两种检测方法对地塞米松诱导小鼠淋巴细胞凋亡的观察

目的 探讨地塞米松体外诱导小鼠脾淋巴细胞凋亡的实验方法,为进一步研究淋巴细胞凋亡对机体免疫调节作用机理及其临床应用提供实验依据.方法 取昆明小鼠,分离其脾脏淋巴细胞制成单细胞悬液,实验组加入地塞米松(DEX)使终浓度为10-5 mol/L,培养24 h后,采用瑞氏染色法光镜下观察凋亡细胞形态,用凝胶电泳法观察其DNA ladder;同时设立不加DEX的对照组及新鲜淋巴细胞对照组.结果光镜观察,淋巴细胞在DEX作用下,可见典型的凋亡形态特征变化,主要表现为细胞核边聚、浓缩,以"齿轮状"细胞改变多见;DNA凝胶电泳图谱呈现典型的凋亡DNA ladder,两种方法结果相符.而未加DEX对照组凋亡细胞明显偏少,新鲜淋巴细胞对照组未见凋亡改变.结论 体外条件下用DEX可高效诱导小鼠脾淋巴细胞凋亡,用瑞氏染色法及DNA凝胶电泳法能准确、快速鉴定凋亡淋巴细胞.     

两种染色方法在胸腹水脱落细胞学诊断中的应用

目的探讨两种染色方法在胸腹水脱落细胞的染色效果不同对脱落细胞学诊断中的影响。方法参照《实用检验医学手册》分别应用Papaflicolaou（巴氏）染色和Wright（瑞氏）染色两种不同的染色方法，显微镜下观察82例胸腹水送验标本的染色效果。结果巴氏染色法能使胞核、胞浆及其中的颗粒受染均好，明晰，清亮，清晰地显示细胞结构，但染液及缓冲液种类多，染色步骤繁琐。瑞氏染色简单、省时，且胞浆及其中颗粒受染良好，不足之处是核染质及核膜的结构不如巴氏染色。结论胸腹水脱落细胞学诊断中可结合实际工作条件选用巴氏染色法或者瑞氏染色。     

TCR Vβ15基因转染外周血单个核细胞体外抗肝癌作用的研究

目的探讨肝癌特异性识别基因TCR Vβ15表达重组体转染外周血单个核细胞后的体外抑瘤作用。方法TCR Vβ15基因表达重组体转染外周血单个核细胞(PBMC),激光共聚焦显微镜观察TCR Vβ15表达情况。淋巴细胞和肿瘤细胞共培养后倒置显微镜观察淋巴细胞诱导肿瘤细胞死亡的情况,MTT法观察淋巴细胞的杀伤活性。结果TCR Vβ15基因转染后的淋巴细胞与未经处理的淋巴细胞相比跨膜蛋白表达增加。倒置显微镜下可见基因转染组肿瘤细胞皱缩,细胞间隙增加。淋巴细胞杀伤活性明显增高,实验组与对照组相比有显著性差异。结论TCR Vβ15基因转染PBMC细胞后可有效表达并明显杀伤肿瘤细胞,导致肿瘤细胞死亡,为该研究方法临床应用提供了实验依据。     

改良瑞氏染液探讨与应用

瑞氏染液是血细胞检查的常规染色液,在临床应用已多年。但是,其新配染液染色效果差及染液沉渣的问题一直未能解决。为此,我们对染液的配制方法进行了改良性探讨,取得了较理想的效果。现报告如下。 1 试剂 1.1 染液配制:称聚乙烯吡咯烷酮1.2g,溶于约400ml甲醇中,加入二甲亚砜60ml,混匀;再加入瑞氏染粉1.5g,最后补甲醇至600ml,摇匀。置棕色瓶,室温保存备用。 1.2 磷酸盐缓冲液:pH6.4～6.8。 2 染色方法及结果 2.1 待涂片干后,加染液数滴,覆盖血膜,固定约1min。 2.2 按1:1加缓冲液与染液混匀,血片染10min,骨髓片染15min。     

大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施

目的改良原代肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage,AM）培养技术,提高AM培养效果。方法SD大鼠,在体支气管灌洗肺获取AM,通过预先注射空气、14号注射器针头回收灌洗液、低速离心、种板前多次吹打等改良措施分离和培养AM。倒置显微镜连续观察AM的形态变化,台盼蓝拒染实验鉴定AM存活率,瑞氏-姬姆萨染色鉴定AM纯度。结果AM体外培养后40 min即见细胞贴壁;2～3天时,细胞形态多样,呈圆形、不规则形、梭形等形态,胞体变大,胞质丰富。台盼蓝拒染实验示AM存活率≥95%,瑞氏-姬姆萨染色示AM纯度≥95%。结论本实验改良了原代AM培养的技术方法,提高了原代AM培养效果。     

