DinB基因的超表达短期内可显著降低大肠杆菌的死亡率

[目的]探讨大肠杆菌dinB基因在进化上的选择优势.[方法]应用竞争共培养和超表达的策略,测定共培养后含dinB基因的目的菌株和对照菌株的生长优势.第1组为含质粒pUC-dinB-rrnb的E.coli AB1157＋含质粒pUC-dinBR-rrnb的E.coli YG7207;第2组为含质粒pUC-dinB-rrnb的E..coli AB1157＋含质粒pUC-phoE-rrnb的E.coli YG7207;第3组为含质粒pUC-phoE-rrnb的E.coli AB1157＋含质粒pUC-dinBR-rrnb的E.coli YG7207;第4组为卡那霉素抗性（K^＋）菌株YG7207与无卡那霉素抗性菌株AB1157.[结果]第4组中,卡那霉素抗性菌株YG7207与无卡那霉素抗性菌株AB1157在培养物中的比例保持着良好的稳定.第1组和第2组混合培养中,K^＋抗性的菌株在培养物中的比例急剧下降,并很快接近或等于0;第3组培养物中,K^＋菌株（YG7207）的比例呈明显上升.[结论]超表达dinB基因的大肠杆菌菌株的生长优势不是由于对数期的生长速率提高所造成,对数后期细胞死亡率降低应该是超表达dinB基因的大肠杆菌菌株的生长优势的主要原因.     

分泌表达人IL-12基因重组卡介苗菌株的构建和筛选

目的 筛选获得分泌表达人白介素12(IL-12)的基因重组卡介苗菌株.方法 采用PCR反应从pORF-h IL-12载体中扩增得到人IL-12基因的完整序列,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌(E.coli-BCG)穿梭载体pMV361中,构建含人IL-12基因的重组质粒rpMV-IL-12.将纯化的rpMV-IL-12电穿孔转化卡介苗(BCG),通过卡那霉素抗性筛选、基因组PCR方法进行初步鉴定,再经热休克诱导表达后,分别收集培养上清液和细菌沉淀,进行SDS-PAGE分析,筛选得到IL-12基因重组BCG(rBCG-12).结果 成功构建含人IL-12基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒rpMV-IL-12,测序结果与GenBank收录序列一致,未发生突变.rpMV-IL-12电穿孔转化BCG,经卡那霉素抗性筛选及基因组DNA的IL-12目的 片段PCR扩增筛选得到rBCG-12重组菌.rBCG-12热休克诱导表达后的SDS-PAGE电泳,从培养上清液中检测到相对分子质量为70×103的蛋白质条带,而细菌沉淀中未见到特异性条带.结论 分泌表达人IL-12蛋白的重组BCG菌株构建、筛选成功.     

牙龈卟啉单胞菌FtsZ降解试验模型-clpP基因缺失株的构建

目的 建立牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZ （FtsZPg）体内降解试验模型,即构建蛋白酶编码基因clpP缺失的E.coli MG1655.方法 将一段两端含靶基因同源臂的PCR产物电转入L-阿拉伯糖诱导后表达λ噬菌体重组蛋白、具有较强重组能力、含质粒pKD46的菌株E.coli MG1655感受态细胞,以PCR产物中的氯霉素抗性基因替代靶基因.结果 利用氯霉素抗性平板筛选阳性重组体,得到E.coli MG1655的ClpP蛋白酶基因敲除突变株.通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序最终鉴定阳性clpP基因缺失株.结论 本试验成功构建了E.coli MG1655 clpP敲除株;该敲除株有望在探讨重要牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZPg与蛋白酶clpP的关系中发挥一定作用.     

