小鼠牙乳头间充质细胞自发牙向分化及相关基因表达分析

目的观察小鼠牙乳头间充质细胞在血清培养基中的自发牙向分化,并对其特异性牙向和骨向分化的相关转录因子的基因表达进行分析。方法获取孕16.5 d(E16.5 d)胎鼠的原代牙乳头间充质细胞,分别在含血清培养基和添加白血病抑制因子(LIF)的血清培养基中传代培养,观察细胞是否出现成牙本质细胞表型分化,并检测牙向分化表型和维持未分化表型的细胞的特异性转录因子的mRNA表达情况。结果单纯血清培养基培养的牙乳头间充质细胞可在第4代后自发分化为成牙本质细胞表型;而添加106U/L LIF的含血清培养基,可使小鼠牙乳头间充质细胞的未分化表型稳定至第9代。无论细胞是否出现牙向分化,表现成牙间充质细胞特性的Msx1/Msx2、Pax9、Lhx6/Lhx7均有表达;而成牙本质细胞表型分化后尚能检测到DSPP、Sox9、Cbfα1、Osx等启动向矿化组织细胞终末分化的特异性基因表达。结论牙乳头间充质细胞的自发牙向分化模型可作为诱导其他成体间充质干细胞牙向分化时的阳性对照,其基因表达模式可为研究其他成体干细胞牙向分化后在基因水平上的变化提供佐证。     

过表达牙本质涎磷蛋白的骨髓间充质干细胞部分牙向和骨向分化基因的表达

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSC）过表达牙本质涎磷蛋白（DSPP）后的形态学改变，并研究其部分牙向及骨向分化基因的表达情况。方法体外培养小鼠BM-MSC，通过腺病毒介导的方式将DSPP基因转染小鼠BM-MSC，通过标记基因GFP检测转染效率，观察转染后细胞的形态学改变，RT-PCR方法检测过表达DSPP的BM-MSC有无成牙和成骨基因的mRNA表达。结果成功获得小鼠BM-MSC，经腺病毒介导的DSPP基因转染BM-MSC的转染效率可达42．7％，转染后的细胞出现分化，似成牙本质样细胞。转染后细胞表达DSPP、DMP1、Msx1／2、Pax9、Lhx6／7、Sox9、Cbfα1、Osx、Col Ⅰ等多种牙向和骨向发育分化基因。结论过表达DSPP的BM-MSC出现细胞分化，并可表达多种牙向及骨向发育分化的基因。     

人牙髓干细胞和根尖乳头干细胞体外分化能力的对比研究

目的 对比研究人牙髓干细胞(DPSCs)和根尖乳头干细胞(SCAP)的体外生长特性、增殖及矿化能力.方法 采用酶消化法体外培养人DPSCs和SCAP,诱导分化培养基诱导细胞成骨/成牙本质向分化,流式细胞仪检测特异性标记物,茜素红染色检测矿化程度,逆转录PCR(RT-PCR)检测分化标记物表达.结果 人DPSCs和SCAP为成纤维细胞样贴壁生长,SCAP增殖率较高;两种细胞表达特异性间充质干细胞(MSCs)标记物:CD34、CD45(-),CD90、CD105、CD146(+),基质细胞抗原1(STRO-1)、八聚体转录因子4(OCT-4)(+),SCAP特异性标记物CD24(+).成骨诱导3周可形成明显钙化结构,SCAP钙化能力较强.成骨诱导2周2种细胞均可表达分化标记物:骨涎蛋白、骨钙素、牙本质涎磷蛋白,且随诱导时间表达逐渐增加.结论 人DPSCs和SCAP均具有间充质干细胞典型特征,可分化为成牙本质样细胞,是牙源性组织工程的可靠于细胞来源.     

