 mg/L的丹参酮IIA对大鼠肾小球系膜细胞增殖有明显的抑制作用,与对照组比较有明显差异(P<0.01)。丹参酮IIA浓度为1、5 mg/L时对重组体phTGF 2.14的表达活性无影响,当增大丹参酮IIA浓度为10 mg/L时对重组体phTGF2.14的表达活性有抑制作用,与对照组比较有显著差异(P<0.01)。结论丹参酮IIA能够抑制系膜细胞增殖,当浓度为10 mg/L时对人TGF-β1基因启动子活性也具有抑制作用。     

肝细胞生长因子对系膜细胞增殖及TGF-β1启动子活性的影响

目的观察肝细胞生长因子（HGF）对大鼠系膜细胞增殖及对TGF—β1启动子活性的作用。方法应用MTT法观察HGF（0、0．1、1．0、1,0和100．0ng／mL）对大鼠系膜细胞增殖的影响；构建含不同长度人TGF—β1基因启动子片段的重组体phTGF2．14、phTGF1、12，以氯霉素乙酰基转移酶（CAT）为报告基因，并利用脂质体法将其转染至大鼠系膜细胞中，ELISA方法检测报告基因CAT的活性，以观察不同浓度的HGF（1．0、10、0ng／mL）对TGF—β1启动子活性的作用。结果大鼠系膜细胞经不同浓度的HGF干预后，各实验组与对照组相比细胞增殖水平差异无显著性，P〉0.05。在系膜细胞中，HGF的浓度分剐为1．0和10、0ng／mL时对重组体phTGF2、14及phTGF1、12的表达活性无抑制作用。结论HGF不能直接抑制大鼠系膜细胞增殖。在系膜细胞中HGF对TGF—β1启动子的表达活性无作用，提示其桔抗TGF—β1生物学作用的靶点并不是发生在基因转录水平。     

丹参酮ⅡA对大鼠系膜细胞增殖及TGF-β1启动子活性的调控

目的 观察丹参酮ⅡA对大鼠系膜细胞增殖及对人TGF-131基因启动子活性的作用.方法 应用MTT法观察丹参酮u.对大鼠系膜细胞增殖的作用;将不同长度的人TGF-131基因启动子片段与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成重组体phTGF 2.14,采用脂质体法转染至大鼠系膜细胞中,分别加入不同浓度的丹参酮ⅡA(1、5、10 mg/L)进行干预,用ELISA方法检测报告基因CAT的活性.结果 10ms/L的丹参酮ⅡA对大鼠肾小球系膜细胞增殖有明显的抑制作用,与对照组比较有明显差异(P<0.01).丹参酮Ⅱ浓度为1、5 mg/L时对重组体phTGF 2.14的表达活性无影响,当增大丹参酮ⅡA浓度为10 ms/L时对重组体phTGF 2.14的表达活性有抑制作用,与对照组比较有显著差异(P<0.01).结论 丹参酮ⅡA能够抑制系膜细胞增殖,当浓度为10 ms/L时对人TGFβ1基因启动子活性也具有抑制作用.     

三种抗纤维化细胞因子对HepG2细胞转化生长因子-β1基因启动子转录活性的影响

目的:观察抗肝纤维化细胞因子白介素10(IL-10)、肝细胞生长因子(HGF)和干扰素γ(IFN-γ)对含不同-509C＞T基因型的转化生长因子β1(TGF-β1)基因上游启动子转录活性的影响,探讨细胞因子可能的抗肝纤维化机制.方法:以TGF-β1基因上游5'侧翼区启动子(-1328 ～ 812)含有-509C＞T 位点的片段作为靶序列,将其与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成重组体phTGF2.14C、phTGF2.14T,脂质体法转染至人肝癌细胞系HepG2,应用IL-10(4 ng/ml)、HGF(10 ng/ml)和IFN-γ(20 ng/ml)作用于转染后HepG2细胞,ELISA法测定报告基因的表达.结果:转染phTGF2.14C的HepG2细胞报告基因活性明显高于转染phTGF2.14T者(P＜0.01).IFN-γ对转染phTGF2.14C、phTGF2.14T的HepG2细胞TGF-β1启动子转录活性均具有明显的抑制作用(P＜0.05),HGF对转染phTGF2.14C HepG2细胞的TGF-β1启动子转录活性具有促进作用(P＜0.05),IL-10对两种情况下HepG2细胞TGF-β1启动子转录活性调控作用均不显著.结论:C等位基因可明显增强TGF-β1基因启动子转录活性;IFN-γ可能通过抑制TGF-β1基因启动子转录活性抑制肝纤维化,而HGF、IL-10的抗纤维化作用可能与此途径无关.     