刚地弓形虫RH株对小鼠胎盘滋养细胞凋亡的影响

目的 通过研究刚地弓形虫强毒株RH株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞凋亡的影响,初步探讨不同毒力虫株引起病理妊娠的机制.方法 将小鼠胎盘滋养层细胞分别接种于不同细胞培养瓶,对照组加入DMEM培养基孵育,实验组加入相同体积不同数量(2×106/ml、4×106/ml、8×106/ml)弓形虫速殖子培养2、4、8 h,Annexin-V-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测各个时间点细胞凋亡率变化;荧光显微镜观察细胞形态改变情况;Western blot分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达或活性.结果 流式细胞仪检测弓形虫感染后的滋养层细胞凋亡率较对照组有下降趋势(P<0 05),呈量效依赖性,弓形虫数量8×106/ml实验组8 h凋亡率最低,为(15.81±0.19)%;荧光显微镜观察到8 h不同数量实验组滋养细胞凋亡形态改变情况,各组均有典型的早期凋亡细胞:细胞膜着绿色,细胞核拒染.随着弓形虫感染数量增加,凋亡细胞数目有所减少.Western blot 检测刚地弓形虫RH株作用于滋养层细胞8 h后实验组的Bax、Bcl-2蛋白表达较对照组分别有明显的降低与升高(P<0.05).结论 刚地弓形虫RH株可抵抗体外培养的孕期小鼠滋养细胞正常凋亡,其机制可能与滋养细胞Bax表达下调和Bcl-2表达上调有关.     

桦褐孔菌提取物对人胃癌BGC-823细胞株的抑制增殖及诱导凋亡作用

[目的]观察桦褐孔菌提取物对人胃癌BGC-823细胞株的抑制增殖及诱导凋亡作用.[方法]选用人胃癌细胞株BGC-823进行体外培养,用MTT法测定桦褐孔菌提取物对BGC-823细胞株的增殖抑制率,应用倒置显微镜、HE染色光学显微镜、AO/EB双染色荧光显微镜及透射电子显微镜等仪器观察桦褐孔菌提取物对肿瘤细胞形态结构的影响.[结果]10,20,40,80 mg/L桦褐孔菌提取物对胃癌BGC-823细胞株有抑制增殖作用,且表现出浓度依赖关系.HE染色在光学显微镜下可见桦褐孔菌组肿瘤细胞体积变小、变圆,核染色质浓缩或形成块,部分细胞膜形成凋亡小体;在倒置显微镜下可见桦褐孔菌组肿瘤细胞体积变小、变圆,核染色质凝集,细胞间连接疏松,贴壁能力明显减弱;在AO/EB双染色荧光显微镜下可见桦褐孔菌组肿瘤细胞胞核染色质呈橘红色,胞质内的橘红色或橘黄色荧光消失,细胞周围有呈亮绿色的荧光凋亡小体;在透射电子显微镜下可见80 mg/L桦褐孔菌提取物组肿瘤细胞核染色质固缩边集,胞质内可见有空泡,凋亡小体凸出于细胞表面.[结论]桦褐孔菌提取物可抑制人胃癌BGC-823细胞株的增殖,诱导肿瘤细胞凋亡.     

小鼠胸腺实质内凋亡细胞分布的观察

目的：探讨非生理条件对细胞凋亡的影响。方法：采用ＨＥ和ＤＮＡ染色的方法，在４℃组织培养条件下观察了小鼠胸腺实质内凋亡细胞的分布。结果：胸腺皮质、髓质内均有发生典型核形态改变的细胞，其细胞核的形态大小不一，具有这种核形态改变的细胞随体外培养时间的延长而增多。结论：体外非生理环境培养可诱导胸腺实质内各种细胞凋亡和坏死     

曲利本兰在E玫瑰花实验中的应用

目的　进一步提高E玫瑰花染色效果。方法　常规制备好的标本片置室温 ,实验组以 1%曲利本兰染液染色 ,对照组以瑞氏、瑞一姬氏、美兰染液分别染色。结果　实验组比对照组所染花结清晰 ,背景干净。结论　曲利本兰染液稳定 ,不发生沉淀 ,染色效果理想。     

血涂片的双重染色法的改良

掌握血涂片地混合染色法是用瑞氏-姬姆萨混合进行染色。两种染料混合极易产生沉淀，染液表面易形成一层氧化膜，沉淀物质沉积于血涂片上，不易冲洗干净，影响观察。而且混合液相互反应，红细胞不易着色，影响染色效果。我们经过一段时间代反复摸索和实验，对血涂片地混合染色进行改良，采用瑞氏与姬姆萨双重染色，取得了满意的效果，达到教学的要求。1方法门）新鲜血涂片自然晾干，（）瑞氏染液染色5min，蒸馏水冲洗数逾；门儿05％乙酸分色2～3S，蒸馏水冲洗两遍，（）稀释了的垃姆萨染色液染色10min，蒸馏水冲洗数逾，吹干，（5）无水酒精…     

