CSX/Nkx2.5基因在大鼠胚胎心脏发育过程中的表达

目的:检测CSX/Nkx2.5基因在大鼠胚胎心脏发育过程中的mRNA表达变化及其蛋白定位.方法:取大鼠胚胎d12、d15、d17、d19心脏,采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测心脏组织中CSX/Nkx2.5基因mRNA的表达丰度,并应用免疫组化的方法对其进行定位分析.结果:在大鼠胚胎d12、d15、d17、d19心脏中,CSX/Nkx2.5 基因mRNA均有表达,且呈逐渐上调趋势;其蛋白主要表达于心房、心室、肌小梁等处心肌组织,而在心内膜、心外膜、瓣膜、流出道、大血管等处未见表达.结论:CSX/Nkx2.5 基因的表达随大鼠胚胎心脏的生长发育逐渐上调,且特异表达于胚胎心脏心肌细胞的细胞核,与心脏发育密切相关.     

大鼠胚胎心脏的发育过程及基因HCY-2在大鼠胚胎心脏内的表达

目的 研究大鼠胚胎心脏的发育过程和同型半胱氨酸诱导基因(HCY-2)在大鼠胚胎心脏上的表达，为进一步探讨该基因与心血管疾病之间的关系奠定形态学基础。方法 分别于大鼠妊娠11～19d取胚胎，用组织学和免疫组织化学方法，观察大鼠胚胎心脏的发育过程和Hcy-2基因的表达并进行图像分析。结果 大鼠胚胎心脏11d出现第一房间隔，13d出现第二房间隔，14d心房不完全分隔完成；12d出现室间隔肌部，16d心室巳分隔完成。Hcy-2在大鼠胚胎心脏不同发育时期表达不同，11、12d表达强，13d表达减弱，14、15、16d表达又逐渐增强，17、18、19d表达强。结论 大鼠胚胎心脏内部分隔晚于小鼠；基因Hcy-2与心脏发育密切相关。     

Nodal信号通路相关基因NOMO1在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:研究斑马鱼NOMO1基因在早期胚胎发育过程中的时空表达情况?方法:首先克隆斑马鱼NOMO1同源基因全长cDNA,然后运用半定量RT－PCR技术初步检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎的表达情况,最后通过原位杂交技术检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的时空表达情况?结果:通过半定量RT－PCR及原位杂交技术显示NOMO1从受精卵时期开始即有表达,在24 hpf(受精后24 h)之前,NOMO1基因表达广泛,并主要集中在中?内胚层?从24 hpf开始其表达主要集中于神经系统如前脑?中脑?小脑?脊索前板?眼和耳囊等处?在心脏处也有少量表达?结论:NOMO1基因对斑马鱼早期胚胎发育具有一定的作用,推测NOMO1基因影响早期心脏发育?     

孕鼠维生素D缺乏对子鼠骨发育相关基因BMP-2?Cbfal?Dmp1表达的影响

目的:研究大鼠孕期维生素D缺乏对其子鼠骨发育相关基因BMP-2?Cbfa1?Dmp1表达的影响?方法:成熟雌性SD大鼠36只随机分为模型组和对照组各18只,模型组以不含维生素D的大鼠饲料避光喂养,对照组以标准饲料正常光照喂养?两周后与成熟SD雄性大鼠交配,分别取孕20天(E20 d)?生后1天(B1 d)和生后7天(B7 d) 子鼠左侧股骨?通过Real-TimePCR方法分别比较模型组和对照组胚胎和新生鼠长骨中BMP-2?Cbfa1?Dmp1基因在3个时间点表达的差异?结果:BMP-2 mRNA?Cbfa1 mRNA 及Dmp1 mRNA在E20 d?B1 d和B7 d的表达,模型组均明显低于对照组,差异有统计学意义(P < 0.05) ?结论:BMP-2?Cbfa1?Dmp1均为骨发育相关基因,孕鼠维生素D缺乏可下调子鼠长骨中BMP-2?Cbfa1?Dmp1的表达水平,从而可能影响子鼠骨骼的发育?     

