下调VEGF—C基因对乳癌细胞增殖和凋亡影响

目的 应用经过化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体外抑制血管内皮生长因子C(VEF-C)基因的表达, 探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰技术对乳癌基因治疗的可行性和特异性.方法 设计针对VEF-C基因的siRNA,选用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000作为转染试剂,以脂质体转染法将双链siRNA导入人乳癌细胞株MCF-7细胞,设立空白对照组(只加无血清无抗生素培养基)、脂质体组(每孔只加LipofectamineTM 2000 0.5 μL)、3个siRNA浓度梯度组(50、100、200 nmol/L)及siRNA SCR组(100 nmol/L),用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测siRNA对 MCF-7细胞增殖的影响,通过Hoechst 33258 染色观察MCF-7细胞的凋亡,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测转染前后VEF-C基因和p53基因的 mRNA及蛋白表达变化.结果 转染VEF-C siRNA 8 h后MCF-7细胞生长受到抑制,Hoechst 33258荧光染色显示转染siRNA 72 h后细胞内可见凋亡小体.VEF-C基因和p53基因 mRNA和蛋白水平表达明显降低(F=30.7～11.11,q=5.7～20.75,P<0.01),空白对照组、脂质体组和siRNA SCR组各指标差异无显著性(P>0.05).结论 化学修饰的siRNA介导的RNA干扰能下调靶基因VEF-C的表达和抑制MCF-7细胞增殖,乳癌中p53与VEF-C表达有关,提示突变型p53可能参与VEF-C表达的调控.     

RNA干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性影响

目的探讨RNA干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性的影响。方法构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-387。设置空白对照组(不加载体)、阴性对照组(加入pshRNA-survivin-NC)及siRNA转染组(加入pshRNA-survivin-387),用脂质体2000转染HepG2细胞,采用逆转录聚合酶链反应技术检测各组survivin基因mRNA表达水平。分别设置空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组、X线照射组、siRNA转染+X线照射组,收集各组细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数。结果 siRNA转染组survivin基因mRNA表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组,差异有显著性(F=218.93,q=17.73、18.66,P<0.05)。siRNA转染+X线照射组细胞凋亡率明显高于其他各组,差异有显著性(F=1 421.83,q=13.81～57.48,P<0.05);siRNA转染组及X线照射组与空白组、阴性组比较,细胞凋亡率也明显提高(q=17.55～39.10,P<0.05)。siRNA转染+X线照射组细胞存活分数显著低于其他各组(F=2870.58,q=15.32～72.51,P<0.05);siRNA转染组及单纯X线照射组细胞存活分数与空白对照组、阴性对照组比较也明显降低(q=11.14～73.90,P<0.05)。结论 pshRNA-survivin-387转染能抑制survivin基因表达,诱导肝癌细胞凋亡,增强肝癌细胞的放射敏感性。     

靶向survivin的siRNA并氟尿嘧啶转染对HepG2增殖影响

目的研究靶向survivin的小分子干扰RNA(siRNA)和氟尿嘧啶(5-FU)联用对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用及对凋亡的影响。方法将HepG2细胞分为空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组、siRNA转染组及5-FU+siRNA转染组。转染采用脂质体法。采用RT-PCR法分别检测HepG2细胞survivin mRNA转录水平;MTT法分别检测靶向survivin的siRNA和5-FU对HepG2细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测HepG2细胞凋亡情况。结果 siRNA转染组、5-FU+siRNA转染组survivin mRNA表达较空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组明显下降(F=326.78,q=5.78～7.12,P<0.05)。5-FU+siRNA转染组细胞增殖抑制率为51.58%±1.35%,与其他各组相比明显增高(F=1 293.24,q=15.31～82.26,P<0.01)。5-FU+siRNA转染组与其他各组相比细胞凋亡率明显增高(F=13 568.68,q=110.47～327.16,P<0.01)。结论将靶向survivin的siRNA和5-FU联合应用可以显著抑制肝癌细胞survivin基因表达,并协同抑制HepG2细胞增殖,共同发挥诱导细胞凋亡作用。     