过表达牙本质涎磷蛋白的骨髓间充质干细胞部分牙向和骨向分化基因的表达

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSC)过表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)后的形态学改变,并研究其部分牙向及骨向分化基因的表达情况。方法体外培养小鼠BM-MSC,通过腺病毒介导的方式将DSPP基因转染小鼠BM-MSC,通过标记基因GFP检测转染效率,观察转染后细胞的形态学改变,RT-PCR方法检测过表达DSPP的BM-MSC有无成牙和成骨基因的mRNA表达。结果成功获得小鼠BM-MSC,经腺病毒介导的DSPP基因转染BM-MSC的转染效率可达42.7%,转染后的细胞出现分化,似成牙本质样细胞。转染后细胞表达DSPP、DMP1、Msx1/2、Pax9、Lhx6/7、Sox9、Cbfα1、Osx、Col等多种牙向和骨向发育分化基因。结论过表达DSPP的BM-MSC出现细胞分化,并可表达多种牙向及骨向发育分化的基因。     

牛膝含药血清对体外培养人间充质干细胞增殖与分化的影响

目的研究牛膝对体外培养人间充质干细胞的增殖与分化的影响及其可能的分子机制。方法制备牛膝含药血清,分离与扩增人间充质干细胞,MTT法检测牛膝含药血清对体外培养的间充质干细胞增殖作用的影响,检测碱性磷酸酶与骨钙素以反映细胞分化水平的改变,RT-PCR检测成骨相关转录因子的表达。结果间充质干细胞的增殖速度加快,并能上调转录因子Msx2的表达,而碱性磷酸酶与骨钙素的表达没有变化。结论牛膝在体外有促进人间充质干细胞细胞增殖的作用,而不影响其分化。     

L型钙离子通道Cav 1.2在大鼠根尖牙乳头干细胞成牙向分化中的作用

目的 探讨L型钙离子通道Cav 1.2在大鼠根尖牙乳头干细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中的作用。方法 利用酶消化法分离大鼠根尖牙乳头干细胞,体外扩增,结晶紫染色检测牙乳头干细胞的克隆形成率;利用慢病毒转染系统介导pLVX-shRNA2质粒在牙乳头干细胞中表达,抑制牙乳头干细胞中Cav 1.2基因的表达。荧光显微镜下观察转染牙乳头干细胞绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR及Western印迹法检测牙乳头干细胞中Cav 1.2基因沉默效率;矿化诱导体系下诱导Cav 1.2基因沉默牙乳头干细胞向成牙本质细胞样细胞分化,应用茜素红染色检测Cav 1.2对牙乳头干细胞成牙向分化的影响。结果 牙乳头干细胞的克隆形成能力为每200个细胞形成6~10个克隆;PCR及Western印迹法结果显示牙乳头干细胞Cav 1.2基因沉默效率达到70%;在牙乳头干细胞成牙向诱导第10天时,与对照组Luc-Cav 1.2相比,Cav 1.2基因沉默组成牙相关基因DSPP表达水平明显下降,同样茜素红染色结果显示Cav 1.2基因沉默牙乳头干细胞钙化结节形成也受到明显抑制。结论 L型钙离子通道Cav 1.2在大鼠根尖牙乳头干细胞向成牙本质细胞样细胞分化的过程中发挥着非常重要的作用。【摘要】目的 利用慢病毒转染系统构建Cav 1.2基因沉默的大鼠根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla, SCAPs),探讨Cav 1.2在大鼠牙乳头干细胞成牙向分化中的作用。方法 取3周龄SD大鼠,采用酶消化法获取大鼠根尖牙乳头干细胞,取第二代大鼠根尖牙乳头干细胞进行克隆平板实验鉴定其增值能力;采用慢病毒转染的方法构建Cav 1.2基因沉默Sh-Cav 1.2牙乳头干细胞及对照组Luc-Cav 1.2牙乳头干细胞, RT-PCR及Western印迹法鉴定其转染效率,并诱导其向成牙本质细胞样细胞分化;在成牙向诱导分化第10天,RT-PCR及茜素红S染色观察Cav 1.2对大鼠根尖牙乳头干细胞成牙向分化的影响。结果 分离获得较强增殖能力的大鼠牙乳头干细胞,其中每200个细胞可形成6~10个克隆;荧光倒置显微镜下转染48h,Sh-Cav 1.2及Luc-Cav 1.2均呈现绿色荧光,转染效率均达到90%;在两组细胞成牙向诱导过程中,实验组Sh-Cav 1.2牙乳头干细胞成牙相关基因DSPP的表达及钙化结节的形成均明显低于对照组Luc-Cav 1.2。结论 L型钙离子通道Cav 1.2对大鼠根尖牙乳头干细胞成牙向分化有重要作用。     