大鼠胰腺发育过程中胰岛素释放功能完善的研究

目的: 明确大鼠胰腺发育不同时期胰岛素合成及释放相关基因的表达差异,探讨胰岛素分泌功能完善的过程? 方法:分离并提取SD大鼠胚胎发育12.5天(E12.5)?E15.5?E18.5?新生?出生后21天及成年大鼠胰腺组织,利用Affymetrix公司的高密度寡核苷酸芯片检测大鼠发育各阶段胰腺组织基因表达谱并分析胰岛素合成及释放相关基因的特异及差异表达情况?分别进行正常新生鼠?成年鼠血糖水平及正常新生第1?3?7?10?12天大鼠腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)?采用ELISA法测定新生鼠和成年鼠血中胰岛素浓度?新生大鼠胰岛细胞原代培养观察新生鼠胰岛细胞的形态?结果:在胰岛素合成及释放相关基因中,胰岛素基因及其特异性转录因子如PDX-1在大鼠E12.5~E15.5时即开始有表达,以后胰岛素基因持续存在且表达增多;胰岛素胞吐过程中的关键基因Syntaxin-1a?Vamp-2?Rab-3a?Munc13-1等从E15.5开始出现,以后表达量亦增多;而葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)相关基因中,葡萄糖转运体-2(Glut2)在胚胎早期开始表达,葡萄糖激酶(GCK)在胚胎中晚期才表达?自E18.5即检测到大鼠血中胰岛素的存在,随着胚胎的发育,血胰岛素浓度逐渐升高?新生大鼠对葡萄糖负荷不能耐受,出现IPGTT异常,出生1周以后IPGTT才逐渐趋于正常?新生鼠的胰岛形态与成年鼠相似,但体积相对较小,透亮度稍差?结论:大鼠胚胎胰腺发育早中期即已具备胰岛素合成及分泌的能力,但新生鼠刚出生时,其胰岛功能仍尚未完善,出生以后才逐渐对葡萄糖负荷有良好的反应性?     

小鼠NOMO1基因RNA干扰载体的构建及其功能的初步研究

目的:构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,比较其对P19细胞NOMO1基因的抑制效率,以研究NOMO1基因与P19细胞向心肌细胞方向分化的关系?方法:利用Designer3.0软件设计小鼠NOMO1基因干扰片段,合成shRNA序列,再行寡核苷酸双链的合成,退火后形成的寡核苷酸双链克隆到pGPU6/Hygro载体的黏性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒扩增,质粒DNA抽提,使用PstⅠ?BamHⅠ进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆?将小鼠NOMO1基因RNA干扰载体转染P19细胞,以RT-PCR技术验证NOMO1基因在P19细胞中的mRNA表达?以DMSO诱导分化方案诱导P19细胞向心肌细胞分化,采用定量 RT-PCR技术检测P19细胞中α-MHC等基因mRNA的表达,评估NOMO1与P19干细胞向心肌细胞方向分化的关系?结果:双酶切证实shRNA正确插入质粒,测序结果表明插入的序列正确?载体转染的P19细胞筛选稳定表达株,经RT-PCR和Western blot验证4个位点设计的干扰质粒对NOMO1在P19细胞中的mRNA表达均具有较高的抑制效率?转染后P19细胞的α-MHC基因mRNA表达则显著下调(P < 0.05)?结论:成功构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,为研究NOMO1基因与P19细胞向心肌细胞方向分化的关系提供了稳定的转染细胞工具,NOMO1可能通过诱导α-MHC等基因表达,促进P19干细胞向中胚层的分化?     

