裸鼹鼠与C57BL/6小鼠自噬调节的比较研究

目的 比较裸鼹鼠与小鼠的自噬调节,以期为裸鼹鼠高自噬、抗癌、衰老缓慢等生物学特性的研究提供参考.方法 利用电镜技术和蛋白印迹检测新生裸鼹鼠和C57BL/6小鼠肝脏和肺脏组织的自噬水平.自噬干扰裸鼹鼠成纤维细胞和小鼠成纤维细胞,24、48、72h CCK-8细胞计数法检测细胞的增殖情况,蛋白印迹检测各组细胞各个时间点Beclin 1的表达水平.结果 与C57BL/6小鼠比较,裸鼹鼠组织的LC3B表达显著较高.裸鼹鼠细胞对自噬抑制剂3-MA具有一定的耐药性,自噬诱导剂雷帕霉素对裸鼹鼠细胞的增殖抑制显著高于小鼠细胞.结论 裸鼹鼠组织具有高自噬水平,应对外界的自噬抑制压力时,裸鼹鼠细胞的自身调节能力明显高于C57BL/6小鼠.     

小鼠胚胎干细胞饲养层制备条件的研究

目的:建立稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于分离克隆胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞).方法:取妊娠13.5～14.5d的胎鼠,采用组织消化法结合组织块培养法分离、培养小鼠成纤维细胞;MTT法测定细胞生长曲线,结合倒置显微镜观察筛选小鼠成纤维细胞饲养层的最佳种植密度;MTT法筛选丝裂霉素c作用的最佳浓度和时间.取妊娠3.5d的小鼠囊胚在经丝裂霉素C处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞生长情况.结果:组织消化法结合组织块培养法是分离培养小鼠成纤维细胞的较好的方法;1 × 105～2×105个/ml种植密度适于饲养层铺板;丝裂霉素c 10μg/ml作用3.5h或20μg/ml作用2.5h能抑制成纤维细胞增殖,细胞至少在7d内维持稳定的水平;妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成Es集落.结论:制备的胎鼠成纤维细胞饲养层能有效地支持小鼠胚胎干细胞的生长.     

酶消化法原代培养兔结膜成纤维细胞及进行传代培养的体会

目的 用酶消化法原代培养兔眼结膜成纤维细胞并进行传代培养。方法 取兔眼结膜，加入胰蛋白酶及乙二胺四乙酸二钠直接消化后放入孵箱培养，并通过改进后的传代培养技术将原代培养成功的成纤维细胞进行传代，观察细胞的生长情况。结果 原代培养7～9d成纤维细胞在培养基中长成单层且分布均匀。传代培养后3～4d成纤维细胞铺满培养基，即可再传代。结论 酶消化法原代培养兔眼结膜成纤维细胞比常规的组织块培养法更快促使细胞长成单层，且贴壁细胞分布更均匀。运用改进后的传代培养技术可以使成纤维细胞的增殖和纯化更加方便快捷。     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑制

目的 建立有效的胚胎成纤维细胞饲养层体系，用于分离和克隆胚胎干细胞研究。方法 取胎鼠组织制备小鼠原代成纤维细胞，观察不同分离和培养条件对细胞增殖的影响，以及丝裂霉素C对细胞增殖的抑制作用；细胞增殖的数量用MTT法测定。结果 分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄是12．5—14．5d；20℃-25℃时，用0．25％胰蛋白酶消化组织的最佳时间为3min；可在培养3—6d后进行传代。细胞冻存于-80℃3-4个月，复苏后能正常传代。丝裂霉素C抑制胚胎成纤维细胞增殖的合适浓度为每毫升20μg/10^5细胞，作用2-4h，可维持小鼠原代胚胎成纤维细胞9d内不增殖也不死亡。结论 在合适条件下，小鼠原代胚胎成纤维细胞能顺利分离和培养，并能多次传代和冻存；经丝裂霉素C处理后增殖受抑制，可作为饲养层细胞用于胚胎干细胞的研究。     

低氧对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞自噬水平及凋亡的影响

目的 比较裸鼹鼠成纤维细胞常氧与低氧条件下自噬与凋亡水平.方法 分别采用低氧（3％O2）与常氧（20％ O2）培养裸鼹鼠皮肤成纤维细胞,采用Western blotting、RT-PCR等方法检测自噬相关基因Beclin1、LC3的表达,并用流式细胞术检测低氧与常氧条件下裸鼹鼠成纤维细胞凋亡水平.结果 裸鼹鼠皮肤成纤维细胞在低氧与常氧处理24 h时,LC3 Ⅱ蛋白的表达量并无明显差异,而低氧处理48 h后LC3 Ⅱ蛋白的表达量显著高于常氧组,并且裸鼹鼠成纤维细胞随着低氧培养时间的延长,LC3 Ⅱ蛋白表达升高.流式细胞术结果显现低氧处理组裸鼹鼠皮肤成纤维细胞凋亡率显著低于常氧组.结论 裸鼹鼠皮肤成纤维细胞可以通过提高自噬水平适应低氧环境,这为今后深入研究裸鼹鼠耐低氧机制提供了参考.     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

