清肠化湿方对小鼠溃疡性结肠炎Th17/Treg平衡的调节作用

目的观察清肠化湿方对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道Th17/Treg平衡的调节作用,以探讨其治疗溃疡性结肠炎(UC)的可能机制。方法使用TNBS造模成功后,分为空白组、模型组、清肠化湿方组(12.8kg/d)、柳氮磺胺吡啶(SASP)组(0.5kg/d)。一次性ig给药,连续7d后处死小鼠;免疫组化法观察结肠组织中IL-17、Foxp3的浸润情况,Western blot法检测结肠组织RORγt和Foxp3蛋白的表达水平。结果清肠化湿方组小鼠结肠组织中IL-17表达低于模型组(P0.05);RORγt蛋白表达较模型组明显降低(P0.01),且与SASP组比较差异有统计学意义(P0.05);Foxp3蛋白表达较模型组升高(P0.05)。结论清肠化湿方可能通过下调RORγt表达抑制Th17细胞分化、IL-17产生,通过上调Foxp3表达促进Treg细胞形成,从而调节溃疡性结肠炎小鼠Th17/Treg平衡,抑制肠道炎症。     

清肠化湿方对TNBS大鼠结肠组织PPAR-γ/p38 MAPK的影响

目的 :观察清肠化湿方(QHD)对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎结肠组织中过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表达的影响,探讨其治疗溃疡性结肠炎(UC)的可能作用机制。方法:采用80只Wistar大鼠建立UC大鼠模型,随机分为8组,分别为空白对照组、模型对照组、QHD低剂量组、QHD中剂量组、QHD高剂量组、柳氮磺胺吡啶(SASP)组、柳氮磺胺吡啶+双酚A-二甘氨酸醚(SASP+BADGE)组及中药中剂量+BADGE组,每组10只。除空白对照组以生理盐水灌肠外,其余组采用TNBS/乙醇灌肠造UC大鼠模型。以柳氮磺胺吡啶(SASP)为阳性对照,同时联合使用PPAR-γ抑制剂双酚A-二甘氨酸醚(BADGE),给药7 d后病理检测各组大鼠结肠组织的损伤情况,并通过蛋白质印迹法(Western blot)和实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Real-time PCR)实验分别检测大鼠结肠组织中PPAR-γ、p38 MAPK的蛋白和基因表达,同时检测各组大鼠结肠组织中黏蛋白2(MUC2)和三叶因子3(TFF3)的表达情况。结果:清肠化湿方可上调TNBS大鼠结肠组织PPAR-γ的表达(P<0.01),同时抑制p38 MAPK的活性(P<0.01),并促进结肠组织中MUC2和TFF3表达(P<0.01),当联用PPAR-γ抑制剂BADGE后其对p38 MAPK的抑制作用减弱(P<0.05)。结论:清肠化湿方对TNBS大鼠结肠炎有明显的保护作用,其作用机制可能与激活PPAR-γ信号通路、抑制p38 MAPK的激活、减轻炎症反应、升高结肠组织中MUC2与TFF3的表达水平、参与肠黏膜的修复有关。     

清肠化湿方通过激活AhR/IL-22缓解小鼠溃疡性结肠炎的作用机制研究

目的  通过构建溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)小鼠模型, 从芳香烃受体(AhR)角度, 观察清肠化湿方对白细胞介素-22(IL-22)分泌及黏蛋白-2(MUC-2)与紧密连接蛋白(Claudin4)表达的作用, 阐述其缓解小鼠UC的作用机制。 方法  用DSS构建UC小鼠模型, 每日观察小鼠体质量、粪便形状、隐血情况, 同时进行疾病活动指数(DAI)评分。给药结束后测量小鼠结肠长度,HE染色观察结肠病理情况,qPCR检测结肠组织白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、AhR的mRNA。Western blot检测结肠MUC-2、AhR、细胞色素P4501A1酶(CYP1A1)、IL-22、Claudin4表达水平。 结果  与正常组比较, 模型组小鼠DAI评分上升(P < 0.01), 结肠长度缩短(P < 0.01), 结肠黏膜病理受损情况严重; AhR的mRNA表达下降(P < 0.05), IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表达上升(P < 0.05,P < 0.01);MUC-2、AhR、CYP1A1、IL-22、Claudin4蛋白表达下降(P < 0.05, P < 0.01)。与模型组比较, 美沙拉嗪组、清肠化湿方组DAI评分降低(P < 0.01), 结肠长度变长(P < 0.01), 结肠黏膜病理情况改善; IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表达下降(P < 0.05,P < 0.01);MUC-2、CYP1A1、Claudin4蛋白表达升高(P < 0.01)。与模型组比较, 清肠化湿方组AhR的mRNA表达上升(P < 0.05),AhR、IL-22蛋白表达升高(P < 0.01)。与清肠化湿方组比较, 清肠化湿方+TMF组小鼠DAI评分上升(P < 0.01);结肠长度缩短(P < 0.05);结肠黏膜病理受损情况严重; IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表达上升(P < 0.01);MUC-2、AhR、CYP1A1、IL-22、Claudin4蛋白表达下降(P < 0.01)。 结论  清肠化湿方能够激活AhR, 上调CYP1A1表达, 促进IL-22生成, 抑制炎症水平, 同时增加MUC-2及Claudin4的表达, 从而缓解UC。      