BMP-7对油酸诱导的肾小管上皮细胞转分化的预防作用

目的探讨BMP-7对油酸诱导的人肾小管上皮细胞转分化的预防作用。方法应用体外细胞培养技术培养人肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）。先用不同浓度BMP-7预处理HK-2细胞,再用400μmol/L油酸刺激HK-2细胞,采用RT-PCR法和ELISA法检测转化生长因子-β1的表达,采用RT-PCR法检测α-平滑肌动蛋白的表达。结果不同浓度BMP-7预处理对静息培养的肾小管上皮细胞TGF-β1和α-SMA的表达无显著影响。而一定浓度BMP-7可以显著下调油酸诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1和α-SMA的表达,并下调TGF-β1的分泌。结论BMP-7可以预防油酸诱导的肾小管上皮细胞转分化。     

尿酸对人肾小管上皮细胞HK-2纤维化相关调控因子的影响

目的观察不同浓度尿酸对人肾小管上皮细胞（HK-2）相关纤维化调控因子的影响,探讨建立尿酸诱导的人肾小管上皮细胞纤维化模型,为尿酸性肾纤维化疾病的研究提供细胞模型。方法以不同浓度的尿酸刺激HK-2细胞6,12,24,36h,MTT检测细胞活性抑制率;Real-TimePCR检测TGF-β1、CTGF、α—SMAmRNA的表达,观察尿酸对HK-2细胞的促纤维化作用;26mg／dL浓度尿酸刺激HK-2细胞24h,免疫组织化学检测TGF-β1、CTGF、α—sMA蛋白的改变。结果尿酸刺激后细胞活性抑制率与对照组比较明显升高（P＜0．05）,呈时间依赖性;尿酸刺激后TGF-β1、CTGF、α-SMA的表达量与对照组比较明显增加（P〈0．05）,并呈剂量依赖性;尿酸刺激后TGF-β1、CTGF、α—SMA蛋白的表达量与对照组比较明显增加（P〈0．05）。结论尿酸可抑制HK-2细胞增殖;采用尿酸诱导HK-2细胞,可建立肾纤维化的细胞模型。     

中药大黄的生化学研究 ⅪⅩ 蒽醌衍生物对线粒体呼吸链的抑制部位

本实验观察了大黄中活性较强的三种蒽醌衍生物如大黄素、大黄酸和芦荟大黄素对大鼠肝线粒体呼吸链四个电子传递复合体的影响。实验结果表明:上述三种蒽醌衍生物是线粒体呼吸链电子传递的抑制。1.大黄酸、大黄素和芦荟大黄素对NADH脱氢酶(复合体Ⅰ)有不同程度的抑制作用。浓度为60μg/ml时,抑制率分别为83.5%、66.0%和45.1%。50%抑制的药物浓度分别为22μg/ml、38μg/ml和72μg/ml。2.大黄素对琥珀酸脱氢酶(复合体Ⅱ)有较强的抑制作用。50%抑制的药物浓度为55μg/ml。而大黄酸和芦荟大黄素对此酶     

不同浓度马兜铃酸对肾小管上皮细胞的毒性作用以及骨形成蛋白-7的抗凋亡作用

目的 探讨不同浓度马兜铃酸（AA）对肾小管上皮细胞（RTECs）毒性作用的差异,以及BMP-7对AA所诱导RTECs凋亡的保护作用。 方法 （1）用浓度分别为5、10、20、40、80、160µg/ml AA刺激体外培养人近端肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）,应用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验检测不同浓度AA对HK-2细胞的直接毒性作用,相差显微镜观察细胞形态学改变,用Hoechst33258染色法观察不同浓度AA诱导的HK-2细胞凋亡核形态的改变,计算细胞凋亡百分率;（2）用300ng/ml BMP-7处理经AA（20µg/ml和40µg/ml）诱导的HK-2细胞48h,然后Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡百分率,分光光度法检测Caspase-3蛋白酶活性。 结果 当AA浓度达到80μg/ml时,细胞LDH释放率明显升高（P<0.001）;而AA浓度为10μg/ml时,细胞凋亡率开始明显升高（P<0.001）,AA浓度为40μg/ml时,细胞凋亡率最高;BMP-7处理后,细胞凋亡率和Caspase-3蛋白酶活性明显下降（P<0.01）。 结论 大剂量AA致RTECs坏死,中小剂量AA致RTECs凋亡;BMP-7可减轻AA诱导的RTECs凋亡,其作用可能部分通过抑制Caspase-3酶活性而实现。     

