siRNA of ADAM17 gene induces apoptosis, proliferation inhibition and enhances the effects of genistein on HeoG2 cells

Objective:To investigate the effects of siRNA of ADAM17 gene and genistein on apoptosis and the inhibition of proliferation in HepG2 cells in an attempt to seek an effective therapy for hepatocellular carinoma. Methods:Ceils were divided into control groups and experimental groups and siRNA was used to silence the ADAM17 gene, alone and in combination with genistein. Cells were harvested several time periods and assessed for proliferation and apoptosis. Proliferation was assayed by MTT at 24, 48, 72 and 96 hours following treatment and apoptosis was assessed by flow cytometric analysis at 48 hours. Results:In siRNA groups, proliferation of cells was significantly inhibited compared to the control groups at 24, 48 and 72 hours(P< 0.05), and apoptosis was significantly increased at 48 hours(P< 0.01);In genistein groups, proliferation was inhibited at 24, 48, 72 and 96 hours, and the apoptosis ratio was significantly a further significant decrease of proliferation and increase in apoptosis compared with either treatment alone. Conclusion:The ADAM17 gene could be an effective target, and genistein couM be a useful agent, in the treatment of hepatocellular carcinoma, siRNA of ADAM17 gene and genistein both inhibited HepG2 cells proliferation and promoted apoptosis, and further, the combination of these treatments had a greater effect than either treatment alone.     

Bcr/abl融合基因的小干扰RNA对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察特异性bcr/abl融合基因的siRNA对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法　设计并化学合成bcr/abl融合基因融合位点b3:a2 21个核苷酸 siRNA作用于K562细胞，用WST-8法检测细胞增殖抑制率；RT-PCR 检测 bcr/abl mRNA表达水平；PI单染流式细胞仪检测细胞周期；Annexin V-PI双染测定细胞凋亡比例；Hochest33258 染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果 ①Bcr/abl siRNA作用K562细胞24h,48h,72h后，明显抑制K562细胞增殖，各浓度组间的增殖抑制率无明显差异(p>0.05)；②Bcr/abl siRNA能显着下调bcr/abl mRNA水平，各浓度组间差异无显著性(p>0.05)；③Bcr/abl siRNA作用组细胞周期阻滞于G1期；④Bcr/abl siRNA作用后细胞出现明显的早期凋亡群，各浓度组间的早期凋亡率差异无统计学意义(p>0.05)，细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论 　特异性bcr/abl siRNA可显着抑制K562细胞bcr/abl融合基因的表达，抑制细胞的增殖，诱导凋亡，但其作用未显示明显的剂量依赖性。     

干扰ADAM17表达可降低人结肠癌细胞对西妥昔单抗耐药

目的研究ADAM17的表达与结肠癌SW480细胞对西妥昔单抗耐药相关性。方法通过Western blot法检测结肠癌细胞 系ADAM17的表达情况,筛选出高表达ADAM17的结肠癌细胞株做为目标细胞株;采用siRNA片段干扰结肠癌细胞ADAM17 的表达,Western blot验证干扰效果;100 μg/mL的西妥昔单抗处理细胞24 h后,FITC/PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡情况; Transwell实验检测ADAM17不同表达状态下的结肠癌细胞的迁移能力;运用Western blot法,检测在ADAM17不同表达状态 下的结肠癌细胞EGFR、AKT的磷酸化水平。结果人结肠癌SW480 细胞株中ADAM17 表达较高（P<0.05）。siRNA-1 和 siRNA-2干扰片段可显著降低SW480株ADAM17表达（P<0.05）。ADAM17表达被干扰后的SW480细胞对西妥昔单抗敏感性 显著上升（P<0.05）。干扰ADAM17 表达后,在西妥昔单抗药物作用下SW480 细胞迁移能力显著降低（P<0.05）。干扰了 ADAM17 表达后,SW480 细胞实验组的p-EGFR、p-AKT较对照组组显著降低（P<0.001）。结论干扰ADAM17 表达可抑制 EGFR-AKT通路激活从而减少人结肠癌SW480细胞对西妥昔单抗耐药。     