肠愈宁对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织claudin-1、ZO-1、occludin蛋白表达的影响

  目的  探讨肠愈宁对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠结肠组织紧密连接(TJ)关键蛋白咬合蛋白(occludin)、闭合蛋白-1(claudin-1)、带状闭合蛋白-1(ZO-1)表达的影响。   方法  将60只健康雄性SD大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、肠愈宁组、美沙拉嗪组,每组各15只。采用2, 4, 6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇复合液(100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 mL)一次性灌肠制备UC大鼠模型,造模成功后,药物干预7 d。光镜下观察大鼠结肠组织病理形态学变化,透射电镜观察大鼠结肠黏膜超微结构,免疫荧光染色法观察大鼠结肠组织occludin、claudin-1、ZO-1蛋白荧光强度。   结果  光镜与电镜观察显示,模型对照组大鼠结肠黏膜充血、水肿,炎症渗出明显,细胞间紧密连接断裂;而经肠愈宁干预后,大鼠结肠黏膜病理状态明显改善,细胞间紧密连接少部分断裂。免疫荧光染色结果显示,模型对照组大鼠结肠组织claudin-1、ZO-1、occludin蛋白荧光强度(0.11±0.01、0.11±0.01、0.09±0.01)较空白对照组明显降低(0.14±0.01、0.15±0.03、0.13±0.00,均P＜0.05);经肠愈宁干预后,大鼠结肠组织claudin-1、ZO-1、occludin荧光强度较模型对照组明显升高(0.13±0.00、0.14±0.02、0.12±0.01,均P＜0.05)。   结论  肠愈宁可通过上调TJ关键蛋白claudin-1、ZO-1、occludin的表达修复结肠黏膜损伤,治疗UC。      

清肠化湿方对实验性大鼠结肠炎结肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白claudin-1的影响

目的 观察清肠化湿方对实验性大鼠结肠炎结肠组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α），紧密连接跨膜蛋白claudin-1表达水平的影响，以探讨其治疗溃疡性结肠炎(UC)的可能机制。方法 使用TNBS/无水乙醇造模成功后，分为空白组、模型组、清肠化湿方组12.8 g/(kg·d）、美沙拉嗪组（0.67 g/（kg·d）。一次性ig给药，连续10 d后，处死大鼠，留取结肠组织；ELISA法检测结肠组织TNF-ａ水平，免疫组化法观察结肠上皮claudin-1蛋白的表达情况，实时荧光定量PCR法检测claudin-1 mRNA相对表达水平。结果 清肠化湿方可以降低大鼠结肠炎模型结肠组织TNF-α水平[模型组，清肠化湿组分别为（99.40±32.37），（55.07±12.80）pg/mL]，（P<0.01），提高claudin-1 mRNA相对表达水平[模型组，清肠化湿组分别为(2.18±0.78)，(3.94±0.91)]（P<0.01），减轻对claudin-1蛋白的损伤（P<0.05），清肠化湿方组与美沙拉嗪组疗效无明显差异。结论 清肠化湿方降低结肠组织TNF-α水平，保护紧密连接蛋白claudin-1，是其治疗UC的机制之一。     

溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜E1、UBC5、E3RSIκB mRNA与蛋白表达的影响