表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒的构建

目的构建1个含有luxS基因上、下游片段、抗卡那霉素基因的重组克隆质粒,用以敲除表皮葡萄球菌luxS基因。方法检索GenBank获得luxS基因序列以设计引物,以生物膜阳性表皮葡萄球菌基因组DNA为模板,采用高保真PCR扩增得到包含luxS基因上游片段、完整的luxS基因和luxS基因下游片段的长片段DNA;以pEASYT4质粒为模板扩增得到抗卡那霉素基因,再用内侧引物分别扩增luxS基因上、下游序列,按luxS基因上游片段＋抗卡那霉素基因＋luxS基因下游片段的顺序重组连接,转化JMl09感受态细胞,通过卡那霉素筛选、酶切分析和PCR一测序验证luxS基因敲除的重组克隆载体。结果经酶切后电泳验证重组质粒中各目的片段插入无误,PCR检测结果证明重组质粒luxS基因缺失,测序结果显示碱基无错配,含目的基因的重组质粒菌株在含卡那霉素培养平板内正常生长,证明插入的抗卡那霉素基因表达良好。结论表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒构建成功,为后续luxS基因缺陷株的构建奠定了基础。     

抗生素持续作用下细菌传代次数对接合频率的影响

目的探究抗生素作用下细菌传代次数对接合频率的影响及其可能机制。方法将本实验室构建的携带庆大霉素(GM)抗性基因的质粒p UCP24T转入E.coli SM10λpir获得重组菌E.coli SM10λpir(p UCP24T)。将重组菌在含30μg/m L GM的琼脂平板上不断传代,每次挑取单个菌落传代,获得第50代和100代的E.coli SM10λpir(p UCP24T)。分别以铜绿假单胞菌PAO1、大肠埃希菌EC600和肺炎克雷伯菌A10为受体菌,第1、50、100代E.coli SM10λpir(p UCP24T)为供体菌进行接合实验,计算接合频率。采用微量肉汤稀释法检测第1、50、100代E.coli SM10λpir(p UCP24T)对GM的最低抑菌浓度(MIC)值。分别提取第1、50、100代E.coli SM10λpir(p UCP24T)的全基因组DNA,构建DNA文库并进行高通量测序,对测序结果进行生物信息学分析。结果成功获得重组菌E.coli SM10λpir(p UCP24T)。第50、100代E.coli SM10λpir(p UCP24T)与三种受体菌的接合频率较第1代均显著增高(P0.05),第100代菌株对GM的MIC值大于2 048μg/m L,较第1和第50代菌株对GM的MIC值1 024μg/m L升高。第1、50、100代E.coli SM10λpir(p UCP24T)重组菌中携带GM抗性基因的p UCP24T质粒的拷贝数分别为601.3、1 808.2及9 190.5,呈现增高的趋势。结论在抗生素持续作用下,E.coli SM10λpir(p UCP24T)通过增加耐药质粒拷贝数使接合频率及MIC值升高,以适应抗生素的持续作用。     

pTn5GFP转座质粒用于耐药鲍曼不动杆菌生物被膜相关基因的研究

【立论依据】 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)是一种革兰氏阴性球杆菌,是引起院内感染的主要菌种之一,多重耐药和泛耐药AB菌株感染更是给临床治疗带来极大的困难。生物被膜形成能力与AB耐药以及致病性密切相关。寻找AB生物被膜形成的关键基因对于AB相关疾病的预防和控制具有重要意义。转座子是一段特殊的DNA片段,在转座酶的作用下,可随机插入细菌基因组,使插入基因失活,改变相关表型。应用转座子随机突变策略可以找出特定表型对应的基因,但是以传统的抗生素抗性基因作为报告基因显然不能满足对多重耐药菌株的研究。 【设计思路】 绿色荧光蛋白(GFP)因为不需要单独加入底物并且易于观察而被广泛用来标记生物分子或细胞。已有研究表明,GFP基因插入细菌的染色体上后,可以有效地对细菌进行标记。基于转座质粒以及GFP的特点,本研究拟构建具有Tn5转座子和GFP基因的pTn5GFP转座质粒,利用GFP作为报告基因,构建临床分离的多重耐药AB突变文库,进而筛选出AB生物被膜形成的关键基因,并对其功能进行研究。 【实验内容】 以pGFPmut3.1质粒为模板,扩增GFP基因,将其连接入含有Tn5转座子的pRL27质粒,构建pTn5GFP转座质粒。利用该质粒对多重耐药AB菌株进行转座子突变,构造突变文库。对突变株的生物被膜情况进行分析,确定转座子插入位点,找出生物被膜形成的关键基因,并对其功能进行研究。 【材料】 临床多重耐药AB两株,R005和R036,自北京大学人民医院获得。常用工具菌E.coli CC118λπ和E.coli DH5α。pRL27和pGFPmut3.1质粒由原实验室毕业研究生提供。 【可行性】 已成功构建了pTn5GFP转座质粒,该质粒在容纳菌株E.coli CC118λπ具有绿色荧光表型,并已通过预实验初步确定了两株多重耐药AB生物被膜形成能力和最适实验条件。 【创新性】 本研究将GFP报告基因的便捷性以及转座质粒的转座性结合起来,有效解决了因耐药性而无法对泛耐药菌株构建突变文库的问题,结果直观,易于筛选,可行性高。     

鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因在大肠杆菌中的克隆表达

目的：利用 DNA 重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因。方法根据查找文献及基因比对选取了鼠疫菌重要功能蛋白-YopD 蛋白。利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中进行表达。根据云南玉龙菌株（D106004）全基因组序列设计引物,PCR 扩增目的基因片段。采用 pET-32a（＋）作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒。IPTG 诱导,使重组质粒在其宿主菌 E ．coli BL21（DE3）中表达。结果在大肠杆菌中成功获得了融合表达蛋白,即重组 YopD 蛋白。结论以质粒 pET-32a（＋）作为表达载体,鼠疫菌重要功能蛋白 YopD 能够在大肠杆菌 E ．coli BL21（DE3）中稳定高效地表达,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。     

外源性指导序列体外转换临床大肠杆菌氯霉素抗性表型的实验研究

目的 研究外源性指导序列(EGS)体外逆转临床分离大肠杆菌氯霉素抗性的能力。方法 构建针对氯霉素(Cm)乙酰转移酶(cat)并含卡那霉素(Km)抗性基因筛选指标的：EGS重组质粒以及只含Km抗性基因但不含EGS的对照质粒。采用CaCl2方法将重组质粒导入临床分离的耐Cm大肠杆菌株中。通过质粒抽提、菌落PCR鉴定EGS阳性克隆子,分光光度计A600检测导入EGS质粒后耐Cm菌株在液体培养基中的生长率以及KB法检测在固体培养基中的药物敏感试验,探讨EGS分子逆转耐药菌的逆转效应。结果 以pEGFP-CI-EGS cat1 cat2重组质粒对16株临床分离的Cma大肠杆菌供试菌进行转化试验,EGS转化子在含Km的培养基上筛选。其中4株转化菌在Cm100～200μg／ml的液体培养基中生长受抑;在Cm 100～200μg／ml的固体培养基中药敏试验对Cm敏感;转化菌质粒抽提检测出特异EGS条带;菌落PCR扩增鉴定存在EGS。表明16株供试菌中4株临床分离株获得了耐药菌型的表型转换、耐Cm的大肠杆菌临床分离株恢复了对Cm的敏感性。结论 EGS分子具有逆转临床耐药菌为敏感菌的能力。     

含产气荚膜梭菌肠毒素基因重组质粒pET-28a-CPE的构建和表达

目的 构建含全长产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)基因的重组表达质粒pET-28a-CPE并进行原核表达.方法 培养并提取表达肠毒素的产气荚膜梭菌标准菌株64615的基因组DNA,PCR扩增出全长CPE基因片段并连接入pET-28a载体质粒中,构建重组原核表达质粒pET-28a-CPE,进行酶切及测序鉴定,并转化入感受态大肠杆菌(E.coli)BL21中,用IPTG诱导CPE表达.结果 复苏、培养成功产肠毒素的产气荚膜梭菌标准菌株64615,成功构建了表达质粒pET-28a-CPE,经酶切及测序鉴定结果 与设计的完全相符,成功用E.coil BL21进行了原核表达,目的 蛋白CPE占总表达蛋白45.37%.结论 本实验成功构建并表达了含CPE的重组质粒pET-28a-CPE,为进一步观察CPE时前列腺肿瘤等的生物学作用奠定了基础.     