KDR siRNA对乳癌细胞凋亡和NES1与RUNX3基因甲基化影响

目的探讨体外水平利用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)敲减含激酶插入区受体(KDR)基因治疗乳癌的可行性和特异性。方法采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000TM作为转染试剂,将针对人KDR基因的siRNA转染人乳癌细胞株MCF-7敲减KDR基因的表达。通过Hoechst 33258染色观察MCF-7细胞的凋亡情况;采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测NES1基因和RUNX3基因甲基化状态和mRNA的转录水平。结果靶向KDR的siRNA转染MCF-7细胞后可诱导细胞凋亡,NES1基因和RUNX3基因甲基化程度降低,出现非甲基化条带,同时mRNA表达上调。结论KDR siRNA在体外能逆转MCF-7细胞的NES1基因和RUNX3基因甲基化,并诱导细胞凋亡。     

抑制MCF-7乳癌细胞VEGF表达对树突细胞免疫功能影响

目的 探讨抑制MCF-7乳癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达对树突细胞(DC)免疫功能的影响.方法 针对VEGF基因设计小干扰RNA(siRNA),以脂质体转染法将 siRNA导入乳癌细胞MCF-7,RT-PCR 检测干扰VEGF基因后mRNA的表达,Western blotting法检测VEGF蛋白的表达,观察VEGF基因沉默效果.以MCF-7 乳癌细胞的培养上清和干扰VEGF基因后MCF-7 乳癌细胞培养上清液同时添加粒-单细胞集落刺激因子、白细胞介素-4、肿瘤坏死因子α培养正常异基因DC,利用MTT法和Hoechst33258检测DC刺激正常外周血T细胞增殖的能力及DC激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性;ELISA法检测DC培养上清液中白细胞介素12(IL-12)及DC与外周血单个核细胞(PBMC)共同培养液中干扰素γ(IFN-γ)的含量.结果 VEGF基因经siRNA处理24 h后,MCF-7 乳癌细胞VEGF mRNA和蛋白的表达明显降低,其诱生的DC与MCF-7 乳癌细胞培养上清液诱生的DC相比, siRNA处理DC刺激T淋巴细胞增殖能力、CTL杀伤活性以及DC分泌IL-12和协同刺激外周血PBMC分泌INF-γ的能力明显增强.结论 siRNA可靶向抑制乳癌MCF-7 细胞VEGF的表达,下调VEGF后的MCF-7 细胞上清液对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低.     

靶向mTOR siRNA的合成及对MCF-7细胞mTOR基因表达的影响

目的:合成靶向哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)siRNA,观察其对人乳癌MCF-7细胞mTOR基因表达的影响。方法:以mTOR基因434～452序列为靶点,设计并体外合成mTORsiRNA,用100和150nmol/L的siRNA转染MCF-7细胞24、48、72h,同时设无关对照组(转染非特异性siRNA)和正常对照组(不转染),运用免疫组化SP法和原位杂交技术检测各组细胞mTOR蛋白及mRNA的表达水平。结果:转染24、48和72h后,与各对照组相比,siRNA转染组细胞mTOR蛋白及mRNA的表达均降低(P均<0.05),2个siRNA转染组之间差异无统计学意义(P均>0.05)。不同时间点mTOR蛋白及mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:设计合成的siRNA可有效抑制乳癌MCF-7细胞mTOR基因的表达。     

