大肠埃希菌多重耐药与Ⅰ类整合子的关系

目的 监测大肠埃希菌临床分离株的耐药性,了解大肠埃希菌中Ⅰ类整合子的流行情况和分子特性.方法 临床分离114株大肠埃希菌经全自动细菌分析系统鉴定并检测耐药性,应用PCR法扩增质粒DNA上Ⅰ类整合子,对PCR产物进行酶切分析和DNA测序.将序列结果在GenBank中搜索,确定Ⅰ类整合子可变区基因盒的种类和排列.结果 细菌耐药率＞50%,且大多为多重耐药菌(耐受3种以上抗生素).在58株细菌的质粒DNA上检测到Ⅰ类整合子序列,大小约600～3 500 bp,各含1～3个Ⅰ类整合子.整合子中最常见的基因盒为dfrl7(甲氧苄啶耐药基因)与aadA5(链霉素、壮观霉素耐药基因),最主要的基因盒排列为dfrl7-aadA5.绝大多数携带甲氧苄啶耐药基因盒的菌株对复方新诺明耐受,大多数携带链霉素、壮观霉素耐药基因盒的菌株对链霉素不敏感.结论 目前临床分离的大肠埃希菌耐药性强,并广泛存在Ⅰ类整合子.菌株携带基因盒和耐药表型之间有较好的对应关系,基因盒介导了细菌耐药性.细菌的多重耐药率与Ⅰ类整合子的阳性率相关.     

血液中分离大肠埃希菌的Ⅰ类整合子分析

目的:分析从血液分离大肠埃希菌中I类整合子的流行情况。方法:对15株大肠埃希菌进行PCR扩增I类整合子,将扩增产物测序并分析其中的基因盒。结果:6株细菌含有I类整合子,整合子大小分别为600bp、1700bp,600bp整合子含基因盒dfr2d,1700bp整合子含基因盒dfr17-aadA5。结论:整合子在从血液分离大肠埃希中流行。     

铜绿假单胞菌整合子及其基因盒与耐药性的相关性研究

目的 调查致呼吸系统感染的铜绿假单胞菌中整合子的存在情况,研究整合子中基因盒与耐药表型的关系.方法 测定97株铜绿假单胞菌对抗菌药物的敏感性;应用简并引物PCR方法扩增整合子5'保守区的Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因,对阳性产物用限制性内切酶Hinf Ⅰ作限制片段长度多态性(RFLP)分析,并进行整合子分类;对整合酶阳性标...     

产金属酶铜绿假单胞菌携带Ⅰ类整合子的研究

目的 研究产金属酶铜绿假单胞菌携带Ⅰ类整合予及其基因盒的情况.方法 收集铜绿假单胞菌68临床株,进行金属酶IMP-1、VIM基因的PCR检测,选取阳性株再作第Ⅰ类整合酶基因的PCR检测,然后选取整合酶基因阳性株进行Ⅰ类整合子相关基因盒的PCR检测.结果 PCR检测出68株铜绿假单胞菌中的1株同时含有IMP-1基因和Ⅰ类整合子基因盒;55株含有VIM基因,其中26株含有Ⅰ类整合酶基因,在这26株中只有18株含有Ⅰ类整合子基因盒,根据电泳条带可分为5种类别.结论 首次在中国西南地区发现产IMP-1并同时带有Ⅰ类整合子的铜绿假单胞菌.Ⅰ类整合子在产金属酶铜绿假单胞菌中分布广泛,基因盒携带率为69.2%,对细菌的耐药性传播具有重要意义.     