RNA干扰抑制Beclin1基因对裸鼹鼠成纤维细胞增殖与凋亡的影响研究

目的 应用RNA干扰技术抑制自噬调控基因Beclin 1的表达,检测Beclin 1表达对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖与凋亡的影响以及P53、BAX、Bcl2等基因表达的影响。方法 分别检测裸鼹鼠成纤维细胞经饥饿、H2O2刺激等处理后Beclin 1的表达,然后采用设计的Beclin l基因的干扰RNA及阴性对照分别瞬时转染裸鼹鼠成纤维细胞。采用Real-time PCR及Western blot法检测沉默效果后,采用CCK-8实验检测沉默后细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,然后采用Western blot检测相关基因蛋白表达水平。结果 饥饿与H2O2刺激均能导致Beclin 1表达水平的改变。采用gene expresso转染试剂对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞转染效率可达到90%以上,Real-time PCR及Western Blot结果显示所设计的Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表达。Beclin 1基因沉默后,裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖抑制率均显著高于对照组,细胞早期凋亡与晚期凋亡率均显著升高,同时P53、BAX、Bcl2、LC3B、p-AKT、mTOR 等表达量下降。结论 Beclin 1在裸鼹鼠成纤维细胞抵抗饥饿、H2O2刺激等过程中表达量显著变化,同时抑制Beclin 1的表达,可抑制裸鼹鼠细胞细胞增殖,促进其凋亡,这提示Beclin 1基因对裸鼹鼠自噬、增殖、凋亡起到调控作用。     

人成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的建立不同组织来源成纤维细胞的培养方法并比较其培养差异。方法用消化法和贴壁法分离人胚胸主动脉成纤维细胞与人胚肺成纤维细胞,利用差速培养法纯化成纤维细胞,并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养的细胞行波形蛋白免疫染色鉴定。结果接种24 h后人胚胸主动脉成纤维细胞全部贴壁,48 h后细胞体积增大并伸出伪足,形状以梭形或不规则形为主;而消化的人胚肺组织中细胞形态不一,经继续培养4～5代后,培养物完全由成纤维细胞构成。结论用胶原酶Ⅰ消化人胚胸主动脉成纤维细胞效果好,而用胰蛋白酶液消化人胚肺成纤维细胞效果较好,用差速生长纯化的成纤维细胞可用于实验研究。     

一种改良宫颈癌相关成纤维细胞原代培养方法的建立

目的:通过对比并改良常见的原代(CAFs)细胞培养方法,建立一种成功率较高的宫颈癌相关成纤维细胞(CAFs)原代培养的方法。方法:取确诊为宫颈癌患者的活检或手术标本,通过对消化时间、重悬液量及培养基血清浓度进行改良原代细胞培养,观察细胞生长状况,并比较其与传统组织块贴壁法和酶消化法的细胞生长率。运用时间差酶消化及反复贴壁法进行分离纯化后,用免疫荧光的方法对宫颈癌相关成纤维细胞的纯度进行鉴定。结果:改良培养法消化时间为30min,血清浓度为20%时成功率最高(66.67%)。反复运用时间差酶消化及反复贴壁法可以得出纯度较高的宫颈癌相关成纤维细胞。结论:本研究成功建立了一种成功率较高的宫颈癌相关成纤维细胞改良培养方法,为后期探讨CAFs在肿瘤形成、进展中的作用打好实验基础。     

Primary culture of human and rat thoracic aortic fibroblast cells

目的 培养成纤维细胞,建立不同种属来源的胸主动脉成纤维细胞的培养方法并比较其形态差异.方法 用消化法和贴壁法分离不同来源的成纤维细胞,利用差速培养法纯化成纤维细胞,并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫染色鉴定.结果 接种24 h后细胞全部贴壁,48 h后人胸主动脉成纤维细胞体积增大并伸出伪足,形状以梭形或不规则形为主;而大鼠胸主动脉的成纤维细胞生长的相对较慢.结论 用Ⅰ型胶原消化动脉的成纤维细胞效果较好,用差速生长纯化的成纤维细胞可用于实验研究.     