发育中Wistar大鼠大脑皮层甲基化结合蛋白-2基因表达变化

目的:研究甲基化结合蛋白-2(methyl-CpG-binding protein 2,mecp2)基因在发育中正常Wistar大鼠大脑皮层表达水平的变化.方法:应用实时定量PCR(real-time PCR),Northern印迹杂交对mecp2基因在正常Wistar大鼠发育的不同阶段:胚胎第15天(E15)、第17天(E17)、第19天(E19)、出生当日(P0),生后第7天(P7)、生后第14天(P14)、生后第28天(P28),成年期大鼠mRNA的表达水平进行定性、定量分析;应用Western印迹杂交对MeCP2的表达水平进行半定量分析.结果:mecp2基因是在正常Wistar大鼠大脑皮层中表达的mRNA,约为10kb.从胚胎至成年期的发育过程中,mecp2基因mRNA的表达虽有波动,但差异无显著性.mecp2基因在正常Wistar大鼠大脑皮层中仅表达一种MeCP2,相对分子质量为75 000.在不同发育阶段其表达水平表现为,胚胎E15表达水平最低,自胚胎E19始至成年期MeCP2表达水平较E15明显增高.生后第7日至成年期,各时间点间表达水平的变化差异没有显著性.结论:随着正常Wistar大鼠大脑皮层神经元的发育成熟,MeCP2的表达水平逐渐增高,说明MeCP2对神经元的成熟有重要作用,并可能与维持神经元的成熟状态有关.     

叶酸缺乏对孕鼠子代心脏中GATA-4表达的影响

目的：探讨叶酸缺乏孕鼠的子代心脏发育过程中GATA-4基因和蛋白的表达改变。方法：成熟雌性SD大鼠36只随机分为实验组和对照组各18只，分别喂以缺乏叶酸和添加叶酸的纯合饲料。两周后与成熟SD雄性大鼠交配。分别取孕13．5天（E13．5d）、孕17．5天（E17．5d）胚胎的心脏及新生鼠的心脏。用RT-PCR检测GATA-4基因mRNA的表达。Westem-blotting测GATA-4蛋白水平的表达。结果：GATA-4基因mRNA在E13．5d、E17．5d的胚胎心脏及新生鼠心脏中的表达量．实验组均显著低于对照组（P〈0．05）。GATA-4蛋白在E13．5d、E17．5d的胚胎心脏及新生鼠心脏中的表达量，实验组均显著低于对照组（P〈0．05）。结论：叶酸的缺乏影响GATA-4基因和蛋白水平的表达。可能导致心脏发生发育中形态的改变。从而造成心脏的功能缺陷。     

NKx2.5基因在孕鼠肥胖致胚胎心脏畸形中的表达及意义

目的探讨NKx2.5基因mRNA及其蛋白在肥胖孕鼠胚胎畸形心脏中的表达水平及相关意义。方法 3周龄SPF级SD雌鼠100只,随机分为两组:正常组(40只)给予基础饲料;高脂组(60只)给予高脂饲料。8周后,以高脂组体重超过正常组平均体重的20%且血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量显著高于正常组的作为肥胖雌鼠,随机抽取20只肥胖雌鼠和正常雌鼠分别与雄鼠交配获取肥胖组孕鼠和对照组孕鼠。取孕13、15、17、19 d胚胎鼠心脏,通过切片进行组织学观察以确定心脏畸形情况,采用RT-PCR法检测NKx2.5基因的mRNA表达,采用Western blot方法检测NKx2.5蛋白表达。结果肥胖组孕鼠胚胎心脏畸形率显著高于对照组孕鼠(P<0.01);肥胖组孕鼠各孕龄胚胎畸形心脏NKx2.5基因mRNA及其蛋白表达比对照组孕鼠正常胚胎显著降低(P<0.05)。结论孕鼠肥胖导致胚胎心脏畸形率升高;孕鼠肥胖抑制胚胎心脏NKx2.5基因和蛋白表达,可能导致心脏发生发育缺陷从而造成先天性心脏畸形。     

GATA-4基因在大鼠胚胎心脏中的表达

目的:检测GATA-4基因在大鼠胚胎心脏中的蛋白表达变化.方法:取大鼠胚胎12、15、19天心脏,应用Westernblot、免疫组化的方法进行半定量、定位分析.结果:免疫组化显示,GATA-4基因在房室肌、心内膜、心内膜垫、房室瓣及大动脉根部均有表达.Western blot显示.在胚胎12天心脏中,GATA-4基因已有较高表达;在胚胎15天表达明显上调,胚胎19天时表达又有所下降.结论:GATA-4随大鼠胚胎心脏的生长发育呈动态表达,GATA-4与心脏发育密切相关.     