多重耐药甲型副伤寒沙门菌耐药基因的研究

目的提取贵阳地区1株甲型副伤寒沙门苗基因组,以确定其是否带有抗性基因。方法从30倒样本中筛选一例贵阳地区当前单簇耐药谱最广的菌株。选择一株含抗药性最多的甲型副伤寒沙门菌,提取其基因组,进行PCR扩增Ⅰ类整合子和相关耐药基因。结果通过对该菌Ⅰ类整合子和抗性基因的检测,发现Ⅰ类整合子并携带抗性基因sul2、tetA（G）、blaTEM1等,抗性基因应定位在染色体上。结论多药耐药的甲型副伤寒沙门菌为临床分离株,抗性基因定位在于染色体上,不在以往学者怀疑的3．6kb质粒上。结果显示,此株甲型副伤寒沙门菌的抗性基因应是以Ⅰ类整合子的形式存在染色体上。     

铜绿假单胞菌中整合子的分布与结构及其与耐药的关系

目的了解分离于青岛骨伤医院临床标本的铜绿假单胞菌对15种常用抗生素的耐药率;明确整合子基因盒结构及其在耐药基因播散中的作用。方法采用微量肉汤稀释法检测70株铜绿假单胞菌的对15种常用抗生素耐药率;采用煮沸法提取70株铜绿假单胞菌基因组DNA;PCR扩增Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子基因,通过测序分析其所携带耐药基因。结果 70株铜绿假单胞菌对头孢哌酮/舒巴坦(CPZ/SB)耐药率为1.43%,对其他抗生素的耐药性在20.00%~67.14%之间;检出Ⅰ类整合子阳性28株(40.0%),包括aacA4、aadA1、catB8和dfrA17四种基因盒。未检测到Ⅱ、Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合子阳性菌株对头孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦等10种抗生素的耐药率明显高于整合子阴性菌株。结论铜绿假单胞菌对常用抗生素的耐药性因临床株而异,其中Ⅰ类整合子阳性的菌株耐药率高,提示该整合子在铜绿假单胞菌多重耐药中发挥重要作用。     

伤寒沙门菌fljB∶∶lacZ变异株的制备

目的:为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fljB的表达调节机制,建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)插入变异株。方法:采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接KpnⅠ和SalⅠ的特异性引物,用PCR扩增获得fljB基因的上、下游同源性DNA片段,并与用KpnⅠ和SalⅠ酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体(pSV-β-galactosidase vector)的片段定向连接,将连接片段克隆至自杀质粒pGMB151,再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌,在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果:经筛选获得阳性克隆,经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763 bp被3550 bp的lacZ片段替代。结论:成功构建伤寒沙门菌flj∶∶lacZ突变株,为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

食品中大肠埃希菌耐药性与整合子的关系研究

目的研究食品中大肠埃希菌的整合子携带情况及其与耐药性之间的关系。方法PCR检测细菌总DNA中1、2、3类整合酶基因，确定细菌携带整合子的情况。阳性菌株进一步检测整合子的可变区，分析插入基因盒的序列。结果50株大肠埃希菌中19株携带1类整合子，2株携带2类整合子，集中分布在对4种以上抗生素耐药的菌株中。插入基因盒主要是dfr和aadA类基因盒，各种基因盒组合中最常见的是dfr17-aadA5。结论细菌的多重耐药性与整合子携带高度一致，但是单个菌株的耐药谱与整合子的耐药基因盒缺乏对应关系。     

在铜绿假单胞菌临床分离株1类整合子中发现携带新型耐药基因盒

目的:研究铜绿假单胞菌中1类整合子的分布和结构特征及与多重耐药的关系.方法:应用聚合酶链反应(PCR)检测铜绿假单胞菌1类整合酶基因(int Ⅰ)并扩增其可变区;DNA测序技术分析1类整合子可变区的耐药基因;对1类整合子阳性菌采用琼脂平皿稀释法测定其MIC并进行转移接合明确其耐药基因转移情况;脉冲场凝胶电泳法(PFGE)了解这些阳性菌的遗传相关性.结果:47株铜绿假单胞菌临床分离株中,29株携带1类整合子,未检测到3类整合子.这29株包含的整合子均扩增出长度约4.3 kb的可变区,核酸序列分析发现存在新型耐药基因盒组合形式aac(6')-Ⅱ-aadA13-cmlA8-oxa-10,Genbank基因号为EU182575.其中基因盒aadA13以往未在铜绿假单胞菌中发现.同时第3个开放阅读框与已知基因cmlA5有95%的同源性,为编码氯霉素外排泵的基因盒,将其命名为cmlA8.PFGE结果分析显示29株阳性菌株具有高度的同源性.结论:本院流行的铜绿假单胞菌携带包含新型基因盒及组合形式的Ⅰ类整合子,再次证实1类整合子参与了铜绿假单胞菌的耐药和多重耐药.     