低血清条件下分离脐血间充质干细胞及其生物学特性检测

目的研究低血清条件下分离人脐血间充质干细胞及其表型，生物学性状和分化能力。方法分离足月生产胎儿的脐血单个核细胞，以特定的低血清培养基培养MSC，测定生长曲线和体外分化潜能，利用流式细胞仪进行MSC表型测定和细胞周期分析，检测造血因子的表达，诱导成脂和成骨分化。结果利用低血清培养从脐血中可以分离出MSC，其形态和表面抗原性与骨髓来源的MSC一致，在体外可有效扩增，表达特定造血因子，具有向成骨及脂肪组织分化的潜力。结论低血清条件下分离的脐血来源MSC具有典型间充质干细胞的生物学特征，并具有向其它组织分化的潜能，可以作为细胞组织工程的种子细胞。     

评估无血清培养子宫内膜间充质干细胞的可行性

目的 使用无血清培养基体外分离扩增子宫内膜间充质干细胞,研究其生物学特性.方法 比较在无血清培养基中和含10%胎牛血清培养基中子宫内膜间充质干细胞细胞形态细胞表型、增殖能力、细胞活率和分化能力等生物学特性.结果 无血清培养基和有血清培养基培养的子宫内膜间充质干细胞形态相似,但是前者呈明显的漩涡状生长,更加细长,立体感更强;无血清和有血清培养的子宫内膜间充质干细胞表面标记物均呈阳性;无血清培养的子宫内膜间充质干细胞细胞活率更高、细胞增殖能力更强.结论 无血清培养基能够在体外扩增子宫内膜间充质干细胞,并使其生物学特性(细胞增殖,细胞活率)优于胎牛血清培养的子宫内膜间充质干细胞,且分化能力无改变,可以取代胎牛血清用于细胞治疗,避免有血清培养的干细胞治疗引起的人畜共患病及免疫原性反应.     

无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究

目的建立一种无动物源成份无血清的间充质干细胞培养基XF/SF-MSCM,并探讨其支持人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)体外增殖、维持分化潜能的效果。方法组织块贴壁法分离获得原代人脐带间充质干细胞,P1代起分别使用自制的XF/SF-MSCM培养基与含10%胎牛血清的传统培养基(SC-MSCM)对脐带间充质干细胞进行连续培养传代至P6代,观察比较两组P6代细胞的形态及增殖能力,以流式细胞术检测连续传代后细胞的免疫学表型,比较其成骨、成脂肪的分化潜能。结果分离获得的原代P0脐带间充质干细胞,分别在XF/SFMSCM与SC-MSCM两种培养基中连续培养传代,细胞增殖能力及形态无显著差别。两组P6代细胞的生长曲线相似,但XF/SF-MSCM组间充质干细胞贴壁的紧密程度稍低;流式细胞检测结果显示,XF/SF-MSCM组细胞保持了间充质干细胞的免疫学表型,高表达CD29、CD44、CD90,不表达CD31、CD34、CD45并维持了良好的成骨和脂肪细胞的分化能力。结论本室制备的无动物源成份无血清培养基XF/SF-MSCM可支持脐带间充质干细胞的体外扩增,维持其免疫学表型及分化潜能,提供数量充足的高质量间充质干细胞,满足临床治疗及生物医学研究的需要。     