β-catenin在大鼠胚胎肝脏发育和肝癌发生中的作用

目的探讨Wnt信号通路关键分子β-catenin在大鼠胚胎肝脏发育和肝癌发生中的作用。方法采用免疫组织化学方法观察β-catenin在12、16d胎龄大鼠、新生鼠、成年鼠以及肝癌模型鼠肝脏中的表达；同时用RT-PCR方法检测β-catenin mRNA在标本中的转录水平。结果免疫组化显示，在12d胎龄大鼠肝脏中，β-catenin在几乎所有的肝细胞浆中都有比较强的表达，部分细胞的核膜上也有阳性着色；在16d胎龄大鼠肝脏中，β-catenin在肝细胞浆中仍有表达，但是无论是表达强度还是阳性细胞的数量都较前时期有所下降。在大鼠肝癌细胞中，β-catenin的表达定位也以胞浆为主。而在新生鼠和成年大鼠的肝脏中则未见β-catenin表达。RT-PCR的结果显示，无论是在新生鼠、成年鼠肝脏还是胚胎以及肿瘤肝脏中均存在β-catenin的转录，而且转录水平没有明显的差异。结论Wnt／β-catenin信号传导通路在大鼠胚胎肝脏发育和肿瘤的发生中被激活。β-catenin蛋白在细胞浆中的积累可能不是因为转录水平的提高而是其未被降解所导致的。     

缺血和再灌注心肌NHE－1mRNA表达的变化

目的探讨缺血再灌注心肌钠氢交换蛋白-1(NHE-1)mRNA表达的变化.方法成年大鼠心脏Langendorff离体灌流,随机分为六组(n=6),给予(1)正常灌流30min;(2)低灌流缺血60min;(3)低灌流缺血60min及再灌注30min;(4)预处理后低灌流缺血60min(5)预处理后低灌流缺血60min再灌注30min;(6)老龄大鼠离体心脏低灌流缺血60min等不同条件处理.保留心肌,使用RT-PCR方法对比不同处理条件下心肌NHE-1表达的变化.结果(1)缺血组心肌(Ⅰ)NHE-1mRNA水平(0.734±0.053)较正常对照组(N)(0.300±0.007)明显升高(P＜0.05),再灌注组心肌(R)NHE-1的mRNA水平(0.281±0.019)较缺血组降低(P＜0.05),与正常组无明显差异(P＞0.05);(2)预处理缺血组心肌(Pi)NHE-1 mRNA水平(0.256±0.011)较缺血组心肌(0.734±0.053)明显降低(P＜0.05),预处理再灌注组心肌(Pr)NHE-1 mRNA水平(0.135±0.011)较再灌注组心肌(0.281±0. 019)降低(P＜0.05);(3)老龄大鼠低灌流缺血心肌(S)NHE-1的mRNA表达(0.787±0.021)与成年大鼠低灌流缺血心肌(Ⅰ)NHE-1的mRNA表达无明显统计学差异.结论低灌流缺血心肌NHE-1表达较正常灌流心肌明显升高,预处理可以明显降低缺血及再灌注心肌NHE-1的表达.     