变形链球菌耐氟菌株eriCF基因差异性表达及其意义

目的：探讨不同氟浓度条件下eriC^F1和eriC^F2基因对变形链球菌（S.mutans）耐氟菌株UA159-FR氟抗性的影响,阐明eriC^F基因差异性表达与S.mutans耐氟菌株抗性的关系。方法：重组大肠杆菌感受态细胞BL21分为eriC^F1组（eriC^F1+Peasy-Blunt E2）、eriC^F2组（eriC^F2+Peasy-Blunt E2）和KZ组（Peasy-Blunt E2）。基因克隆和IPTG诱导后,检测3组EriC^F1和EriC^F2蛋白表达水平,并分别测定3组菌株在不同氟环境（1.5、2.0、2.5和3.0 g·L^-1氟化钠）下的菌液浓度和菌株生长速度,绘制菌株的生长曲线。结果：在对数期（8 h）和稳定期（16 h）,3组菌株在不同氟环境下（1.5、2.0、2.5和3.0 g·L^-1氟化钠）的菌液终浓度及菌株生长速度组内比较,3组菌株菌液终浓度和生长速度均随着氟化钠浓度升高而降低;组间比较,相同氟化钠浓度条件下,菌液终浓度和生长速度均为eriC^F2组 > eriC^F1组 > KZ组（P<0.05或P<0.01）;与eriC^F1组比较,eriC^F2组菌液浓度均明显升高（P<0.01）。结论：eriC^F1和eriC^F2基因均能增强大肠杆菌的氟抗性,且表达eriC^F2基因比表达eriC^F1基因的大肠杆菌的氟抗性更强。     

细菌对苯噻唑力复霉素的耐药性与细菌膜屏障的关系

用EDTA处理对苯噻唑力复霉素耐药的大肠杆菌后,[~3H]-苯噻唑力复霉素掺入菌体的量增加,耐药菌对该药的敏感性提高,苯噻唑力复霉素抑制[~3H]-尿嘧啶核苷掺入菌体的作用增强。金色葡萄球菌和大肠杆菌的敏感菌株掺入[~3H]-苯噻唑力复霉素的量均明显高于耐药菌株。提示细菌对苯噻唑力复霉素的耐药性与细菌对该药的通透性下降有关。     

Response of gnotobiotic pigs to Escherichia coli

In a study of the response of gnotobiotic pigs to coliform infections, 45 one-week-old germfree pigs were divided into five groups and each group was inoculated orally with a different strain of Escherichia coli. Three of these were enteropathogenic swine strains, P307[08:K87(B), K88 a,b (L):H19]; P570 [0138:K81]; P568[0141:K85a,b(B), K88a,b(L):H4], one was a virulent human strain, H224, [026:K60(B6)], and one was a non-enteropathogenic swine strain, P581[OX13:K68]. It was attempted to protect a portion of the pigs with orally administered specific antisera and sera from non-immunized specific pathogenfree (SPF) pigs. Observations were made on the clinical response, bacterial counts of feces and intestinal contents, gross pathological changes, distribution of the organisms in organs and serum hemagglutinin titers.Infection with E. coli P307 resulted in diarrhea, dehydration and death, unless the pig was protected with specific antiserum. The pigs infected with E. coli P570 had a transient diarrhea but retained their appetites and recovered. Those infected with the other three strains remained healthy throughout. No circulating hemagglutinating antibody against the test strains of E. coli could be detected in any of the pigs seven days or earlier post-inoculation.Relationship could not be established between the numbers of viable E. coli in the feces and the presence of clinical colibacillosis. Orally administered specific antiserum afforded protection against strain P307, but did not reduce the number of E. coli in the gut or alter their distribution in the internal organs. This suggested that the protective effect of specific antibody in the intestine was due to its action on a metabolite (enterotoxin) produced by E. coli P307 rather than the organism itself.     

