MLC20磷酸化在PKCα、PKCε调节失血性休克大鼠血管钙敏感性中的作用

目的 观察肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化在蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)、蛋白激酶Cε(protein kinase Cε,PKCε)调节大鼠失血性休克后血管钙敏感性中的作用,进一步探讨休克血管钙失敏的发生机制.方法 采用缺氧大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)和失血性休克后大鼠肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA),运用Western blot、底物磷酸化等技术方法,观察PKCα、PKCε激动剂作用下,以及抑制CPI-17、ILK、ZIPK后再给予PKCα、PKCε激动剂时,肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)活性和MLC20磷酸化的变化.结果 ①缺氧2 h后VSMC中MLCP活性增高至正常对照的150.1%(P＜0.01),PKCα、PKCε激动剂可显著抑制其增高,使其分别降低至正常对照的103.0%和96.3%(P＜0.01),抑制CPI-17、ILK、ZIPK,可显著抑制PKCα激动剂降低MLCP活性的作用,使其分别增高至正常对照的136.7%、127.6%和116.7%(P＜0.01);抑制CPI-17、ILK、ZIPK,也可显著抑制PKCε激动剂降低MLCP活性的作用,使其分别增高至134.0%、128.5%和126.0%(P＜0.01).②失血性休克2 h后SMA中MLC20磷酸化水平由32.4%显著降低至10.4%(P＜0.01),PKCα、PKCε激动剂可显著抑制其降低,使其分别增高至26.4%和25.6%(P＜0.01),抑制CPI-17、ILK、ZIPK,可显著削弱PKCα激动剂的增高MLC20磷酸化的作用,使其分别降低至12.7%、10.0%和15.7%(P＜0.01);也可显著削弱PKCε激动剂增高MLC20磷酸化的作用,使其分别降低至10.1%、12.5%和10.3%(P＜0.01).结论 PKCα、PKCε可能通过CPI-17、ILK、ZIPK调节MLCP活性和MLC20磷酸化,调节失血性休克血管平滑肌的钙敏感性.     

TNF-α对家兔内毒素休克钙敏感性的影响及其与Rho激酶和蛋白激酶C的关系

目的观察肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)对内毒素休克血管钙敏感性的影响及其与Rho激酶和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的关系。方法取正常和内毒素休克家兔肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA),采用离体血管环张力测定技术,用去极化状态下(120mmol/LKCl)SMA血管环对梯度浓度钙的收缩力反映血管的钙敏感性。用ELISA法测定血浆炎性因子TNF-α的水平,观察TNF-α对SMA血管环钙敏感性的影响及与PKC和Rho激酶的关系。结果家兔LPS(1mg/kg)静脉注射后,早期(即LPS注射后30min和1h)SMA血管环对钙的反应性升高,量-效曲线左移,最大收缩力(Emax)升高(P0.05);随着时间的延长,SMA血管环对钙的反应性逐渐下降,到LPS注射后6h明显降低,其量-效曲线明显右移,最大收缩力(Emax)明显降低(P0.01)。家兔LPS(1mg/kg)静脉注射后2h,血清中TNF-α的水平逐渐升高,4h达到高峰,6h有所降低但仍高于正常组(P0.05,P0.01),其变化趋势与血管钙敏感性变化呈一定负相关关系(r=-0.6753)。低浓度的TNF-α(20ng/ml)孵育可明显升高SMA对钙的反应性,高浓度的TNF-α(200ng/ml)可明显降低SMA对钙的反应性(P0.05,P0.01)。Rho激酶特异性抑制剂Y-27632(1×10-5mol/L)可明显降低低浓度的TNF-α升高SMA对钙的反应性(P0.05,P0.01);而PKC的抑制剂Staurosporine(1×10-7mol/L)无拮抗作用(P0.05)。结论TNF-α对内毒素休克血管的钙敏感性有重要的调节作用,其调节作用可能主要与Rho激酶有关,与PKC关系不大。     

精氨酸血管加压素抗失血性休克作用及其与Rho kinase的关系

目的 观察精氨酸血管加压素(arginine vasopressin,AVP)抗失血性休克作用与Rho kinase的关系.方法 采用大鼠失血性休克模型,整体动物观察AVP对失血性休克大鼠去甲肾上腺素(NE)的升压反应和对肠系膜上动脉收缩反应性的影响,同时观察Rho kinase在其中的作用;离体血管环观察AVP对失血性休克大鼠肠系膜上动脉反应性和钙敏感性的影响,并观察Rho kinase在其中的作用.结果 失血性休克后大鼠对NE的升压反应性和肠系膜动脉对NE的收缩反应性明显降低,AVP0.4 U/kg可明显增加休克大鼠NE升压反应和肠系膜动脉的收缩反应性,Rho kinase特异性抑制剂Y-27632可明显拮抗由AVP引起的休克大鼠血管反应性的增加.在离体血管环研究表明,休克后血管反应性和钙敏感性明显降低,AVP在浓度为5 nmol/L和0.5 nmol/L可明显增加休克后血管反应性和钙敏感性,Y-27632可明显拈抗由AVP引起的血管反应性和钙敏感性的增加.结论 AVP可通过增加休克血管平滑肌细胞的钙敏感性和血管反应性发挥抗休克作用,通过激活Rho kinase发挥其抗休克作用.     