青岛地区大肠埃希菌中整合子与耐药性的分析

【立论依据】 大肠埃希菌是临床常见的条件致病菌,耐药率有逐年上升的趋势。近年研究表明,整合子在细菌多重耐药性的形成和水平传播中发挥重要作用,且整合子的分布及其携带的基因盒存在明显的地区差异性。因此,检测不同地区大肠埃希菌中整合子的分布及耐药基因盒,对于控制细菌耐药及合理应用抗菌药物具有重要的指导意义。 【设计思路】 本研究通过检测青岛地区临床分离的大肠埃希菌中I类、II类及III类整合子的分布及携带的耐药基因盒,分析整合子与耐药表型的关系,旨在探讨整合子在介导大肠埃希菌耐药中的作用。 【实验内容】 琼脂纸片扩散法进行药敏试验;分别设计针对I、II、III类整合子整合酶基因及可变区的PCR引物,PCR检测整合子的整合酶基因,对整合酶基因阳性菌株进行可变区基因的PCR扩增,回收纯化的PCR产物克隆至T载体,将筛选鉴定的重组子送往华大基因公司测序,测序结果经在线Blast及DNAstar软件进行同源性比对分析,确定整合子携带的耐药基因盒。应用SPSS 21.0统计软件分析大肠埃希菌耐药性与整合子的相关性。 【材料】 78株大肠埃希菌分离自青岛市立医疗集团住院患者的各类标本,细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司,PCR引物由Invitrogen公司合成,pMD18-T载体购自大连TaKaRa公司。 【可行性】 前期研究结果表明:78株大肠埃希菌对环丙沙星、左氧氟沙星、头孢唑林、头孢呋辛、复方新诺明、氨曲南、头孢曲松及哌拉西林的耐药率均超过70%;I类整合子的携带率为53.89%,其中I类整合子阳性菌株对复方新诺明的耐药率明显高于整合子阴性菌株,差异有统计学意义(P<0.05);I类整合子可变区检测出3种不同长度的片段:2株750 bp片段不携带耐药基因盒,8株1 800 bp片段携带dfrA17-aadA5 基因盒,1株1 200 bp片段为aadA22基因盒;I类整合子阳性菌株中携带耐药基因盒的菌株占61.90%,对复方新诺明的耐药率明显高于基因盒阴性菌株(P<0.01)。 【创新性】 首次研究青岛地区大肠埃希菌中整合子的分布及其携带的耐药基因盒,探讨整合子与大肠埃希菌耐药性的关系。     

整合子在鲍曼不动杆菌多重耐药机制分析

目的:调查我院鲍曼不动杆菌耐药性;了解整合子类型以及整合子携带耐药基因盒特征。方法:收集我院临床分离鲍曼不动杆菌。细菌鉴定及药敏由MicroScan Walk Away 40仪器完成,整合子分类检测及开放阅读框扩增由PCR法完成。开放阅读框扩增产物经琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收试剂盒回收纯化后进行DNA测序分析,测序结果在Genebank上作比对。结果:62株鲍曼不动杆菌有11株呈多重耐药,阳性率17.7%,11株鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物阿米卡星,妥布霉素,庆大霉素均耐药,其余菌株较敏感。11株鲍曼不动杆菌中均检出整合子;进一步分类鉴定显示均为Ⅰ类整合子,未检出Ⅱ类和Ⅲ类整合子。开放阅读框可变区扩增产物为(0.3～2.5)KB不等条带,测序结果证实11株Ⅰ类整合子含有6个不同耐药基因盒:blam-1,orfX,aacA4,catB3,dfrA1,aadA1。其中7株均出现catB3,aacA4和dfrA1组合。结论:与其他报道相比较,我院鲍曼不动杆菌多重耐药率相对较低,但耐药鲍曼不动杆菌携带整合子率较高,且均为Ⅰ类整合子;其整合子基因盒含有多种耐药基因编码,其中aacA4,catB3和dfrA1耐药基因组合在本地区占优势。     