从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中检出质粒介导的AmpC DHA-1型β内酰胺酶基因

目的 了解产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药性和基因型.方法 收集2002年1月-2004年5月间我院呼吸科临床标本中分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共110株,用酶提取物三维试验检测AmpC酶;用等电聚焦电泳、耐药质粒电转化试验、聚合酶链反应(PCR)及测序确定AmpC酶基因型.结果 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中AmpC酶检出率分剐为9.30%和4.48%.药敏试验显示产酶株对头孢西丁全部耐药,对第三代头孢菌素、酶抑制剂、氨曲南、阿米卡星及环丙沙星均有不同程度耐药,对头孢吡肟及亚胺培南较敏感.7株产AmpC酶菌株中有5株通过电转化试验可将头孢西丁耐药性传递给受体菌,经PCR扩增和测序证实为质粒介导DHA-1型AmpC酶.结论 我院临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中已经出现产质粒介导AmpC酶菌株,其耐药性能够水平传播,给临床抗感染治疗带来重大威胁.     

超广谱β-内酰胺酶的检测及耐药性分析

目的 :了解产超广谱 β-内酰胺酶 (ESBL)肺炎克雷白杆菌、大肠埃希氏杆菌、阴沟肠杆菌的发生率、耐药性及耐药特点 ,指导用药。方法 :应用双纸片协同试验法对从临床感染标本中分离出的 2 1 5株革兰氏阴性菌作 ESBL的检测 ,比较亚胺培南等 1 4种抗生素对产 ESBL耐药菌体外抗菌作用。结果 :产 ESBL耐药菌占全部分离菌的 3 4.4% ,其中 ,大肠埃希氏杆菌占 47.3 % ,肺炎克雷白杆菌占 2 8.4% ,阴沟肠杆菌占 2 4.3 %。各类细菌中产 ESBL所占的比例分别是 ,大肠埃希氏杆菌为 3 1 .8% (3 5 /1 1 0 ) ,肺炎克雷白杆菌为 3 9.6% (2 1 /5 3 ) ,阴沟肠杆菌为 3 4.6% (1 8/5 2 )。在产 ESBL菌中 ,有 3株大肠埃希氏杆菌及 2株肺炎克雷白杆菌均同时对头孢噻肟和头孢他啶敏感。亚胺培南对产 ESBL耐药菌均表现出最强的抗菌作用 ;头孢西丁对产 ESBL肺炎克雷白杆菌及大肠埃希氏杆菌呈现出较好的抗菌作用。产 ESBL耐药阴沟肠杆菌对头孢西丁全部耐药 ;氨基糖苷类、氟喹诺酮类及磺胺类药物对产 ESBL肺炎克雷白杆菌、大肠埃希氏杆菌、阴沟肠杆菌有较高的交叉耐药性。结论 :对产 ESBL耐药菌感染不容忽视 ,对此类感染的治疗亚胺培南可作为首选。     

动物粪便中肠道出血性大肠杆菌PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速检测动物源性肠道出血性大肠杆菌的PCR方法。【方法】按照华大基因公布的检测肠道出血性大肠杆菌的方法,应用PCR的方法检测腹泻动物粪便中分离到的大肠杆菌Stx2-2基因和AFF-I-2基因。【结果】在分离到的45株大肠杆菌中,Stx2-2基因阳性菌株有7株,AFF-I-2基因阳性菌株有22株,其中2种基因阳性菌株有2株,其血清型分别为O142和O127:K63。【结论】成功建立了快速检测动物源性肠道出血性大肠杆菌的PCR方法。     

四种膳食纤维抗大鼠脂肝作用的初步形态定量分析

The results of our experiment in vitro showed that the activity of standard RNA polymerase decreased while the concentration of RFD and RFP increased, indicating that the target site of action of RFD was similar to that of RFP on RNA polymerase. Incorporation of [3H] UR into the RNA of sensitive cells of S. sureus and E. coli was strongly inhibited by RFD, but RFD did not affect the resistant strains. In purified DNA-dependent RNA polymerase of sensitive and resistant strains, the enzyme activity of sensitive E. coli a S. aureus strains was inhibited by RFD, but RFD did not inhibit that of the resistant strains (except the P. vulgaris). It can be concluded that a decreased susceptibility of RNA polymerase to RFD as well as a decreased permeability of bacterial envelope may induce bacterial resistance to the drug.     

