内皮细胞对结肠癌细胞系SW480中CD133~+细胞表达VEGF的影响

目的 从结肠癌细胞系SW480中分离结肠癌干细胞,并检测内皮细胞对这些细胞表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响.方法 分别利用免疫磁珠分选技术和尤血清培养法富集CD133+细胞,利用MTT法和平板克隆形成实验检测其生物学特性;采用细胞免疫荧光法检测SW480细胞和CD133+细胞中CD133及VEGF的表达;将SW480细胞或磁珠分选CD133+细胞分别在6种培养条件下进行培养:SW480细胞在含血清培养基(serum-supplied medium,SSM)中培养、SW480细胞在尤血清培养基(serum-free medium,SFM)中培养、磁珠分选CD133+细胞在SFM中培养、SW480细胞与内皮细胞在SSM中共培养、SW480细胞与内皮细胞在SFM共培养、磁珠分选CD133+细胞与内皮细胞在SFM共培养,利用免疫组织化学法检测不同培养条件下结肠癌细胞中CD133及VEGF的表达情况.结果 SW480细胞系中存在少量的CD133+细胞,这些细胞能够连续传代并且表现出更强的增殖潜力以及克隆形成能力.经细胞免疫荧光法检测发现SW480细胞高表达VEGF,低表达CD133,而免疫磁珠分选的CD133+细胞所形成的细胞球低表达VEGF,高表达CD133.无血清培养条件下的SW480细胞随着时间的延长CD133表达率逐渐增加,添加内皮细胞诱导后无血清培养的SW480细胞与前者相比CD133阳性率显著增加(P<0.05).经过1周的连续培养后,CD133+细胞表达VEGF的比例没有变化,添加内皮细胞诱导1周后,CD133+细胞表达VEGF的比例显著增加(P相似文献   

结肠癌细胞株SW480中CD133~+的分选及Bmi-1基因的表达

目的:观察结肠癌细胞株SW480中CD133+和CD133-细胞的肿瘤干细胞样生物学特性,并分析CD133+和CD133-细胞中Bmi-1基因的表达量的差异。方法:采用流式细胞仪分选出CD133+和CD133-细胞,观察对比CD133+和CD133-细胞体外成球能力及增殖能力。用Real-time PCR检测CD133+和CD133-细胞中Bmi-1基因的表达量。结果:(1)SW480细胞中CD133+细胞所占比例为7.02%。(2)CD133+细胞体外无血清培养4 d后可成球且速度生长;CD133-细胞在干细胞培养基中不能形成细胞球,但在含血清的培养基中能贴壁分化,连续传代。无血清培养基中,CD133+细胞增殖能力强于CD133-细胞。(3)Bmi-1 m RNA在CD133+细胞的中表达显著高于CD133-细胞。结论:结肠癌细胞株SW480中CD133+所占比例很少,但其增殖能力强,Bmi-1 m RNA在CD133+细胞的中高表达,可能与肿瘤的发生发展有关。     

外源性Muc1、Survivin和Nanog基因启动子在结肠癌干细胞中的表达活性

目的 探讨结肠癌干细胞中不同基因启动子的活性,寻找可能用于结肠癌干细胞靶向治疗的启动子.方法 应用流式细胞仪分选人结肠癌HCT116细胞系中CD133+ CD44+标记的肿瘤干细胞.采用PCR技术获取Nanog、Muc1和Survivin基因启动子并分别克隆入pGL3-basic质粒.将含有启动子的pGL3-basic质粒和pGL3-control质粒分别与pRL-sv40共转染结肠癌细胞(HCT116、SW620、HT29)、结肠癌干细胞(CD133+ CD44+ HCT116)及人正常肝细胞(QSG7701),通过检测双荧光素酶活性以测定启动子活性.结果 pGL3-basic-Nanog、pGL3-basic-Muc1、pGL3-basic-Survivin经测序鉴定正确.HCT116细胞系中CD133+ CD44+细胞比率约占42.2％.双荧光素酶活性检测显示:在HCT116、SW620、HT29和CD133+ CD44+ HCT116细胞中,Muc1与Survivin均表现出了较强的活性,而在正常细胞QSG7701中活性较低.结论 Muc1、Survivin启动子可能是用于靶向结肠癌干细胞治疗的有效候选启动子.     

