RNA干涉（RNAi）抑制宫颈癌细胞SiHa中E7基因表达的实验研究

目的探讨HPV16 E7特异性小干涉RNA（siRNA）表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的抑制作用。方法构建HPV16 E7特异性表达载体，利用脂质粒转染SiHa细胞，用RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白的影响。结果两条siRNA均能有效抑制E7mRNA的转录表达，其中以pshRNA-HPV16 E71作用效果最明显,在转染后72h，对E7 mRNA和蛋白的抑制率分剐为78．4％和57．6％。结论HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达有抑制作用。     

载体介导的RNAi技术抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达

目的 探讨HPV16E7特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞E7基因的抑制作用.方法 构建HPV16 E7特异性siRNA表达载体,利用脂质体转染CaSki细胞,以荧光定量RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白表达的影响.结果 3种表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7基因mRNA和蛋白的表达,其中载体P1抑制作用最强,在转染后3周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92.86%和81.0%.结论 HPV16E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达.     

siRNA 表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞增殖的实验研究

目的 观察HPV16E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响.方法 利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体转染SiHa细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E7 mRNA的变化;流式细胞仪检测E7蛋白的变化和细胞周期的分布;MTT法检测细胞增殖的变化.结果 HPV16E7 siRNA表达载体可明显抑制SiHa细胞E7 mRNA和E7蛋白的表达,抑制率分别为92.15%、84.30%;阻滞SiHa细胞由G1期进入S期;抑制细胞的生长.结论 HPV16E7 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖.     

RNA干扰HPV16 E6基因表达对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

目的：探讨HPV16 E6小干扰RNA（siRNA）对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响。方法：利用化学合成的方法,合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染SiHa细胞。应用荧光定量RT—PCR和Western—blot检测HPV16 E6mRNA及其蛋白水平的表达。MTT法绘制细胞生长曲线。流式细胞术评价HPV16 E6siRNA对细胞周期的影响。结果：HPV16 E6siRNA转染细胞48h及72h后,细胞内HPV16 E6mRNA及蛋白表达量明显下调,与HPV16 E6阴性对照组及空白组比较[48h（1．85±0．15）vs（2．14±0．13）,（2．29±0．11）;72h（1．82±0．06）vs（2．32±0．14）,（2．35±0．23）],差异有显著性意义（P〈0．01）;MTT显示细胞生长明显受到抑制;流式细胞术‘检测显示,E6siRNA可将细胞阻滞在G1期。结论：HPV16 E6siRNA能抑制SiHa细胞增殖。     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录，通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA），借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞，通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型，将E6 siRNA直接注入瘤体，观察肿瘤体积的变化，肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色，观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少，9d时有所恢复；流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示，转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长，HPV16 E6蛋白表达明显受抑，肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加，重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。     

siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响

目的: 观察HPV16 E6 siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响.方法: 利用脂质体将HPV16 E6特异性siRNA表达载体转染Caski细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E6 mRNA的变化,流式细胞仪检测E6蛋白和细胞凋亡率的变化,MTT法和细胞克隆法检测细胞增殖的变化.结果: HPV16 E6 siRNA表达载体可明显抑制Caski细胞E6 mRNA和E6蛋白的表达,抑制率分别为89.5%和98.1%;表达载体可明显增加细胞凋亡率,抑制细胞的增殖和克隆的形成.结论: HPV16 E6 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达,增加细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖和克隆的形成.     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体，感染HPV16阳性宫颈癌细胞，筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体，脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317，G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，收集病毒上清，感染靶细胞SiHa，G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达，细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，病毒感染靶细胞SiHa后，筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆，RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达，HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响

目的观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。方法化学合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长曲线、活细胞率及细胞生长抑制率。运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化。结果转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制。流式细胞术结果显示并未将细胞阻滞在G1期。实时荧光定量RT-PCR显示,转染24h,E6 mRNA的表达比空白组降低了20.11倍(P<0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化。转染48h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高。结论HPV16 E6 siRNA可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用。     

化学合成siRNA沉默宫颈癌SiHa细胞E6基因表达的进一步研究

目的 探讨靶向HPV16 E6基因特异性siRNA对SiHa细胞E6和E7基因表达的沉默效果,以及沉默作用对pRb、P53、Survivin和VEGF-C蛋白表达的影响.方法 化学合成靶向HPV16 E6基因的siRNA,脂质体法转染SiHa细胞.半定量RT-PCR检测siRNA对SiHa细胞E6和E7基因转录表达的影响;Western Blotting法检测pRb、P53、Survivin和VEGF-C蛋白的表达.结果 RT-PCR检测结果显示,转染siRNA后24、48和72 h组SiHa细胞E6和E7 mRNA表达水平均明显低于对照组(F=80.71、182.18,P<0.05).Western Blotting结果显示,与对照组相比,转染组pRb和P53蛋白表达明显升高(F=59.78、29.00,P<0.05),VEGF-C蛋白表达明显降低(F=7.58,P<0.05),Survivin蛋白的表达则没有发生明显变化(F=2.28,P>0.05).结论 HPV16 E6特异性siRNA能同时抑制SiHa细胞内E6和E7基因的表达,进而引起P53、pRb以及VEGF-C蛋白表达水平的改变.     