T-2毒素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用及促凋亡作用

目的：探讨T-2毒素对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用和促凋亡作用。方法：选取对数生长期的人肝癌HepG2细胞,分为对照组（未给予T-2毒素）和实验组（给予0.25、2.50、25.00、250.00和2 500.00 μg·L^-1T-2毒素）。24 h后倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率,Hoechest 33258染色法观察HepG2细胞凋亡形态表现,检测各组HepG2细胞中caspase-3的活性。结果：T-2毒素作用HepG2细胞24 h后,倒置显微镜下观察,与对照组比较,实验组细胞数量明显减少,细胞皱缩变形。MTT法检测,与对照组比较,实验组细胞增殖抑制率升高（P<0.01）。流式细胞术检测,与对照组比较,实验组SubG₁期细胞比例明显升高,细胞凋亡率明显升高。Hoechest 33258染色法检测,实验组细胞出现染色质固缩,细胞核呈致密浓染色的凋亡形态。实验组细胞中caspase-3活性明显高于对照组（P<0.01）。结论：T-2毒素对人肝癌HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用,并能促进细胞凋亡。     

双氢青蒿素对前列腺癌裸鼠种植瘤Bcl-2和Bax表达的调控

目的研究双氢青蒿素(DHA)诱导前列腺癌细胞凋亡作用及其机制。方法采用人前列腺癌PC-3细胞株建立裸鼠种植瘤模型,将20只模型鼠随机平均分为对照组、溶剂(DMSO)组、DHA200μmol/kg体质量组和DHA100μmol/kg体质量组,经13d干预后,电镜观察肿瘤组织形态学表现;免疫组化检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达水平;TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡。结果与对照组及DMSO组比较,DHA治疗组电镜观察肿瘤组织中散在凋亡细胞及凋亡小体;免疫组化检测凋亡相关基因Bcl-2表达减弱、Bax表达增强,差异均有统计学意义(P<0.05);TUNEL检测结果显示肿瘤组织细胞凋亡率明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论DHA具有较强的诱导前列腺癌细胞凋亡作用,这种作用可能是通过下调Bcl-2和上调Bax表达实现的。     

激光共聚焦显微镜观察FITC-Annexin V/PI双染色法检测人肺癌细胞凋亡

目的激光共聚焦显微镜观察FITC-Annexin V／PI双染色法检测人肺癌细胞凋亡的形态。方法对不同剂量含药血清处理的体外培养人肺癌PGLH7细胞株进行Annexin V／PI双染,激光共聚焦显徽镜观察细胞凋亡的形态特征。结果Annexin V／PI双染色法加激光共聚焦显微镜观察,经含药血清作用的人肺癌细胞ee,凋亡早期细胞呈AnnexinV高染而PI低染,细胞膜呈绿色而细胞核不着色;凋亡中、晚期细胞则AnnexinV和PI均为高染,细胞膜呈绿色而细胞核呈红色;部分细胞的核呈碎片状或梅花状,为典型的细胞凋亡形态。结论FITC—AnnexinV／PI双染色法加激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞是目前观察凋亡的理想方法,特别适用于凋亡细胞的早期检测。     

青藤碱对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞体外增殖及凋亡的影响

目的 观察青藤碱(sinomenine, SN)对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)凋亡及增殖的影响,为青藤碱在临床上的应用提供实验依据.方法 光镜和荧光显微镜观察FLS形态的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT比色法检测SN对FLS生长的抑制作用.结果 光镜及荧光显微镜下可见核固缩,变圆,荧光染色增强等凋亡形态学变化.流式细胞仪结果显示,随着SN浓度及作用时间的增加,被处理的FLS的凋亡率增加,未处理组与各处理组比较差异具有显著性(P＜0.05),其中3.2 mmol/L浓度的SN作用48 h对FLS凋亡影响最为显著.MTT结果显示,加入不同浓度SN(2.8～3.2 mmol/L),培养的FLS24 h、48 h后对增殖的抑制水平显著高于未处理组,与凋亡率呈现正相关(r=0.787, P＜0.05).结论 SN在一定浓度及作用时间内可抑制RA患者FLS增殖,诱导凋亡,这可能是SN治疗RA机制之一.     