结肠癌细胞体外模拟缺氧的相关研究

目的研究结肠癌细胞SW480与CD133+SW480肿瘤干细胞亚群对CoCl2模拟缺氧的反应性,及缺氧后抗凋亡、血管生成等相关基因mRNA水平表达的变化。方法 Western blotting比较SW480经不同浓度、不同时间CoCl2模拟缺氧后缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的差异;免疫磁珠分选(MACS)CD133+SW480肿瘤干细胞亚群,流式细胞术检测其中CD133+细胞比例,选取稳定SW480细胞HIF-1α表达的最佳CoCl2浓度和时间作用后,Western blotting比较SW480细胞与CD133+SW480肿瘤干细胞亚群HIF-1α的表达差异;观察缺氧对肿瘤干细胞球形成和增殖能力的影响;实时定量PCR比较SW480经CoCl2模拟缺氧后结肠癌干细胞表面标志CD133(PROM1)、抗凋亡基因survivin、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA水平表达的差异。结果 SW480细胞经200μmol/L CoCl2模拟缺氧8 h,HIF-1α表达量最高;经MACS分选所得CD133+SW480细胞中,CD133+细胞比例为85.56±0.89%;CD133+SW480亚群200μmol/L CoCl2模拟缺氧8 h未见HIF-1α表达;CoCl2模拟缺氧培养后CD133+SW480肿瘤干细胞亚群无血清培养肿瘤干细胞球形成率较常规培养明显增强;SW480经CoCl2模拟缺氧其CD133、survivin、VEGF等mRNA表达分别升高1.607±0.103倍(P<0.05)、2.745±0.370倍(P<0.05)、3.798±0.091倍(P<0.05)。结论 (1)CoCl2能够在体外模拟结肠癌细胞缺氧,稳定HIF-1α的表达;(2)结肠癌细胞模拟缺氧后HIF-1α的表达与CoCl2呈浓度和时间依赖性;(3)CD133抗体标记免疫磁珠分选SW480细胞后,CD133+SW480细胞有较高得率和细胞活性;(4)缺氧可使肿瘤干细胞球形成能力增强,CD133+SW480肿瘤干细胞亚群较普通SW480更能够耐受缺氧,肿瘤干细胞具有不同于普通肿瘤细胞的特殊生物学特性;(5)缺氧可改变肿瘤细胞表型,促进其向肿瘤干细胞转化,并能够增强肿瘤抗凋亡能力和血管形成能力。     

免疫磁珠法分选人脑胶质瘤干细胞的体外培养及鉴定

目的:旨在从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞、进行体外培养并对其干细胞特性加以鉴定,以期对后续个体化敏感药物化疗奠定基础。方法:采用以CD133为标志的免疫磁珠法从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞并进行体外培养,通过免疫荧光技术检测干细胞标志物CD133、Nestin,干细胞特性加以鉴定。结果:新鲜人脑胶质母细胞培养得到悬浮生长的肿瘤干细胞球,其能在体外自我更新、增殖,形成新的克隆性细胞球,保持连续稳定的传代,能表达神经干细胞表面标志物CD133。在含血清培养基中能够分化为与原肿瘤组织相似的贴壁生长的细胞。结论:胶质母瘤细胞株中存在的一小部分CD133+胶质瘤细胞具有干细胞的属性,并能稳定传代增生。     