转化生长因子β调控miR-200b-200a-429启动子活性

目的 探讨转化生长因子β（TGF-β）对miR-200b-200a-429簇表达的影响,对其调控机制作初步研究。 方法 使用RT-PCR方法检测TGF-β对人肾小管上皮细胞HK-2 miR-200a、miR-200b和miR-429表达的影响。PCR方法扩增出miR-200b-200a-429簇启动子序列,构建miR-200b-200a-429启动子荧光素酶报告基因表达载体,转染至HK-2细胞,检测其荧光素酶活性。观察TGF-β对miR-200b-200a-429转录的表达调控。 结果 实时定量PCR检测结果显示TGF-β作用细胞24 h后下调了miR-200a、miR-200b和miR-429的表达。成功构建miR-200b-200a-429启动子荧光素酶表达载体,测序正确,然后利用双荧光素酶报告基因系统证实构建的报告基因载体启动子具有活性,发现TGF-β可以抑制miR-200b-200a-429启动子活性（P<0.05）。 结论 TGF-β可以调控miR-200b-200a-429启动子的活性。     

丹参酮Ⅱ A对人肾小管上皮细胞TGF-β_1/smad信号通路的干预作用

目的:探讨中药单体丹参酮ⅡA抗肾间质纤维化可能的作用机制。方法:将体外正常培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)随机分为空白对照组、转化生长因子(TGF-β1)组(TGF-β1,10 ng/ml)、丹参酮ⅡA低剂量组(丹参酮ⅡA 1μg/ml+TGF-β110 ng/ml)、丹参酮ⅡA中剂量组(丹参酮ⅡA 5μg/ml+TGF-β110 ng/ml)、丹参酮ⅡA高剂量组(丹参酮ⅡA 10μg/ml+TGF-β110 ng/ml),分别予相应的药物干预后吸取细胞上清液,用ELISA法检测Ⅲ型胶原的含量,细胞裂解后采用Western-blot法检测smad2和smad3的蛋白表达量。结果:与空白对照组比较,TGF-β1组的Ⅲ型胶原表达明显上升,加入丹参酮ⅡA后各剂量组的Ⅲ型胶原表达均下降,且呈剂量效应关系;TGF-β1组能促进smad2、smad3蛋白的表达,加入丹参酮ⅡA后各剂量组的smad2蛋白、smad3蛋白的表达量均低于TGF-β1组,但是无明显的剂量效应关系。结论:丹参酮ⅡA可以抑制TGF-β1诱导的Ⅲ型胶原的分泌,且可抑制由TGF-β1介导的smad2、smad3信号蛋白的表达,表明丹参酮ⅡA可能是通过抑制TGF-β1/smad信号通路中smad2、smad3蛋白的表达发挥其抗肾间质纤维化的作用。     

Basigin/CD147参与马兜铃酸损伤人肾小管上皮细胞的体外实验

目的:探讨马兜铃酸(AA)对人肾小管上皮细胞损伤机制及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Basigin/CD147)在损伤过程中发挥的作用。方法:不同浓度AA(10、20、40μg/ml)作用于人近端肾小管上皮细胞(HK-2)不同时间(24、48 h)后,MTT比色法检测细胞增殖变化;Basigin/CD147干扰质粒转染HK-2,选取AA最适浓度(20μg/ml),ELISA法检测不同时间段(24、48 h)细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)含量;实时定量(Real-time)PCR法检测Basigin/CD147 mRNA表达;Western印迹检测Basigin/CD147、TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达。结果:AA 48 h组TGF-β1含量显著高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组TGF-β1低于48 h AA组(P0.05);AA48 h组Basigin/CD147 mRNA含量显著高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组Basigin/CD147 mRNA显著低于48 h AA组(P0.05);AA 48 h组Basigin/CD147、α-SMA、TGF-β1蛋白表达明显高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组Basigin/CD147、α-SMA、TGF-β1蛋白表达均显著低于48 h AA组(P0.01)。结论:Basigin/CD147参与介导AA所致HK-2细胞损伤过程,干扰Basigin/CD147表达可能抑制AA引起的细胞纤维化;Basigin/CD147蛋白表达调控异常可能是引起马兜铃酸肾病的重要发病机制之一。     