产志贺毒素大肠埃希菌中国分离株第1类整合子-基因盒的特征

目的：探讨产志贺毒素大肠埃希菌中国分离株携带第1类整合子的特征及所含基因盒的种类。方法：采用纸片扩散法对8株产志贺毒素大肠埃希菌中国分离株进行抗生素耐药性监测;制备细菌转接合子,采用PCR技术鉴定第1类整合子,并对PCR产物测序及结果分析。结果：4株产志贺毒素大肠埃希菌对复合磺胺、四环素、氨苄西林、环丙沙星表现多重耐药,其中2株同时对链霉素和壮观霉素耐药。PCR检测第1类整合子1 000 bp 2株,PCR产物测序1 000 bp整合子携带腺苷酰基转移酶(aadA1)基因盒并存在于7 800 bp可接合质粒上,与sul 1和qacEΔ1基因连锁,分别传递着对链霉素、壮观霉素、复合磺胺和季胺盐类消毒剂的耐药性。结论: 产志贺毒素大肠埃希菌中国分离株可接合质粒上第1类整合子携带的aadA1耐药基因盒是该菌株对氨基糖苷类抗生素耐药产生和扩散的重要原因。     

健康学生大肠埃希菌第1类整合子的鉴定及特征

目的：探讨健康学生肠道大肠埃希菌携带第1类整合子的分布及所含基因盒的特征。方法：常规方法分离大肠埃希菌;纸片扩散法对10种抗生素进行耐药性监测和分析;PCR鉴定第1类整合子阳性株;PCR产物测序并对结果进行分析。结果：从97份标本中鉴定出大肠埃希菌76株,其中25株（32.8%）为多重耐药,耐药谱为复合磺胺-氨苄西林-四环素-红霉素-链霉素。25株中有14株(56.0%)鉴定出1类整合子,1 800 bp 10株, 750 bp 4株。PCR产物测序得知1 800 bp整合子携带aadA1-dfrA14-orf基因盒,传递对氨基糖苷类-磺胺类抗菌药物的耐药性;750 bp整合子携带dfrA14基因盒,传递对磺胺类抗菌药物的耐药性。结论: 不同种类的1类整合子存在于健康人大肠埃希菌中,携带耐药基因盒,决定多重耐药性。      

Class Ⅰ integron with a novel cassette array in an ESBL-producing multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae isolate

Objective: To analyze the molecular mechanism of integron mediated multi-resistance in an ESBL-producingK. Pneumoniae NJ 12 isolate. Methods: Susceptibility test was carried out by Kirby-Bauer method. Class Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ integrons were detected by integrase gene PCR with primers that annealed to conserved regions of integron-encoded integrase genes intIl, intI2 and intI3.The variable region of integron was amplified by integron PCR with primers that targeted the conserved flanking regions, and the PCR product was sequenced. Six aminoglycoside modifying-enzyme genes, including ant ( 2")- Ⅰ , ant ( 3")- Ⅰ , aac (3)- Ⅰ , aac ( 3 )- Ⅱ , aac (6')- Ⅰ , and aac (6')- Ⅱ, were detected. Results: K. Pneumoniae NJ 12 was resistant to nine antibiotics, including piperacillin,ampicillin, cefuroxime, ceftazidime, cefotaxime, aztreonam, streptomycin, gentamicin and amikacin. This isolate was shown that there was positive with class Ⅰ integron, ant(2")- Ⅰ , ant(3")- Ⅰ , aac(3)-Ⅱ and aac(6')- Ⅰ modifying-enzyme genes. Neither class Ⅱ nor Ⅲ integron was detected; DNA sequencing of the fragment amplified by integron PCR revealed a novel cassette array aadB-cat-blaoxa-10/aadA1. Conclusion: Class Ⅰ integron with a novel cassette array in an ESBL-producing multidrug-resistant K. Pneumoniae NJ 12 isolate was reported from Nanjing area of China, with the GenBank accession number DQ141319.     