CD133~+人脐血造血祖细胞的干性维持培养及鉴定

目的从人脐带血中分选出CD133+造血祖细胞,并进行长时间干性维持培养。方法通过免疫磁珠法分选出人脐带血中的CD133+造血祖细胞,经流式细胞仪检测免疫磁珠分选后的CD133+造血祖细胞。采用五种方法扩增培养该细胞,8周后,再通过细胞形态学、流式细胞术、免疫细胞化学和免疫荧光对细胞进行干性鉴定,探索最佳干性维持培养方法。结果通过免疫磁珠法可以从人脐带血中分选出80%以上的CD133+造血祖细胞。采用优化的无血清培养基培养8周之后,CD133+造血祖细胞可得到有效扩增。而其他的培养基会使CD133+造血祖细胞由半悬浮细胞分化为梭形贴壁细胞,并且细胞状态欠佳。结论利用免疫磁珠法分选出的CD133+造血祖细胞,采用优化的无血清培养基能够有效扩增该细胞,并可长期有效的维持其干性。     

CD133+人脐血造血祖细胞的干性维持培养及鉴定

摘要：目的从人脐带血中分选出CD133+造血祖细胞,并进行长时间干性维持培养。方法通过免疫磁珠法分选出人脐带血中
的CD133+造血祖细胞,经流式细胞仪检测免疫磁珠分选后的CD133+造血祖细胞。采用五种方法扩增培养该细胞,8周后,再通
过细胞形态学、流式细胞术、免疫细胞化学和免疫荧光对细胞进行干性鉴定,探索最佳干性维持培养方法。结果通过免疫磁珠
法可以从人脐带血中分选出80%以上的CD133+造血祖细胞。采用优化的无血清培养基培养8周之后,CD133+造血祖细胞可得
到有效扩增。而其他的培养基会使CD133+造血祖细胞由半悬浮细胞分化为梭形贴壁细胞,并且细胞状态欠佳。结论利用免
疫磁珠法分选出的CD133+造血祖细胞,采用优化的无血清培养基能够有效扩增该细胞,并可长期有效的维持其干性。
     

人卵巢肿瘤细胞系3AO中肿瘤干细胞的分离鉴定

目的利用CD133抗体偶联的免疫磁珠分选法从人卵巢肿瘤3AO细胞系中分离CD133+细胞,并且通过检测其抗凋亡能力和耐药性进一步鉴定其特征。方法通过免疫磁珠分选方法分离人卵巢肿瘤细胞系中CD133+肿瘤干细胞,流式细胞仪检测肿瘤干细胞自我更新能力和抗凋亡能力,裸鼠移植实验反映成瘤性,MTT法检测其耐药性。结果通过免疫磁珠手段可成功分离得到CD133+卵巢肿瘤肿瘤干细胞,细胞增殖活力好,自我更新能力强,随着培养时间的延长可产生大量的CD133-细胞。裸鼠移植成瘤实验表明CD133+细胞成瘤率是10/10,成瘤平均时间是(58±6)d;而CD133-成瘤率是4/10,平均成瘤时间是(145±8)d,CD133+细胞成瘤能力明显强于CD133-细胞。MTT检测结果表明CD133+细胞的IC50值为CD133-细胞的2.5倍左右,提示对顺铂药物不敏感。对使用顺铂的细胞进行吖啶橙染色后发现,大量CD133-细胞呈现细胞凋亡状态,而CD133+细胞形态基本正常。进一步的AnnexinⅤ-FITC和PI双染结果表明,药物处理后的CD133+细胞比CD133-细胞具有更强的抗凋亡能力。结论免疫磁珠分选得到的CD133+细胞具有自我更新、增殖和分化为CD133-细胞等肿瘤干细胞的特征。CD133+细胞比CD133-细胞具有较强的成瘤能力、耐药性及抗凋亡能力。     