法舒地尔对高糖培养肾小管上皮细胞增殖和纤维化的影响

目的：探讨法舒地尔（Fasudil）对高糖培养的肾小管上皮细胞（HK-2）增殖和纤维化的影响。方法：将HK-2细胞分为正常对照组（NG组,葡萄糖浓度5.5 mmol/L）、高张组（HM组,葡萄糖浓度5.5 mmol/L＋甘露醇54.5 mmol/L）、高糖组（HG组,葡萄糖浓度60 mmol/L）、高糖＋小剂量法舒地尔干预组[FA（5）组,D-葡萄糖60 mmol/L＋法舒地尔5μmol/L]、高糖＋中剂量法舒地尔干预组[FA（10）组,D-葡萄糖60 mmol/L＋法舒地尔10μmol/L];6高糖＋大剂量法舒地尔干预组[FA（20）组,D-葡萄糖60 mmol/L＋法舒地尔20μmol/L]。四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定HK-2细胞增殖;免疫共沉淀法检测p-MYPT1-Thr853;Western印迹法检测结缔组织生长因子（CTGF）的表达;ELISA法检测细胞培养上清液转化生长因子β1（TGF-β1）和纤维连接蛋白（Fn）的含量。结果：与NG组比,HG组HK-2细胞出现增殖增加,p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表达增加。与HG组比,FA（5）组、FA（10）组、FA（20）组均抑制了HK-2细胞的过度增殖,p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表达均减少。结论：法舒地尔可能通过抑制Rho激酶活性抑制高糖培养的肾小管上皮细胞增殖和纤维化。     

水通道蛋白11参与马兜铃酸损伤人肾小管上皮细胞的体外实验

目的:探讨马兜铃酸(AA)对人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤机制及水通道蛋白11(AQP11)在损伤过程中的作用。方法:将不同浓度的AA(10、20、40μg/ml)作用于体外培养的HK-2细胞,用四甲基偶氮唑盐法(MTT)选择最适浓度AA;用AQP11过表达质粒转染至HK-2细胞并验证,用以观察AQP11是否对AA诱导HK-2细胞转分化具有保护作用。予未转染及转染HK-2细胞分别加入最适浓度AA培养48 h,用ELISA法检测细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)含量,Real-time PCR检测AQP11 mRNA表达,Western印迹法检测AQP11、结缔组织生长因子(CTGF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达。结果:MTT法筛选出的AA最适浓度为20μg/ml;转入质粒过表达AQP11培养48 h后AQP11的表达量显著高于空白组(P0.01),提示转染成功。加入20μg/ml AA后,ELISA检测显示,未转染组的TGF-β1表达量较空白组明显上升(P0.05),至48 h达高峰(P0.01),而转染APQ11质粒组则明显低于未转染组(P0.05);PCR检测显示,未转染组AQP11 mRNA的表达量逐渐降低,至72 h显著低于空白组(P0.05),而转染组虽低于空白组(P0.05),但略高于未转染组(P=0.137);Western印迹法检测显示,未转染组α-SMA、CTGF蛋白表达较空白组明显上升(P0.01)、AQP11蛋白逐渐降低(P0.05),转染组48 h的α-SMA、CTGF蛋白表达量均较空白组有所提高(P=0.874,P=0.696),但显著低于未转染组(P0.01)。结论:AA可抑制HK-2细胞增殖,诱导细胞纤维化、坏死;过表达AQP11蛋白可以抑制AA作用下的细胞纤维化发生发展,AQP11表达调控异常可能是AAN的一个重要发病机制。     