【目的】观察溃结灵对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠结肠黏膜泛素—蛋白酶体系统组分UBE1(E1)、UBC5(E2)、E3RSIκB(E3)基因和蛋白表达的影响。【方法】选用SD大鼠,随机分为6组:正常组,模型组,溃结灵高、中、低剂量组(剂量分别为18.3、9.2、4.6 g·kg-1·d-1),阳性对照组(柳氮磺胺吡啶,剂量为0.5 g·kg-1·d-1);采用三硝基苯磺酸(TNBS)法复制UC大鼠模型并进行不同剂量药物干预。采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测结肠黏膜E1、UBC5和E3RSIκB基因表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测结肠黏膜E1、UBC5和E3RSIκB蛋白含量。【结果】模型组大鼠结肠黏膜组织E1、UBC5 mRNA和蛋白相对表达量与正常组比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05),溃结灵各剂量组E1、UBC5mRNA和蛋白相对表达量(除溃结灵高剂量组UBC5蛋白表达外)与模型组比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05);模型组大鼠结肠黏膜组织E3RSIκB mRNA相对表达量显著高于正常组(P﹤0.05),溃结灵高、中剂量组E3RSIκB mRNA相对表达量显著低于模型组(P﹤0.05);模型组大鼠结肠黏膜组织E3RSIκB蛋白相对表达量显著高于正常组(P﹤0.05),溃结灵高、低剂量组E3RSIκB蛋白相对表达量显著低于模型组(P﹤0.05或P﹤0.01)。【结论】溃结灵抗UC作用的机理可能与抑制E3RSIκB的表达,阻止IκB的泛素化降解,进而抑制NF-κB的活化,减轻炎症反应有关。     

益气托毒活血中药复方对溃疡性结肠炎大鼠肠道黏膜屏障的影响

目的:探讨益气托毒活血中药复方对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白的调控,及对肠黏膜屏障可能的保护机制.方法:健康成年SD大鼠52只,7只作为正常对照组,剩余45只大鼠采用TNBS法制作溃疡性结肠炎(UC)大鼠模型,第3天随机抽取2只解剖,观察造模是否成功,余下的43只大鼠分为模型组13只,柳氮磺吡啶片(SASP)组l5只,中药组15只,灌胃治疗10 d后观察病理形态学并进行疾病活动指数(DAI)、结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分,用EILSA法测定血清内毒素,用免疫组化法测定紧密连接(tight junction,TJ)相关蛋白咬合蛋白(Occludin)表达.结果:TNBS法诱导大鼠结肠炎后,DAI和CM-DI评分增高,血清内毒素(LPS)水平增高,结肠黏膜Occludin蛋白下降;SASP及中药均能降低UC大鼠DAI和CMDI评分,降低血清LPS水平,上调结肠黏膜Occludin蛋白表达,差异均有统计学意义(P＜0.05);与SASP组相比,中药组DAI评分较低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:益气托毒活血复方是治疗UC的有效方法,其可能通过上调肠黏膜Occludin蛋白蛋白表达,改善肠黏膜通透性,抑制内毒素通过紧密连接进入体循环,从而起到对UC大鼠肠黏膜屏障的保护作用.     

慢病毒介导PDIA3过表达对溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜屏障的影响及其机制

目的 探讨蛋白质二硫键异构酶A3(PDIA3)对溃疡性结肠炎(UC)小鼠的保护作用及其可能机制.方法 将60只C57BL/6小鼠随机分成正常对照组(Control组)、模型组(Model组)、空载慢病毒组(Lv-NC组)和PDIA3过表达慢病毒组(Lv-PDIA3组),每组15只.采用连续7d自由饮用3％葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液建立UC小鼠模型,造模成功后开始注射慢病毒干预.慢病毒干预7d后结束实验,对各组小鼠进行疾病活动指数(DAI)评分,HE染色观察结肠组织病理学变化,ELISA法检测血清中炎症因子白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及肠黏膜屏障通透性标志物D-乳酸(D-Lac)、二胺氧化酶(DAO)含量,qRT-PCR检测结肠组织中PDIA3 mRNA水平,Western blot检测结肠组织中PDIA3、ZO-1、Occludin、Claudin-1、IκBα、p-NF-κB p65 (Ser536)、NF-κB p65蛋白表达水平.结果 与Control组比较,Model组小鼠结肠组织受损严重,DAI评分、血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、D-Lac、DAO含量以及结肠组织中IκBα和p-NF-κB p65 (Ser536)蛋白表达水平均升高,而ZO-1、Occludin和Claudin-1等蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P＜0.01);与Model组比较,Lv-PDIA3组小鼠结肠组织受损程度减轻,DAI评分、血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、D-Lac、DAO含量以及结肠组织中IκBα和p-NF-κB p65(Ser536)蛋白表达水平降低,同时ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白表达水平增加,差异有统计学意义(P＜0.01),而Lv-NC组差异无统计学意义.结论 过表达PDIA3能明显改善UC小鼠肠黏膜屏障功能,其机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活有关.     