131I-CD133mAb诱导CD133+HepG2肝癌干细胞间质-上皮逆转分化

目的 研究131I-CD133mAb可诱导CD133+ HepG2肝癌干细胞间质-上皮逆转分化(mesenchymal-epithelial transition,MET)及可能分子机制.方法 ①用免疫磁珠分选法分选HepG2人肝癌细胞,采用流式细胞术检测分选前后CD133的表达率,体外成球和体内成瘤实验鉴定其干细胞特性.②氯胺T法制备131I标记CD133mAb并用γ免疫计数器检测标记率、放化纯度.用不同剂量(0、2.4、4.8、9.6 MBq)的131I-CD133mAb作用CD133+ HepG2细胞,用Transwell侵袭实验检测侵袭能力,Western blot检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平.结果 流式细胞术显示分选前后CD133 表达率分别为(7.21±0.05)％和(95.26±0.05)％.CD133+细胞体外成球和体内成瘤能力强于CD133-细胞.γ免疫计数器检测131I-CD133抗体标记率为86.97％,放化纯度为98.84％.Transwell侵袭实验示131I-CD133mAb各处理组(2.4、4.8、9.6 MBq)24 h细胞穿过Matrigel胶的细胞分别为(107.7±3.2)、(76.3±2.5)、(44.0±3.0)/视野,显著少于对照组(0 MBq,P＜0.01).Western blot结果显示,与对照组(0 MBq)相比,131I-CD133 mAb(2.4、4.8、9.6 MBq)处理组N-cadherin和Vimentin的蛋白表达量降低(P＜0.01),E-cadherin的蛋白表达量增加(P＜0.01).结论 在体外131I-CD133mAb作用于人肝癌CD133+ HepG2细胞可诱导间质-上皮逆转分化.     

人脑胶质母细胞瘤肿瘤干细胞的分离鉴定研究

目的 从人脑胶质母细胞瘤中分离出肿瘤干细胞.体外培养并鉴定其生物学特性.方法 获取5例人脑胶质母细胞瘤肿瘤细胞,通过无血清培养基和悬浮培养法,观察肿瘤干细胞克隆球的形成.利用免疫荧光技术检测原代肿瘤细胞和克隆球细胞中CD133阳性细胞的比例,分析克隆球细胞的抗原表达和多向分化能力.观察肿瘤干细胞子代分化细胞在无血清培养基中的逆向分化现象.结果 成功获取人脑胶质母细胞瘤肿瘤细胞,研究发现部分细胞具有克隆形成能力,在无血清培养基中呈悬浮球状生长,并可稳定增殖、传代.免疫荧光检测显示原代肿瘤细胞及克隆球细胞中均有CD133阳性细胞.克隆球细胞在含血清培养基中具有多向分化能力,其分化的子代细胞在无血清培养基中可逆向分化.结论 培养获得人脑胶质母细胞瘤肿瘤干细胞,证实其在体外具有自我更新、无限增殖、多向分化和逆向分化的生物学特性,为下一步研究奠定基础.     

HSP27在左侧结肠癌和右侧结肠癌差异表达的实验研究

目的：应用蛋白质组学技术筛选左侧结肠癌和右侧结肠癌组织中差异表达的蛋白,为左侧结肠癌（1eft sided coloncan cer,LSCC）和右侧结肠癌（right sided colon cancer,RSCC）在肿瘤生物学方面的差异提供分子遗传学依据。方法：收集人LSCC和RSCC组织标本,置-80℃超低温冰箱中保存。应用双向凝胶电泳、质谱分析和生物信息学分离和鉴定LSCC和RSCC中差异表达的蛋白质。应用RT—PCR,Western印迹和免疫组织化学技术检测差异表达蛋白的表达状态。结果：筛选出55个差异蛋白质点,成功鉴定出21种差异蛋白质。与RSCC比较,14种蛋白在LSCC表达上调,7种蛋白在LSCC表达下调,其中LSCC中HsP27表达下调。通过RT—PCR,Western印迹和免疫组织化学方法证实：在mRNA和蛋白水平,LSCC中HSP27的表达均低于RSCC。结论：LSCC和RSCC的蛋白质组存在差异表达,特别是HSP27在mRNA和蛋白水平均存在差异,这些可能是LSCC和RSCC生物学行为差异的分子遗传学基础。