RNA干扰HER2/neu对膀胱癌BIU-87细胞增殖和凋亡的影响

目的研究靶向HER2/neu基因的siRNA对膀胱癌BIU-87细胞增殖和凋亡的影响。方法化学合成的靶向HER2/neu基因siRNA在脂质体的介导下转染BIU-87细胞,实验分为HER2/neu siRNA组、空脂质体组、阴性siRNA序列组,以未转染BIU-87细胞为空白对照组。利用CCK-8法评价HER2/neu基因siRNA对BIU-87细胞体外生长的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测转染前后细胞中HER2/neu mRNA和蛋白表达水平的变化。结果转染HER2/neu siRNA后BIU-87细胞的存活率显著下降,从(82.37±0.90)%降低到(56.76±1.70)%,差异有统计学意义(P<0.05);同时能诱导细胞凋亡,HER2/neu siRNA组凋亡率达(45.60±0.70)%,与空白对照组、空脂质体组、阴性siRNA序列组比较差异有统计学意义(P<0.05);靶向HER2/neu基因siRNA能显著降低BIU-87细胞中HER2/neu mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论化学合成的靶向HER2/neu基因siRNA能有效抑制HER2/neu基因在BIU-87细胞中的表达,进而能有效抑制BIU-87细胞的增殖和诱导凋亡的作用。     

靶向survivin基因的siRNA对大肠癌细胞生物学特性的影响

目的 向大肠癌细胞Lovo中导入靶向survivin基因的siRNA,研究其对Lovo细胞生物学效应影响.方法 设计2条特异性靶向survivin基因的siRNA,体外转录法合成,通过脂质体导入Lovo细胞并检测转染后细胞内survivin基因表达水平及凋亡、增殖情况.结果 细胞内survivin mRNA表达水平降低,细胞凋亡率升高,增殖能力减弱.结论 所设计的靶向survivln基因的siRNA能有效降低目的 基因的mRNA表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞生长.为大肠癌基因治疗的可行性提供了有力的证据.     

Effect of RNAi-mediated gene silencing of HER2/neu on proliferation and apoptosis in bladder cancer cell line BIU-87

目的 研究靶向HER2/neu基因的siRNA对膀胱癌BIU-87细胞增殖和凋亡的影响.方法 化学合成的靶向HER2/neu基因siRNA在脂质体的介导下转染BIU-87细胞,实验分为HER2/neu siRNA组、空脂质体组、阴性siRNA序列组,以未转染BIU-87细胞为空白对照组.利用CCK-8法评价HER2/neu基因siRNA对BIU-87细胞体外生长的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测转染前后细胞中HER2/neu mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 转染HER2/neu siRNA后BIU-87细胞的存活率显著下降,从(82.37±0.90)％降低到(56.76±1.70)％,差异有统计学意义(P＜0.05);同时能诱导细胞凋亡,HER2/neu siRNA组凋亡率达(45.60±0.70)％,与空白对照组、空脂质体组、阴性siRNA序列组比较差异有统计学意义(P＜0.05);靶向HER2/neu基因siRNA能显著降低BIU-87细胞中HER2/neu mRNA和蛋白的表达(P＜0.05).结论 化学合成的靶向HER2/neu基因siRNA能有效抑制HER2/neu基因在BIU-87细胞中的表达,进而能有效抑制BIU-87细胞的增殖和诱导凋亡的作用.     

靶向survivin基因siRNA对喉癌细胞增殖、凋亡的影响

目的观察靶向survivin基因的siRNA对喉癌细胞Hep-2增殖和凋亡的影响,为喉癌的基因治疗提供有效靶点及技术。方法使用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将靶向survivin基因的siRNA转染至喉癌细胞株Hep-2;MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法检测对喉癌细胞Hep-2增殖的影响;RT-PCR检测喉癌细胞Hep-2survivin基因mRNA表达的变化;Western Blot检测survivin基因蛋白表达;流式细胞技术检测喉癌细胞Hep-2凋亡情况。结果各浓度survivin-siRNA转染组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于对照组（〈0.05）,survivinmRNA和蛋白表达有不同程度减弱,并且有明显的浓度依赖性,随着浓度的上升表达率下降。结论利用RNA干扰技术沉默survivin基因表达可以显著抑制喉癌细胞Hep-2细胞增殖,并在一定程度上诱导其自发凋亡,不同浓度survivin-siRNA转染能下调survivinmRNA和蛋白表达,靶向survivin基因的RNA干扰技术在喉癌的基因治疗中具有一定价值。