白介素-1β通过改变PKC、Rho激酶活性调节家兔内毒素休克后肠系膜上动脉钙敏感性

目的观察在内毒素休克及白介素-1β介导家兔肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA)钙敏感性改变中SMA PKC、Rho激酶活性的变化。方法健康成年家兔96只,雌雄不拘,分为两实验大组:①内毒素休克组(包括5小组:正常对照组、LPS 30 min组、LPS 1 h组、LPS 2 h组和LPS 4 h组);②IL-1β处理组(包括3小组:0 ng/ml IL-1β组、50 ng/ml IL-1β组、100 ng/ml IL-1β组),每小组12只家兔。经耳缘静脉注入1 mg/kg LPS(O111∶B4)复制内毒素休克模型,在给LPS前及给LPS后30 min,1、2、4 h取家兔SMA,提取其PKC及Rho激酶蛋白并纯化,检测PKC及Rho激酶活性的变化,并与内毒素休克后血管钙敏感性变化进行相关分析;无菌条件下取正常成年家兔SMA,在0、50、100 ng/ml IL-1β作用12 h后,检测其PKC及Rho激酶活性的变化,并与IL-1β处理后家兔SMA钙敏感性变化进行相关分析。结果在给LPS后30 min至1 h成功复制出内毒素休克模型,与正常对照组相比,PKC、Rho激酶活性均在给LPS 30 min后升高(P<0.01),在2 h及4 h后均降低(P<0.01),与钙敏感性变化均呈显著正相关(r=0.912和0.968,P<0.05)。与0 ng/mlIL-1β组相比,100 ng/ml IL-1β能使PKC、Rho激酶活性明显降低(P<0.05),与钙敏感性变化均呈显著正相关(r=0.922和0.934,P<0.05)。结论 IL-1β能通过改变PKC、Rho激酶活性来调节家兔肠系膜上动脉钙敏感性,IL-1β可能通过改变PKC、Rho激酶活性调节家兔内毒素休克后肠系膜上动脉钙敏感性变化。     

血管紧张素Ⅱ激活p38 MAPK和JNK对诱导失血性休克血管反应性的保护作用

目的 观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)激活p38 MAPK和JNK在恢复失血性休克血管反应性中的作用.方法 采用大鼠失血性休克模型(SD大鼠80只,体质量200～230 g,雌雄各半),观察AngⅡ处理对休克大鼠肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA)血管组织中p38 MAPK和JNK的活性变化的影响,并用p38 MAPK和JNK的特异性拮抗剂SB203580和SP600125,观察阻断p38 MAPK和JNK对AngⅡ诱导的失血性休克血管反应性保护作用的影响.结果 失血性休克大鼠肠系膜血管组织中p38 MAPK的活性呈休克早期升高、休克晚期降低的趋势,在休克后0.5 h和2 h时p38 MAPK的活性分别为正常对照的201.2%和53.2% (P<0.01);而JNK的活性水平随休克时间的延长而逐渐升高,休克2 h时活性升为正常对照的308.8% (P<0.01).在休克晚期给予AngⅡ处理能明显升高休克血管p38 MAPK和JNK活性水平,同时AngⅡ处理也升高了休克晚期肠系膜动脉血管的收缩反应性.p38 MAPK的拮抗剂SB203580和JNK的拮抗剂SP600125均可拮抗AngⅡ诱导的p38 MAPK和JNK激活,p38 MAPK和JNK的活性分别降低为AngⅡ组的52.9%和44.8% (P<0.05～0.01);同时p38 MAPK和JNK的拮抗剂也抑制了AngⅡ升高休克血管反应性的作用,使其分别降低为AngⅡ组的60.5%和65.0% (P<0.01).结论 p38 MAPK和JNK参与AngⅡ对休克血管反应性的保护作用.     

热休克、心肌缺血预处理对I/R心肌的第二窗保护作用

目的观察IP(ischemic preconditioning,缺血预处理)、HS(heatshock,热休克)对I/R(ischemic/reperfusion,缺血/再灌注)损伤的保护作用。方法建立Wistar大鼠I/R动物模型,缺血90min后再灌注3h,分为对照组、Hs组和IP组3组,用免疫组化方法检测第二窗保护(second window of protection,SWOP)过程中蛋白激酶Cα、δ(PKCα、PKCδ)的活性,并用TTC染色测定心肌坏死范围。结果HS组和IP组心肌坏死范围较对照组明显缩小(P＜0.01),3组PKCα、PKCδ均未见从胞浆向细胞膜转位。结论HS和IP均有心肌保护作用,PKCα、PKCδ在SWOP中可能不起作用,其确切机制有待进一步研究。     