Quercetin in combating H2O2 induced early cell apoptosis and mitochondrial damage to normal human keratinocytes

Background Oxidative stress plays an important role in the pathogenesis of epidermal diseases. This study aimed to investigate the effects of quercetin on the anti-oxidative response and on mitochondrial protection in cultured normal human keratinocytes. Methods Cultured HaCaT cells were treated with different concentrations of H202 （0, 50, 100, 250, 500 pmol/L） for different periods of time （0.5, 1, 2, 4 hours） to establish an oxidative stress model. The cultured HaCaT cells were randomly assigned to control, H2O2, and quercetin＋H2O2 groups. For the quercetin groups, the cells were treated with different concentrations of quercetin （0, 10, 25, 50 umol/L） before exposure to H2O2. Morphological changes of the cells were observed under an inverted microscope and an electron microscope. The cell viability was detected by the MIF method. The cell apoptosis （AnnexinV/propidium iodide double stain） and mitochondrial membrane potential （△ψm） changes were detected by flow cytometry. Results An oxidative stress model of HaCaT cells was established under a suitable concentration （250 umol/L） and treated time of H2O2 （2 hours）. The cell viability and △ψm decreased in a concentration-dependent and time-dependent manner while the percentage of apoptotic cells significantly increased in the H2O2 groups compared with the control group （P 〈0.05）. The cell viability and △ψm of the quercetin treated group increased （P 〈0.05） and the percentage of apoptotic cells decreased at concentrations of 1-50 umol/L quercetin （P 〈0.01） compared with H2O2 treated group. Conclusion Quercetin can relieve the cell damage and apoptosis from H2O2 induced injury to HaCaT cells by anti-oxidation and mitochondrial protection.     

沙眼衣原体抑制etoposide诱导的HeLa229细胞凋亡的研究

目的 探讨沙眼衣原体D血清型感染对宿主细胞凋亡的影响.方法 用凋亡诱导剂依托泊苷(e-toposide)作用于沙眼衣原体(D血清型)感染的和未感染的Hela229细胞,Hoechst33258染色后荧光显微镜观察核浓缩和凋亡小体,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率.结果 未感染CT的Hela229细胞经etoposide作用后,用荧光显微镜观察到明显的核浓缩和凋亡小体;流式细胞仪检测的凋亡率为90.64%,与未经诱导剂作用的Hela229细胞比较差异有显著性(P<0.05).而CT感染24 h的Hela229细胞,经etoposide作用后未观察到核浓缩和凋亡小体;流式细胞仪检测的凋亡率为11.50%,与未感染CT的Hela229细胞诱导后的凋亡率比较差异有显著性(P<0.05);而与未经诱导的CT感染Hela229细胞比差异较无显著性(P>0.05).结论 沙眼衣原体感染Hela229细胞后能抑制etoposide诱导的细胞凋亡.     

Mithramycin A对肝癌细胞Huh-7增殖的影响

目的研究抗肿瘤抗生素光辉霉素（Mithramycin A,MIT）对人肝癌细胞Huh-7的作用。方法CCK-8比色法观察MIT对Huh-7细胞的生长抑制作用,Hoechst 33342/PI双荧光染色分析细胞凋亡,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果MIT可抑制Huh-7细胞的生长,半数抑制浓度（IC50）为60.12 nmol.L^-1。荧光显微镜观察可见细胞凋亡特征性改变;浓度为5×10^-2μmol.L^-1的MIT作用72 h后,可明显诱导Huh-7细胞凋亡,流式细胞仪检测肿瘤细胞出现典型亚二倍体凋亡小峰。结论MIT对Huh-7细胞有明显的诱导凋亡和生长抑制作用,具有浓度、时间依赖性。     

槲皮素抗小鼠P388白血病的作用

目的：研究槲皮素抗小鼠P388白血病的作用。方法：采用DBA／2小鼠腹腔注射P388细胞的方法建立白血病小鼠模型，80只小鼠随机分为空白对照组、溶剂对照组、高剂量槲皮素组、低剂量槲皮素组，每组20只。于第7天末次给药后每组小鼠随机抽取10只处死，收集腹水分别计数，观察腹水细胞荧光形态变化，分析细胞周期及细胞凋亡率，观察骨髓涂片及心、肝、脾、肾的组织病理学改变。观察记录其它小鼠一般情况及生存期。结果：给予槲皮素的两组小鼠平均生存期较两对照组显著延长（P〈0．05），且高剂量组小鼠平均生存期较低剂量组显著延长（P〈0．05）。在第7天处死小鼠后，高剂量组小鼠无肉眼可见腹水。低剂量组小鼠腹水细胞的密度显著减小，G0-G1期细胞比例减少，S期细胞比例增加，细胞凋亡率显著升高（P〈0．05）。各组小鼠骨髓涂片及心、肝、脾、肾组织病理切片未见明显异常。结论：槲皮素对P388白血病小鼠有延长生存期及抑制腹水细胞增殖和诱导腹水细胞凋亡的作用。