正常人及大鼠心脏内皮素转换酶的分布

目的:了解正常人和大鼠心脏各部分内皮素转换酶(Endothelin-conveerting en-zyme,ECE)的分布。方法:采用半定量RT-PCR法检测ECE mRNA表达,同时根据外源性的巨内皮素-1转变为内皮素-1的量判定ECE活性。结果:正常人心脏各部位心肌均存在ECE,ECEmRNA表达和活性的分布特点一致:心房显著高于心室,左、右心房间及左、右心室和室间隔间无显著性差异。大鼠的ECE mRNA表达和活性分布规律与人相似。结论:正常人和大鼠心脏各组分均存在ECE,且两者的分布规律相似。     

氨基胍对大鼠心脏移植急性排斥期细胞凋亡与诱导型一氧化氮合酶的影响祆

目的:探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂氨基胍(AG)对大鼠心脏移植后急性排斥反应期细胞凋亡的影响。方法:分3组建立大鼠腹腔异位心脏移植模型:同系移植组、同种移植组、同种移植后AG治疗(应用AG(600mg/(kg·d))皮下注射)组。各组分别在术后第3d,5d,7d采集移植心肌的心室组织,观察移植心脏排斥反应情况,细胞凋亡情况及心肌组织中iNOS活性的变化。结果:①同种移植组和同种移植后AG治疗组排斥反应差异有统计学意义(χ2分别为11.98,12.70,P<0.05);②心脏移植后各级排斥反应中均可见细胞凋亡的存在,且随着心脏移植排斥反应的加重,心肌细胞凋亡的量也在增加;③同种移植后AG治疗组与同种移植组相比各时间段iNOS活性均明显升高,而与同系移植组相比,差异无统计学意义。结论:AG可以通过抑制心脏移植术后急性排斥期的iNOS活性,从而抑制细胞凋亡,保护移植心脏的功能。     

非T细胞来源细胞因子在小鼠心脏移植急性排斥反应模型中的表达

目的研究急性排斥反应性细胞因子在小鼠心脏移植中的表达状况,进一步阐明器官移植急性排斥反应的复杂发生机制。方法采用C57BL/6和Balb/c近交系小鼠,建立小鼠腹腔异位心脏移植模型。随机分为Balb/c-Balb/c同基因对照组(A组)和C57BL/6-Balb/c急性排斥反应组(B组)两组,每组26只。分别于移植术后1、3、5、7 d各处死5只小鼠留取移植心脏标本,采用RT-PCR及W estern印迹方法动态检测组织中IL-15、IL-2、TNF-α及IFN-γ的表达状况,同时行HE染色检测。另外,A、B两组各保留6只小鼠设为亚组,观察移植心脏存活时间。结果A组移植心均获长期存活(>100 d),B组移植心存活时间为8.0 d±0.9 d(t=251.95,P<0.01)。A组各个时间点移植心均未发现排斥现象,B组术后第3天开始出现排斥反应。A组各时间点IL-15 mRNA与TNF-αmRNA呈弱表达,IL-2 mRNA与IFN-γmRNA无表达。B组IL-15 mRNA、TNF-αmRNA、IL-2 mRNA及IFN-γmRNA均明显升高,于第5天达到高峰。A组各时间点可见IL-15、TNF-α、IFN-γ和IL-2蛋白的低水平表达;B组IL-15与IL-2自术后第3天始、TNF-α与IFN-γ自术后第1天始,蛋白表达水平开始升高。结论多种细胞因子,包括非T细胞来源细胞因子,参与了同种异体急性排斥反应的发生。     

小鼠生后发育过程中子宫NGF基因表达的变化

目的：观察小鼠生后发育过程中子宫组织神经生长因子（NGF）基因表达的变化,探讨NGF在子宫发育及正常功能维持过程中的生物学作用。方法：采用RT－PCR法,半定量分析生后1天、7天、15天、60天及90天小鼠子宫组织中NGFmRNA的表达变化。结果：RT－PCR结果显示,小鼠出生仅1天,其子宫组织即可表达NGFmRNA,随着出生时间的增加,子宫组织NGFmRNA的表达量增加,出生30天时达高峰;小鼠成年后子宫NGFmRNA的表达仍维持在一定水平.结论：子宫组织可以表达NGFmRNA,其表达量随鼠龄的变化而有所改变。