马兜铃酸对体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞的损伤作用

目的:观察马兜铃酸(aristolochic acid,AA)对体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)的损伤作用。方法:体外培养NRK-52E,分别以不同浓度的AA-Na刺激细胞,每组设6个复孔,孵育24 h。透射电镜观察NRK-52E细胞的超微结构,MTT法检测不同浓度AA对NRK-52E细胞增殖的影响,流式细胞仪检测NRK-52E细胞的凋亡,免疫细胞化学法检测AA对NRK-52E细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响;检测不同时间段(12、24、48 h)马兜铃酸对NRK-52E细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)及内皮素-1(ET-1)mRNA和Ⅰ型胶原(ColⅠ)表达的影响。结果:①AA浓度低于10μg/ml时对NRK-52E的增殖无明显影响,20~40μg/ml浓度的AA可明显抑制NRK-52E细胞的增殖;②较高浓度的AA(40μg/ml)可明显刺激细胞凋亡;③AA5、10、20、40μg/ml均可刺激NRK-52E表达α-SMA,其中AA10μg/ml对α-SMA表达较强;④AA刺激NRK-52E细胞24 h后TGF-β1mRNA、ET-1 mRNA表达最多,48 h时表达水平下降,而COL-I的表达水平随时间的延长而上调,呈时间依赖性。结论:AA可直接损伤肾小管上皮细胞,促进其表达肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA,即有促转分化作用,且其对NRK-52E细胞的损伤作用呈剂量及时间依赖性。     

高效液相色谱法测定马兰中大黄酸、大黄素及大黄酚的含量

目的建立马兰药材中大黄酸、大黄素及大黄酚含量的测定方法。方法采用高效液相色谱法(highperformance liquid chromatography,HPLC)。色谱柱:Kromasil-C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸水溶液;梯度洗脱;检测波长:254nm;流速:1ml/min;柱温:30℃。结果大黄酸、大黄素、大黄酚浓度分别在0.253～2.530μg/ml(r=0.999 6)、0.249～2.490μg/ml(r=0.999 3)、0.257～2.570μg/ml(r=0.999 7)范围内与峰面积呈良好的线性关系;平均加样回收率(n=6)分别为99.27%(RSD=1.28%)、99.78%(RSD=1.05%)、99.92%(RSD=0.83%)。结论所建立的方法准确、可靠、简便,适合马兰药材中大黄酸、大黄素及大黄酚含量的测定。     

HPLC法测定十滴水中五种活性成分的含量

目的：建立HPLC法同时测定十滴水中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的方法。方法：色谱柱为ShimadzuVP-ODS柱（4.6mm×250mm,5μm）,流动相为乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱,流速为1.0ml/min,检测波长为254nm,柱温30℃。结果：5种成分分别在0.042～0.840μg（r=0.9996）、0.168～3.352μg（r=0.9998）、0.084～1.680μg（r=0.9997）、0.093～1.852μg（r=0.9999）和0.174～3.490μg（r=0.9994）内呈良好线性关系,平均回收率分别为99.60%（RSD=0.20%）、99.56%（RSD=0.36%）、98.95%（RSD=0.55%）、98.76%（RSD=0.97%）和98.79%（RSD=1.08%）。结论：本法简便、快速、准确,可用于十滴水的质量控制。     

六味地黄丸含药血清及梓醇对肾小管上皮细胞HK-2转化生长因子β1/Smad通路的影响

目的：观察六味地黄丸含药血清及其主要单体梓醇对肾小管上皮细胞株HK-2转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smad信号通路的影响。方法：制备大鼠六味地黄丸含药血清,采用四甲基偶氮唑盐法和乳酸脱氢酶释放实验确定药物最适作用浓度。六味地黄丸含药血清和梓醇作用于TGF-β1刺激（或不刺激）的HK-2细胞,并设肝细胞生长因子（hepatocyte growthfactor,HGF）为阳性对照,采用蛋白质印迹法观察Smad通路分子Smad2、Smad7和Ski相关活性蛋白N（Ski-related novel protein N,SnoN）蛋白表达的情况。结果：与HGF作用相似,10%浓度六味地黄丸含药血清可抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞Smad2蛋白磷酸化并促进核转录抑制因子SnoN的表达。梓醇亦可显著抑制HK-2细胞Smad2蛋白磷酸化。六味地黄丸含药血清及梓醇对HK-2细胞Smad7蛋白表达未见明显调控作用。结论：在TGF-β1刺激HK-2细胞模型中,六味地黄丸含药血清拮抗Smad通路活化的作用与HGF相似,梓醇是六味地黄丸中主要发挥作用的单体之一。     

高效液相色谱法同时测定黄氏响声丸中5种蒽醌类成分含量

目的:建立黄氏响声丸中5种蒽醌类活性成分的高效液相色谱含量测定方法,有利于制剂的质量控制.方法:采用高效液相色谱法,色谱柱:Shimadzu VP-ODS柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱,流速为1.0ml/min,检测波长为254nm,柱温30℃.结果:5种成分为芦荟大黄素0.0...