肠杆菌基因间重复一致序列-聚合酶链反应技术在大肠埃希菌基因分型中的应用研究

目的 应用ERIC-PCR技术对致尿路感染大肠埃希菌进行基因分型。方法 收集大肠埃希菌致尿路感染患者标本24例，以ERIC序列为引物结合位点，PCR扩增致病大肠埃希菌基因组。结果 24例菌株中23例得到阳性扩增，ERIC-PCR绘制的基因组指纹图条带清晰可辨且有一定的复杂度。结论 ERIC-PC技术可用于大肠埃希菌的基因分型，能够有效地鉴别不同的菌株。     

Accumulation of ciprofloxacin and lomefloxacinin fluoroquinolone-resistant st rains of Escherichia coli

目的：研究膜孔蛋白OmpF缺失和主动外排在耐药大肠杆菌蓄积亲水性氟喹诺酮环丙沙星、洛美沙星中的作用和意义。方法：菌体内药物蓄积量和主动外排的作用采用荧光测定法;细菌膜孔蛋白以SDS-PAGE分析。研究的菌株包括大肠杆菌K-12膜孔蛋白缺失突变株JF701(OmpF^ )、JF703(OmpC^ );敏感株Ecs及其实验室诱变耐药株R2、R256,临床分离耐药株R5、R6。结果：Ecs中的药物蓄积稳态浓度与JF701一致,较JF703高1/3（环丙沙星）或1/2（洛美沙星）,但JF703仍对氟喹诺酮敏感;而耐药菌中的药物蓄积量除R2稍高于JF703外,较敏感菌低2-10倍。加入DNP后,两个药物的蓄积量均增高,尤其耐药株的升高显,表达这些菌株的主动外排（泵）系统功能明显增强。膜孔蛋白检查发现,Ecs株有OmpF和OmpC,R2、R256缺失OmpF,R5、R6缺失OmpC。结论：大肠杆菌减少对亲水性氟喹诺酮的蓄积量涉及OmpF缺失和主动外排（泵）,而后可能是一重要因素。     

Antibacterial activity of antisera against homologous and heterologous Escherichia coli of porcine origin.

Fourteen enteropathogenic and five nonenterotoxigenic Escherichia coli strains isolated from pigs were used for producing antisera in rabbits and pigs. These antisera were used in an vitro test system for antibacterial activity against homologous and heterologous porcine E. coli strains. Antibacterial titres were determined against the homologous strains and the percent reduction in CFU/ml caused by a 1/200 dilution of the sera against heterologous strains was determined. The results indicated that following immunization the antibacterial activity of serum against homologous and heterologous strains was significantly increased. This activity did not appear to be influenced by O and K antigen relationships among the organisms or by enterotoxigenicity of the vaccine strains. When antiserum produced against a combination of three enteropathogenic E. coli was tested against 20 strains a wider spectrum of heterologous antibacterial activity was obtained than with antiserum produced against any individual strain. The results indicate the existence in E. coli strains of porcine origin of common antigenic determinants not related to the serological formula and that a selected combination of strains can be expected to induce antibacterial acitivity against a wide variety of serological types of porcine enteropathogenic E. coli.     

细菌耐利福定与RNA多聚酶的关系

以药物梯度平皿筛选得到金黄色葡萄球菌NCTC6571、大肠杆菌NCTC10418及普通变形杆菌1065的耐利福定菌株。利福定能明显抑制~3H-尿苷掺入敏感菌株,而对耐药菌株的RNA合成无明显影响;利福定与利福平对标准RNA多聚酶活性的抑制随着药物剂量的增加而加强;提取及纯化RNA多聚酶,利福定能明显抑制敏感菌的酶活性,而对金黄色葡萄球菌NCTC6571与大肠杆菌NCTC10418耐药菌株的酶活性无明显影响。