抑癌基因p53在裸鼹鼠不同组织中表达水平的差异

目的 比较裸鼹鼠与C57BL/6J小鼠组织中抑癌基因p53表达的差异,并分析p53基因在不同年龄裸鼹鼠不同组织中表达水平的差异.方法 采用Western blotting检测新生裸鼹鼠与C57BL/6J小鼠肝脏、肺脏、脑、肾脏中p53蛋白的表达,进一步比较了不同年龄裸鼹鼠肝脏、肺脏、脑、肠道中p53蛋白的表达,同时采用RT-PCR检测了裸鼹鼠肝脏、肺脏中p53基因的转录水平.以及低氧处理裸鼹鼠皮肤成纤维细胞中p53基因的表达水平.结果 新生裸鼹鼠肝脏、肺脏、脑、肾脏组织中p53蛋白的表达低于新生C57BL/6J小鼠组织,成年裸鼹鼠肝脏、肺脏组织中p53蛋白表达量亦显著高于幼年裸鼹鼠.裸鼹鼠成纤维细胞在低氧条件下p53蛋白的表达量较高,并且随着低氧处理时间的延长,表达量进一步升高.结论 新生裸鼹鼠组织中抑癌基因p53表达水平显著低于C57BL/6J小鼠,并且p53基因随着年龄增长而发生变化.     

NaF与H2O2对大鼠真皮成纤维细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的： 比较不同剂量的氟化钠（NaF）与过氧化氢（H₂O₂）对成纤维细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响,探索促进VEGF表达的简单有效的方法,为优化组织工程真皮培养条件提供理论参考。方法： 酶消化法分离大鼠皮肤成纤维细胞,以不同剂量NaF（0.05和0.50 mmol/L ）、H₂O₂（10 nmol/L和10μmol/L）以及两者联合（NaF 0.05 mmol/L H₂O₂ 10 μmol/L）分别作用于成纤维细胞,在第0、24及48 h采用CCK-8法测定细胞的增殖活性,在第48小时采用ELISA法和免疫组织化学法测定其对VEGF表达的影响。结果：不同剂量NaF、H₂O₂ 以及两者联合作用对成纤维细胞增殖无抑制作用,与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);NaF实验组和实验组的VEGF表达量均明显提高,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),而NaF与H2O2两者联合作用效果最为明显,可提高40%（P<0.05）。结论： NaF与H2O2联合作用能在不影响成纤维细胞正常增殖的前提下,有效地促进VEGF的表达。     

脂肪干细胞原代培养及诱导成肌细胞的实验研究

目的 探讨大鼠脂肪干细胞(ADSC)的培养及诱导分化为成肌细胞的方法 .方法 取SD大鼠脂肪组织,酶消化法分离、培养ADSC,免疫荧光和流式细胞仪检测相关表面抗原CD90、CD105和CD34的表达.取培养至第2代处于对数生长期细胞,分别用含5-氮杂胞苷(5-aza)的诱导培养液(诱导组)和基础培养液(对照组)进行培养.诱导时间为7、14、21、28和35 d,倒置相差显微镜观察细胞的生长情况和形态变化,免疫荧光和流式细胞仪检测成肌细胞特异性抗原desmin和myosin的表达.结果 成功从大鼠脂肪组织分离、培养出ADSC,相关表面抗原表达检测证实其干细胞特性.诱导组细胞诱导28 d后呈现成肌细胞特有的"漩涡"样生长形态,单个细胞表现出多核化;免疫荧光和流式细胞仪检测显示,desmin和myosin的表达率在诱导28 d时达最高,分别为52.57%和50.04%,而诱导前和对照组细胞均呈阴性表达.结论 成功从大鼠脂肪组织分离、培养ADSC,含5-aza的诱导培养液可将其诱导分化为成肌细胞,诱导 28 d成肌细胞特异性抗原表达率最高.     

Poly I∶C刺激对裸鼹鼠体内自噬水平的影响

目的 研究多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐（Poly I∶C）对裸鼹鼠自噬水平的影响.方法 成年裸鼹鼠以及C57BL/6小鼠分别随机分成Poly I∶C给药组和对照组,分别腹腔注射Poly I∶C和生理盐水.Poly I∶C给药12h后,组织切片HE染色观察小肠组织的病理变化,电镜观察细胞结构的变化,实时定量PCR检测小肠组织中炎症相关因子IL-1、ATG5的mRNA表达情况,蛋白印迹检测小肠组织中自噬相关蛋白LC3B、Beclin 1表达情况.结果 Poly I∶C给药后,裸鼹鼠小肠组织未出现显著的病理变化,但C57BL/6小鼠小肠组织腺体部出现广泛性出血;电镜观察发现,裸鼹鼠小肠组织细胞中线粒体增多、变长,自噬体数量显著增加,而小鼠组织细胞线粒体有大量的空泡化,滑面内质网扩张;实时定量PCR检测未发现组织中IL-1、ATG5 mRNA表达有显著变化;蛋白印迹检测发现,给药后裸鼹鼠组织中LC3B蛋白表达显著上调（P＜0.05）,而C57BL/6小鼠则下调（P＜0.05）.结论 Poly I∶C给药引起裸鼹鼠自噬水平上调,同时,裸鼹鼠自噬水平的上调亦可以提高机体的适应能力,进而起到抵抗Poly I∶C损伤的作用.     