HPV16 E6基因特异性RNA干扰表达载体的构建及对HPV16 E6基因抑制作用的研究

目的:构建针对HPV16 E6基因的RNA干扰表达载体,并研究其对宫颈癌HPV16 E6基因的抑制作用。方法:针对HPV16 E6基因序列设计shRNA(short hairpin RNAs,shRNAs)片断,构建针对HPV16 E6基因的RNA干扰(RNA interference,RN Ai)质粒表达载体,脂质体法转染宫颈癌Caski细胞株,应用荧光定量PCR及流式细胞术检测其对HPV16 E6 mRNA及蛋白表达的影响。结果:经PCR及测序证实3种表达载体构建成功,细胞试验表明3种表达载体均抑制了HPV16 E6的mRNA及蛋白的表达,其中CaskiB细胞HPV16E6mRNA的抑制率为89.5%,蛋白抑制率达98.1%。结论:RNAi表达载体可以有效的抑制HPV16 E6基因的表达。     

HPV16 E6对宫颈癌 E-cadherin 表达水平和基因甲基化的影响

目的：探讨 HPV16E6对宫颈癌组织和细胞中 E-cadherin 表达水平及基因甲基化状态的影响。方法：检测20例宫颈鳞癌组织及12例正常宫颈组织中 HPV16E6、E-cadherin 蛋白表达水平及 E-cadherin 甲基化率。采用 Siha 细胞构建 HPV16E6沉默细胞株,检测 siRNAE6对细胞 E-cadherinmRNA 和蛋白表达影响,以及E-cadherin 甲基化状态。结果：HPV16E6蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达高于正常宫颈组织,E-cadherin 蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达低于正常宫颈组织。正常宫颈组织均未扩增出 E-cadherin 基因甲基化条带;宫颈鳞癌组织中,E-cadherin 基因甲基化检出率为65.0%。筛选得到 HPV16E6稳定下调的 Siha 细胞系。E-cadherinmRNA 及蛋白表达在 siRNAE6组均显著高于空载体组和空白对照组。E-cadherin 基因甲基化扩增条带在 siRNAE6组呈弱阳性,而在空载体组及空白对照组呈强阳性。结论：HPV16E6可引起宫颈癌组织和细胞中 E-cadherin 基因甲基化,并可导致 E-cadherinmRNA 及蛋白的表达水平下调。     

Association of defective HLA-Ⅰ expression with antigen processing machinery and their association with clinicopathological characteristics in Kazak patients with esophageal cancer

Background It has been confirmed that defective expression of human leukocyte antigen class Ⅰ (HLA-Ⅰ) molecules can contribute to the immune evasion of cancer cells in some types of cancer. The aim of this study was to examine the expression of HLA class Ⅰ antigen and the antigen-processing machinery (APM) components in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and their role in high risk human papillomavirus (HPV) infection, and to analyze their association with histopathological characteristics in the Kazak ethnic group.Methods A total of 50 formalin-fixed, paraffin-embedded ESCC lesions were collected from the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, China. The expression levels of HLA-Ⅰ antigen and APM components were determined by immunohistochemistry; the HPV DNA were detected using polymerase chain reaction (PCR).Results A high frequency of down-regulation or loss of expression of HLA and APM components were found in esophageal cancer in Kazak people. HLA-Ⅰ, TAP1, CNX, LMP7, Erp57, Tapasin and ERAP1 were down-regulated in 68%,44%, 48%, 40%, 52%, 32% and 20% of ESCC lesions then, respectively. The loss of expression of HLA-Ⅰ antigen was significantly correlated with part of the APM components and positively correlated with high risk HPV16 infection. TAP1,CNX, LMP7, Erp57 and Tapasin loss were significantly associated with tumor grading, lymph node metastasis and depth of invasion (P＜0.05).Conclusion Our results suggest that APM component defects are a mechanism underlying HLA-Ⅰ antigen down-regulation in ESCC lesions, and indicate that the loss expression of HLA-Ⅰ and APM components will become an important marker of ESCC and analysis of HLA-Ⅰ and APM component expression can provide useful prognostic information for patients with ESCC from the Kazak ethnic group.