颅神经嵴干细胞成牙本质样细胞分化诱导的体内实验研究

目的观察诱导颅神经嵴干细胞（cranial neural crest stem cell，CNCSC）后的裸鼠体内成牙本质样细胞表型分化，探讨CNCSC用于牙再生研究的可行性。方法颅神经管组织块无血清条件培养法获取CNCSC，体外经成纤维生长因子8（FGF8）、骨形态发生蛋白2（BMP2）、转化生长因子β1（TGFβ1）、牙本质基质非胶原蛋白等因子诱导后，与胶原-壳聚糖三维凝胶支架复合植入裸鼠背部皮下，免疫组织化学方法检测Ⅰ型胶原表达、牙本质涎磷蛋白（DSPP）表达，鉴定其成牙本质样细胞表型分化特征。结果诱导后CNCSC植入体内后1月表现为Ⅰ型胶原及DSPP阳性表达，2月后DSPP表达增强，局部区域可见极性栅栏状排列的细胞分布，并可见明显的细胞外基质形成。结论CNCSC在体内可向成牙本质样细胞表型分化，为进一步开展牙再生研究奠定了基础。     

端粒酶在面突外胚间充质细胞干细胞中的表达

目的: 探讨面突外胚间充质干细胞的端粒酶活性状况. 方法: 体外培养妊娠50 d人胚胎面突外胚间充质干细胞,白血病抑制因子(LIF)抑制细胞分化,于第1, 8, 15和第22代免疫组化检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达并进行图像分析,同时检测无LIF抑制下,第5代细胞自发分化10 d端粒酶逆转录酶的表达情况. 结果: 外胚间充质干细胞表达端粒酶逆转录酶,表达强度随传代次数的增多而下降. 在分化状态,该细胞不再表达端粒酶逆转录酶. 结论: 早期胚胎面突外胚间充质干细胞具有较高的端粒酶活性,但不足以抑制该细胞的衰老.     

骨髓间充质干细胞的分离培养及定向诱导软骨细胞的实验研究

目的　体外培养大鼠骨髓间充质干细胞并向软骨细胞表型分化 ,探讨其作为组织工程软骨种子细胞的可行性。方法　取成年大鼠股骨骨髓 ,体外培养、纯化。取第三代成年大鼠骨髓间充质干细胞 ,实验组用HG DMEM无血清培养液诱导 ;对照组用含 1 0 %胎牛血清的HG DMEM培养液自然分化。形态学观察 ,免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌。结果　大鼠骨髓间充质干细胞为均一的成纤维细胞样。实验组与对照组Ⅱ型胶原免疫组化阳性率有显著差异 (P <0 .0 1 )。结论　成年大鼠骨髓间充质干细胞在特定的培养基能向软骨细胞方向转化 ,作为软骨组织工程种子细胞具有可行性     

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

二甲双胍对脂向分化间充质干细胞的影响

目的探讨二甲双胍对脂向分化的大鼠骨髓间充质干细胞增生和分化的影响,为二甲双胍的临床应用提供实验依据。方法体外分离培养原代大鼠骨髓间充质干细胞,对其进行脂向诱导分化并于实验组添加100μmol／L二甲双胍,应用四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测空白组与实验组的细胞增生情况,油红染色、定量RT-PCR检测不同组别的细胞脂向分化情况。结果MTT检测结果显示：两组细胞生长曲线均呈逐渐增高的趋势,二甲双胍干预显现明显促增生作用;油红染色可见用药组细胞胞质中脂滴较少且小于空白组,RT-PCR定量分析进一步表明二甲双胍抑制骨髓间充质干细胞脂向分化,该组细胞成脂特异性基因表达显著低于降低空白组。结论100μmol／L二甲双胍对体外培养的脂向分化骨髓间充质干细胞具有显著的促进增生、抑制分化作用。     