siRNA抑制syk基因对外周T细胞淋巴瘤细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨siRNA抑制脾酪氨酸激酶(syk)基因后对外周T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78细胞增殖与凋亡的影响.方法 针对syk基因特异靶点设计3条siRNA(siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3),采用电穿孔法转染外周T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78,同时设Mock组和siRNA-NC组,转染48 h后,分别用RT-PCR和Western blot技术检测syk mRNA和蛋白的表达水平,筛选出最有效的syk siRNA;syk siRNA转染HUT-78后分别用软琼脂克隆形成实验检测syk下调后HUT-78细胞的克隆形成能力,MTT法检测干扰24、48、72 h后细胞增殖情况,流式细胞术检测syk下调后HUT-78细胞的凋亡情况.结果 RT-PCR和Western blot结果显示,与Mock组和siRNA-NC组相比,3条siRNA均能有效降低HUT-78细胞中syk mRNA和蛋白的表达,其中syk siRNA-1抑制效果最明显.克隆形成实验显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的克隆形成能力与Mock组相比明显下降(P<0.05);MTT实验结果显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的增殖能力与Mock组相比显著下降(P<0.05);流式细胞术结果显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的凋亡比例明显高于Mock组(P<0.05).结论 siRNA下调syk基因表达后可抑制外周T细胞淋巴瘤细胞的增殖、克隆形成,促进凋亡,推测syk基因在外周T细胞淋巴瘤的发生发展中发挥重要作用,有可能成为外周T细胞淋巴瘤基因治疗的新靶点.     

COX-2 siRNA诱导人肝癌Hep3B细胞凋亡实验研究

目的:观察COX-2在人肝癌细胞Hep3B中的表达及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默COX-2基因对COX-2 mRNA和蛋白表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:将siRNA-COX-2质粒载体转染Hep3B细胞,WST-8法检测细胞增殖抑制情况,透射电镜观察凋亡小体出现情况;筛选单克隆细胞株Hep3B-sh,采用RT-PCR和Western blotting检测COX-2 mRNA和蛋白情况。结果:siRNA-COX-2能抑制Hep3B细胞的增殖,稳定转染pshRNA-COX-2可使Hep3B细胞中COX-2 mRNA及蛋白的表达明显减弱(P<0.01);透射电镜下可见凋亡小体出现,发生凋亡细胞数增加。结论:COX-2siRNA能有效抑制肝癌Hep3B细胞中COX-2的表达和细胞的增殖,促进凋亡发生,为肝细胞癌基因治疗提供实验依据和治疗靶点。     

ADAM17-shRNA在缺氧条件下对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的：研究在缺氧环境下靶向针对解聚素-金属蛋白酶17（ADAM17）的短发夹状 RNA（shRNA）对人乳腺癌 MCF-7细胞增殖的影响。方法针对 ADAM17设计4个特异性的 ADAM17-shRNA,经电穿孔法转染 MCF-7细胞。缺氧条件下培养细胞。试验分为：对照组（空白磷酸盐缓冲液）、无义序列组（转染无义序列 ADAM17-shRNA）和 shRNA 转染组（转染 ADAM17-shRNA,选择沉默 ADAM17基因效率最高的 shRNA 用于后续试验）。分别采用实时荧光定量 PCR、iCELLigence、流式细胞仪检测细胞 ADAM17 mRNA 的表达水平、细胞增殖活性和细胞周期变化。结果4个 shRNA 转染组对 MCF-7细胞的 ADAM17基因表达均有沉默作用,与对照组及无义序列组相比,差异具有统计学意义（P ＜0．05）,尤以 shRNA1219抑制率最高（F ＝5．11, P ＜0．01）。shRNA 转染组的细胞生长速度和增殖活性较对照组和无义序列组显著降低,差异有统计学意义（P ＜0．05）。shRNA转染组的绝大多数细胞停留在 G0／G1期（73．35±2．45）,与对照组（62．56±2．35）、无义序列组（62．68±1．20）相比较,差异有统计学意义（P ＜0．05）,细胞周期进展明显延缓。结论 ADAM17-shRNA 在缺氧条件下抑制乳腺癌细胞 MCF-7的增殖。     