Cx40、Cx43在失血性休克大鼠血管舒张反应调节中的作用

目的 研究Cx40、Cx43在失血性大鼠肠系膜上动脉内膜依赖的血管舒张反应性调节中的作用及其可能的调节机制.方法 以SD大鼠肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA)为研究对象,采用体外缺氧模型,以Cx40或Cx43的反义寡脱氧核苷酸(Cx40/43 antisense oligodeoxyribonucleotide,Cx40/43 AODN)阻断SMA的CxdO或Cx43表达,观察Cx40/43 AODN对缺氧处理SMA舒张反应性、MLCP和MLCK活性等的影响.结果 Cx40 AODN可以显著增加SMA内膜依赖的舒张反应性(P<0.01);Cx43 AODN可以显著降低SMA内膜依赖的舒张反应性(P<0.01).Cx40/43 AODN对SMA的MLCK、MLCP活性无明显作用.结论 Cx40和Cx43参与了失血性休克后内膜依赖的血管舒张反应性的调节,其机制与血管的MLCK和MLCP活性无明显关系.     

蛋白激酶C抑制剂灯盏花素对低氧预适应小鼠皮层NO/cGMP信号转导系统的影响

目的 探讨NO/cGMP信号转导系统在低氧预适应中的作用及其与蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)的关系.方法 将Blb/c近交系小鼠随机分为空白对照组(H0组)、低氧对照组(H1组)、低氧预适应组(H4组)、灯盏花素组(EB)和药物对照组(C).观察:①H1,H4,EB和C组小鼠低氧耐受时间;②用分光光度计法测定各组小鼠皮层NOS活性、NO产量,放射免疫法测定cGMP含量.结果 ①H4,EB和C组小鼠低氧耐受时间显著多于H1组,且EB组明显多于H4组,(P＜0.01);H4和C组没有显著差异.②H1,H4,EB和C组NOS活性、NO、cGMP含量均高于H0组,H4,EB和C组明显低于H1组,且EB组显著低于H4组,(P＜0.01);H4和C组差异无显著性.结论 NO/cGMP信号转导系统在低氧预适应中起重要作用,并且PKC能促进NO/cGMP信号转导系统的激活,PKC抑制剂灯盏花素可能通过抑制NO/cGMP信号转导系统参与低氧预适应的产生.     

蛋白激酶Cα-EGFP及其突变体真核表达载体的构建和在C2C12细胞中的表达

目的：研究PKCα结构与转位的关系。方法：用PCR的方法构建了4个PKCα突变体，在DNA连接酶的作用下与pEGFP-N1结合后转移至质粒中，构建PKCα突变体-EGFP真核表达载体。观察它们在C2C12细胞中的表达及转位情况。结果：pPKCα-EGFP-N1转染C2C12肌细胞24h后，细胞内表达的PKCα-GFP融合蛋白主要定位于细胞浆，细胞核中未见分布。pPKCα-βI～EGFP-N1、pPKCβI-α-EGFP转染C2C12细胞24h的表达产物集中在胞浆。pPKCα(-)～EGFP-N1、pPKCα(m)-EGFP-N1转染C2C12细胞24h的定位与野生型明显不同。结论：PKCα的调节区(C1V1C2)尤其是RACK结合区(C2)、PKCα的催化区(C3V4C4)尤其是ATP结合位点与PKCα的转位密切相关。     

复方丹参对缺血预适应大鼠心肌蛋白激酶C表达的影响

目的　探讨复方丹参加强缺血预适应 ( IPC)的机制 ,是否通过促进蛋白激酶 C ( PKC)蛋白、m RNA水平表达发挥作用。方法　采用冠脉结扎大鼠 5 min缺血 ,5 min再灌反复循环 3次的缺血预适应方案 ,缺血 30 m in,再灌 2 h的缺血再灌模型 ,通过免疫组化、RT— PCR的方法观察 PKC蛋白、m RNA表达以及复方丹参对其影响。结果　 PKC在正常对照组中主要存在胞浆 ,但经过 IPC和使用复方丹参后 ,在胞膜和胞核也可见 ;不论早期 ,还是晚期 IPC组 PKC表达均高于假性预处理组 ,以早期 IPC组明显 ( P<0 .0 1) ;经复方丹参预处理后 ,PKC的表达均高于再灌组、早期、晚期 IPC组 ,以药物预处理 +缺血预处理组 ( DIPC)为优 ,显著高于早期 IPC组 ( P<0 .0 1)。PKCm RNA在正常心肌组织、再灌组、假性预处理组间无明显差异 ,但 IPC后不论早期 ,还是晚期 PKC m RNA表达均高于假性预处理组 ,晚期 IPC组表达更加明显 ;经复方丹参预处理后 ,可明显促进早、晚期 IPC及再灌组 PKC m R-NA的表达 ( P<0 .0 5 )。结论　复方丹参可激活 PKC,使其发生转位 ,促进其蛋白、m RNA表达水平增高。这可能是此方加强 IPC的主要机制之一