Characterization of Class 1 Integron Gene Cassettes among Clinical Bacteria Isolated from One Large Hospital in Northern China

The class 1 integron and complex gene cassettes among different species of clinical isolates in northern China were characterized in this study. 383 clinical isolates were obtained from northern China, and class 1 integrons containing gene cassettes widely distributed among gram negative clinical isolates was observed. We find that the class 1 integron showed positive correlation with multidrug resistance phenotype of gram negative bacteria. In addition, we find that isolates belonged to one species harbored different types of gene cassette arrays, while same types of gene cassette arrays were observed in different species of isolates. The diversity of gene cassette arrays among the isolates indicated the complexity of multidrug resistance in clinical isolates in northern China.     

泛耐药鲍曼不动杆菌整合子Ⅰ和ISCR1结构及基因分型研究

目的研究从临床分离的鲍曼不动杆菌的整合子Ⅰ和ISCR1的分布及结构情况,并对其进行基因分型。方法分离自临床的57株鲍曼不动杆菌,PCR检测整合酶Ⅰ、整合子Ⅰ、ISCR1以及ISCR1可变区,PCR产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分型并进行测序分析可变区携带的耐药基因盒,ERIC-PCR进行基因分型。结果 49株整合酶I阳性,其中47株整合子I扩增阳性,RFLP分为2型,测序结果为aacA4-catB8-aadA1和drf17-aadA5。3株ISCR1以及ISCR1可变区扩增均阳性,可变区经RFLP分为1型,测序结果为orf513-qnrA1-ampR-qacEdeltal,ISCR1阳性菌整合子I均阳性,经ERIC-PCR检测将57株鲍曼不动杆菌分为27个基因型。结论Ⅰ类整合子广泛存在于鲍曼不动杆菌中,ISCRI携带率较低,氨基糖苷类、甲氧苄啶类和β-内酰胺类耐药基因盒较常见,ERIC-PCR可用于临床鲍曼不动杆菌的分子流行病学研究。     

Identification and Distribution of the Clinical Isolates of Imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa Carrying Metallo-β-lactamase and/or Class 1 Integron Genes

To investigate the distribution of the genes of two major metallo-β-lactamases (MBL; i.e., IMP and VIM) and class 1 integrons (intI) in the clinical imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, a total of 65 isolates, from a university hospital in Sichuan between December 2004 and April 2005 were screened for MBL genes by PCR using primers specific for blaIMP-1, blaVIM and blaVIM-2 genes. The MBL-positive isolates were further assessed for class 1 integrons by PCR using specific primers. The nucleotide sequences of several PCR products were also determined. The results revealed that the blaVIM gene was found in 81.5% (53/65) of all isolates, bla gene was found in only 1 isolate and the intI gene was observed in 45.3% (24/53) of blaVIM-positive isolates. One isolate carried simultaneously both blaIMP-1 and intI genes, and to the best of our knowledge this is the first report of such isolate in southwest China. These observations highlight that the genes for VIM β-lactamase and class 1 integrons were predominantly present among the imipenem-resistant P. aeruginosa tested, confirming the current widespread threat of imipenem-resistant, integron-borne P. aeruginosa.