柳氮磺胺吡啶对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜上皮PPARγ表达的影响

目的　观察柳氮磺胺吡啶 (SASP)对溃疡性结肠炎 (UC)大鼠结肠黏膜上皮过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达的影响。方法　应用复合法 (2 ,4 -二硝基氯苯 乙酸 )制备细胞免疫反应性UC大鼠模型 ,SASP药物治疗后 ,采用免疫组化法检测对照组大鼠、UC组大鼠及SASP治疗组大鼠结肠黏膜中PPARγ的表达情况。结果　UC大鼠、SASP组大鼠和对照组大鼠结肠黏膜上皮PPARγ阳性细胞个数分别为 11 7± 3 4 6 ,5 7 0±8 4 2 ,81 8± 15 73,UC大鼠结肠黏膜上皮PPARγ的表达经统计学处理明显低于对照组和SASP治疗组 (P <0 0 0 1) ,对照组和SASP治疗组无显著差异 (P >0 0 5 )。结论　UC大鼠结肠黏膜上皮PPARγ的表达减少 ,SASP治疗后可以明显增加UC大鼠结肠黏膜上皮PPARγ的表达 ,提示SASP对UC的治疗作用可能与PPARγ途径有关。     

清肠栓脐贴调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻小鼠溃疡性结肠炎

目的:研究清肠栓脐贴对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)小鼠的作用,并基于Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)/核因子-κB(NF-κB)信号通路探讨其作用机制。方法:取40只雄性Balb/c小鼠,采用3.5%DSS自由饮用连续7 d的方法制备UC模型,另取10只小鼠作为正常组。造模7 d后,造模小鼠随机分为模型组、美沙拉嗪组、清肠栓方组和清肠栓脐贴组,每组10只。美沙拉嗪组灌胃给予0.1 g/kg美沙拉嗪溶液;清肠栓方组和清肠栓脐贴组分别采用灌胃和脐贴方式给予0.118 g/kg清肠栓生药;正常组和模型组灌胃给予等量0.9%NaCl溶液。均每日1次,连续9 d。造模期间,观察小鼠的一般活动和排便情况,计算疾病活动指数(DAI)。末次给药后采集血液和结肠样本,HE染色后光镜下观察各组结肠组织的病理学变化;ELISA检测血清TNF-α和IL-6水平,PCR检测结肠组织TNF-α、IL-6、IL-1β基因表达,Western blot检测结肠组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达。结果:①造模第7天,造模小鼠均出现明显血便,且精神萎靡、体质量明显下降;DAI评分较正常组显著升高(P0.01)。②结肠组织病理观察显示,与正常组比较,模型组小鼠结肠上皮组织部分缺损,腺管萎缩或消失,结构紊乱,杯状细胞减少,炎症细胞浸润严重。美沙拉嗪组、清肠栓方组、清肠栓脐贴组小鼠结肠黏膜及黏膜下层可见少量炎症细胞浸润,病变程度较模型组明显减轻。③与正常组比较,模型组小鼠血清IL-6和TNF-α水平显著升高(P0.01);与模型组比较,美沙拉嗪组、清肠栓方组、清肠栓脐贴组血清IL-6和TNF-α水平显著降低(P0.05,P0.01)。不同药物组间比较,差异无统计学意义(P0.05)。④与正常组比较,模型组小鼠结肠TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平及TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显著升高(P0.01);与模型组比较,美沙拉嗪组、清肠栓方组、清肠栓脐贴组结肠TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平及TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显著下调(P0.01)。不同药物组间比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论:清肠栓脐贴可明显改善UC小鼠的一般活动及排便情况,减轻肠道黏膜上皮损伤和炎症浸润,其作用机制与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。