人脐带间充质干细胞的无动物血清培养及向肝细胞诱导分化

目的 探索从脐带组织中分离培养间充质干细胞的无动物血清方法,并将其向肝细胞诱导分化。方法 分离自体脐血清用于后续细胞培养,利用酶消化法从脐带组织中分离培养间充质干细胞,检测其形态和免疫表型,并采用两步法诱导其向肝细胞诱导分化。结果  流式细胞术检测结果表明,自体脐血清培养得到的贴壁细胞表型符合间充质干细胞特征,且在合适诱导条件下能肝样细胞分化,经过4周处理,能表达肝细胞特异性基因,部分细胞具有吞噬低密度脂蛋白的能力。结论  采用自体脐血清有效地培养脐带间充质干细胞,具备向肝细胞的分化能力。     

左归丸含药血清对间充质干细胞向软骨分化过程中骨粘连蛋白基因表达的影响

目的 研究左归丸含药血清对间充质干细胞向软骨分化过程中骨粘连蛋白基因(SPARC)表达的影响.方法 诱导间充质干细胞向软骨分化,诱导同时以左归丸含药血清刺激细胞.分别在在o、7、14、21d通过Real-time PCR检测左归丸含药血清对诱导前后SPARC mRNA表达的影响.构建SPARC启动子报告载体并转染骨髓间质细胞系,双荧光素酶试剂盒检测左归丸含药血清SPARC启动子转录活性的影响.结果 与空白对照组和单纯诱导组相比,在诱导第21天时,左归丸能明显促进诱导细胞中SPARC mRNA的表达(P＜0.05).与空白组比,当予以左归丸含药血清刺激后,SPARC基因启动子转录活性能增强近1倍(P＜0.05).结论 左归丸含药血清能促进间充质干细胞向软骨分化过程中SPARC基因表达,可能主要是通过增强SPARC基因转录活性.     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨的实验研究

目的：通过诱导兔骨髓间充质干细胞（MSCs），观察干细胞向软骨细胞的分化效果。方法：纯化兔骨髓间充质干细胞；用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞；以MTT测定诱导细胞的增殖活性；免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达；诱导后的细胞移植于白兔膝关节内，X线摄片观察软骨修复形成情况。结果：诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化，且骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化所需的特异性细胞外基质——Ⅱ型胶原明显升高，移植后效果明显。结论：兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

TNF-α对大鼠牙乳头细胞中BMP2及相关蛋白的表达调节研究

目的:在大鼠牙乳头间充质细胞中探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对骨形态发生蛋白2(BMP2)及矿化相关蛋白的表达调控。方法:体外分离培养SD新生大鼠牙乳头间充质细胞,在添加TNF-α梯度的血清培养基中诱导培养,RT-PCR、WB及ELISA方法检测骨形态发生蛋白2(BMP2)表达情况;添加TNF-α不同时间梯度,RT-PCR、WB检测成骨分化标志蛋白碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)表达变化。结果:TNF-α处理后,大鼠牙乳头间充质细胞中BMP2表达上调,ALP、BSP表达有所提高。结论:在大鼠牙乳头细胞中,TNF-α能够上调BMP2表达,进而诱导成牙骨质细胞矿化相关蛋白ALP,BSP表达,对牙齿发育矿化可能起到促进作用。     

颅神经嵴干细胞成牙本质样细胞分化诱导的体内实验研究

目的观察诱导颅神经嵴干细胞(cranial neural crest stem cell,CNCSC)后的裸鼠体内成牙本质样细胞表型分化,探讨CNCSC用于牙再生研究的可行性。方法颅神经管组织块无血清条件培养法获取CNCSC,体外经成纤维生长因子8(FGF8)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质基质非胶原蛋白等因子诱导后,与胶原-壳聚糖三维凝胶支架复合植入裸鼠背部皮下,免疫组织化学方法检测型胶原表达、牙本质涎磷蛋白(DSPP)表达,鉴定其成牙本质样细胞表型分化特征。结果诱导后CNCSC植入体内后1月表现为型胶原及DSPP阳性表达,2月后DSPP表达增强,局部区域可见极性栅栏状排列的细胞分布,并可见明显的细胞外基质形成。结论CNCSC在体内可向成牙本质样细胞表型分化,为进一步开展牙再生研究奠定了基础。