骨膜成骨细胞分离培养的方法

目的：探讨骨膜成骨细胞分离培养的最佳方法,为骨组织工程的研究提供稳定可靠的种子为源,方法：分别以组织块法,酶消化法和联合法分离培养兔骨成骨细胞,观察原代培养的成功率,细胞生长曲线,成骨细胞的表型特征,结果：组织块法原代培养耗时较长,成功率低,酶消化法细胞增殖快但有大量的杂细胞掺入,联合法提高了组织块成活率,并维持了较高的成骨细胞表型,结论：胶原 时预消化的联合法能够在较短时间内获得高纯度的成骨细胞,效果优于传统的组织块法和酶消化法,有望成为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

RNA干扰抑制Beclin1基因对裸鼹鼠成纤维细胞增殖与凋亡的影响

目的应用RNA干扰技术抑制自噬调控基因Beclin 1的表达,检测Beclin 1表达对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖与凋亡的影响以及p53、BAX、Bcl2等基因表达的影响。方法分别检测裸鼹鼠成纤维细胞经饥饿、H₂O₂刺激等处理后Beclin 1的表达,然后采用设计的Beclin l基因的干扰RNA及阴性对照分别瞬时转染裸鼹鼠成纤维细胞。采用real-time PCR及Western blot法检测沉默效果后,采用CCK-1实验检测沉默后细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,然后采用Western blot检测相关基因蛋白表达水平。结果饥饿与H₂O₂刺激均能导致Beclin 1表达水平的改变。采用gene expresso转染试剂对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞转染效率可达到90%以上,real-time PCR及Western blot结果显示所设计的Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表达。Beclin 1基因沉默后,裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖抑制率均显著高于对照组,细胞早期凋亡与晚期凋亡率均显著升高,同时p53、BAX、Bcl2、LC3B、p-AKT、mTOR等表达量下降。结论Beclin 1在裸鼹鼠成纤维细胞抵抗饥饿、H₂O₂刺激等过程中表达量显著变化,同时抑制Beclin 1的表达,可抑制裸鼹鼠细胞增殖,促进其凋亡,这提示Beclin 1基因对裸鼹鼠自噬、增殖、凋亡起到调控作用。     

乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定

目的探讨和建立适用于乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法乳小鼠心脏剪成组织块,用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶联合消化法分离细胞,再通过差速贴壁分离法分别收集、培养乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞。光学显微镜下分别观察成纤维细胞和心肌细胞的基本形态特征的变化,并对2种细胞行苏木素-伊红(HE)染色,用第2代心肌成纤维细胞行波形蛋白免疫荧光鉴定,而原代心肌细胞行α-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白和心肌肌球蛋白重链免疫荧光鉴定。结果差速贴壁分离法心肌成纤维细胞原代培养90 min基本贴壁,贴壁较早,培养第3～5代细胞生长良好,72 h心肌成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达97%;而心肌细胞贴壁较晚,24 h贴壁后部分心肌细胞出现自发性搏动现象,48 h后细胞逐渐展开,72 h后逐渐形成细胞簇并出现同步搏动,心肌肌球蛋白重链、心肌横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定心肌细胞纯度分别为95%、93%、95%。结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞,此方法成熟、稳定、有效,为研究心脏疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型。     

不同组织来源的成纤维细胞的生物学特性比较

目的 探讨来自政治家皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞的生物学特性。方法 对三种组织均采用组织块法进行细胞的原代培养,采用胰蛋白酶消化传代,分别利用绘制细胞生长曲线,^H-胸腺嘧啶掺入及^3H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖,DNA合成代谢及胶原合成等情况。并比较它们之间的差异。结果 瘢痕疙瘩成纤维细胞在细胞增殖、DNA合成代谢及胶原合成量等方面均明显高于正常皮肤及增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞。后两者之间有一定区别但无统计学意义。结论 不同组织来源的成纤维细胞其生物学行为亦有所区别,因此,在进行实验研究时应有一定的针对性。     

裸鼹鼠生化位点的初步研究

目的研究裸鼹鼠（NMR）的生化位点特征，初步建立裸鼹鼠生化位点的检测方法。方法以小鼠近交系的生化位点为参照，应用小鼠的检测方法，检测裸鼹鼠的11种同工酶的活性。结果裸鼹鼠的酯酶-1、转铁蛋白为慢带；葡萄糖磷酸异构酶-1、苹果酸酶-1、异柠檬酸脱氢酶-1为中间带；血红蛋白B链、肽酶-3、碱性磷酸酶-1、磷酸葡萄糖变位酶-1、酯酶-3、过氧化氢酶．2为快带。结论7只裸鼹鼠的11个生化位点为一致的条带，无多态性，表现为纯合型。