CXCR4基因158沉默对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡及迁移能力的影响

目的 探讨CXCR4基因沉默后对人膀胱癌T24细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。 方法 将T24细胞分为3组,即干扰组、阴性对照组和空白对照组。采用阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将靶向沉默CXCR4基因的小干扰RNA(siRNA)序列转染至膀胱癌T24细胞株中,Western-blot检测转染后T24细胞中CXCR4蛋白的表达水平,MTT比色法检测细胞凋亡,Transwell迁移试验观察T24细胞迁移能力。 结果 转染siRNA后,CXCR4蛋白表达量明显下调(P<0.05),与空白对照组及阴性对照组的T24细胞比较,沉默CXCR4基因后,显著抑制膀胱癌T24细胞的增殖活性(均为P<0.05),促进T24细胞凋亡(均为P<0.05); Transwell实验结果提示,RNAi干扰CXCR4表达后能显著抑制膀胱癌T24细胞的迁移能力(P<0.05)。 结论 RNAi干扰CXCR4表达水平能够抑制T24细胞增殖、促进细胞凋亡及降低细胞的迁移能力,推测CXCR4基因可能是膀胱肿瘤细胞增殖及迁移的重要调控因子之一。     

肾损伤因子-1在脂多糖诱导的HK-2细胞炎症反应中的作用

目的：分析肾损伤因子-1（KIM-1）在脂多糖（LPS）诱导HK-2细胞炎症模型中的表达并探讨其可能参与的生物学进程。方法：LPS刺激人肾小管上皮HK-2细胞诱导细胞炎症模型,CCK-8比色法分析LPS对HK-2细胞株体外生长的抑制作用;RT-PCR和Western blot实验分析KIM-1在正常组和LPS诱导组中的表达差异;设计siRNA靶向干扰KIM-1基因的表达,分析其对LPS诱导下HK-2细胞生长抑制作用的影响;Hoechst33342/PI双染法分析LPS诱导下对照组和siRNA干扰组细胞凋亡的影响。结果：50、100 μg/mL终浓度的LPS处理24 h和48 h后能抑制HK-2细胞增殖,与对照组比差异有统计学意义（P＜0.05）;KIM-1和IL-6基因和蛋白表达水平在LPS处理组中较对照组明显上调,且具有浓度依赖性,差异有统计学意义（P＜0.05）;LPS处理组中Hoechst33342染色阳性细胞比例明显高于对照组;siRNA转染组中KIM-1和IL-6基因和蛋白表达水平均明显低于siRNA-NC组,在LPS作用下siRNA转染组HK-2细胞增殖率明显高于siRNA-NC组,差异有统计学意义（P＜0.05）;在siRNA转染组中,Hoechst33342染色强度均低于siRNA-NC组,提示靶向KIM-1基因siRNA转染可以抑制LPS诱导的细胞凋亡作用。结论：LPS可以诱导HK-2细胞增殖受抑和凋亡,并且上调KIM-1和IL-6基因表达;KIM-1可能通过调节细胞凋亡和生长抑制过程参与细胞炎症反应。     

RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰技术对人肝癌HepG2细胞mTOR的表达及细胞增殖与凋亡的影响.方法:体外合成mTOR siRNA,并转染HepG2细胞,同时设无义对照组(转染无义siRNA)、空白对照组(转染空脂质体)及正常对照组(不转染).采用western blot法检测各组HepG2细胞的mTOR蛋白表达;应用MTT法检测...     

解整合素金属蛋白酶10基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体,为进一步体内外实验研究提供基础。方法:筛选确定ADAM10基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与LentiLox3.7载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用重组慢病毒转导传代心肌细胞(H9C2),通过Western blotting检测心肌细胞ADAM10的蛋白表达。结果:获得的载体插入ADAM10的shRNA核苷酸链序列正确,包装的慢病毒颗粒转导心肌细胞,与对照组比较ADAM10 shRNA转染成功抑制ADAM10蛋白表达。结论:成功构建AD-AM10 shRNA慢病毒载体,为其在扩张型心肌病(DCM)中的生物学功能研究奠定基础。