OsmY缺失对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的影响

目的:研究伤寒沙门菌OsmY在高渗应激早期对其他基因表达的调节。方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和osmY基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果:成功制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;基因芯片结果显示,在高渗应激早期,与野生株相比,伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株有128个基因表达下调,有27个基因表达上调。实时定量PCR与芯片结果一致。结论:OsmY可作为一调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。     

伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB：z66的克隆表达及其多克隆抗体的制备

目的: 克隆表达H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66,并纯化制备相应的多克隆抗体.方法: 利用PCR 技术从H:z66阳性伤寒沙门菌基因组DNA中得到鞭毛素基因fljB:z66,将该基因克隆到表达载体pET-28a(+)上并在大肠埃希菌JM109中进行表达;fljB:z66的表达产物经Ni柱纯化后作为抗原免疫兔以制备多克隆抗体.结果: 经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66 被成功导入表达载体pET-28a(+),并在大肠埃希菌JM109中获得了高效表达,以此作为抗原成功制备了兔抗z66的多克隆抗体.结论: 成功克隆表达了H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66,并制备了相应的多克隆抗体,为今后深入研究H:z66阳性伤寒沙门菌的单向相变换机制奠定了基础.     

B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化

目的: 克隆人B型钠尿肽(脑钠素,B-type natriuretic peptide,BNP)基因,纯化其表达蛋白并制备多克隆抗体。方法: 用PCR技术从正常成人心脏组织cDNA库中扩增出人BNP基因,将其克隆进pUCm-T中并测定核苷酸序列。构建大肠埃希菌分泌性表达载体pGXE4T-2/BNP,用异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,GSH-agarose亲和纯化表达蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。结果: 经PCR扩增成功获得96bp的BNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的19%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子量29500。经亲和纯化后GST-BNP的纯度可以达到95%,500ml菌液中得到纯化蛋白9.6mg。多克隆抗体的效价为1:32000。结论: BNP基因的克隆、表达和纯化成功以及多抗的获得,为建立BNP检测方法奠定了基础。     

幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

目的：构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）Cag致病岛（Cag—pathogenicity island,Cag—PAI）编码的hp0540基因的原核表达系统,并制备其多克隆抗体。方法：应用PCR技术从Hp11637基因组DNA中扩增hp0540基因片段,克隆至pMD18-2T载体后,进行序列测定,并对其序列进行生物信息学分析;构建pET-28a—hp0540原核表达载体,转化表达宿主菌BL21DE3;经IPTG诱导表达后,SDS—PAGE法鉴定目的蛋白的表达,并以Ni^2＋-NTA柱分离纯化目的蛋白;将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并测定抗体效价。结果：成功克隆了hp0540基因,全长1086bp,编码361个氨基酸,与基因库公布的其他坳菌株基因序列的核苷酸同源性为98％。工程菌诱导后SDS—PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量约为39000,经Ni^2＋NTA柱纯化后可获得重组蛋白,重组蛋白免疫新西兰大白兔后获得效价为1：160000的多克隆抗体。结论：成功构建了hp0540基因的原核表达系统并制备了其多克隆抗体,为研究该基因的功能奠定了基础。     

丙型肝炎NS5A基因多克隆抗体的制备

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）NS5A蛋白原核表达载体,获得高产量的纯化目的蛋白,并制备其多克隆抗体。方法：应用聚合酶链反应技术,PCR扩增获得NS5A基因,将NS5A基因插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠埃希菌DH5α提取质粒,验证正确后,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导,获得NS5A融合蛋白的可诱导性表达．通过SDS—PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni^＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：NS5A融合蛋白表达成功,成功获得了融合蛋白及兔抗NS5A多克隆抗体。结论：成功表达NS5A基因融合蛋白．获得高特异性、兔抗NS5A多克隆抗体,为研究NS5A基因的生物学功能提供了重要制剂。     

新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备

目的:PCR扩增得到新基因ZNFD(Znf domain containing protein),构建pET32a-ZNFD原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:通过PCR的方法克隆新基因ZNFD,选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列,克隆到原核表达载体pET32a上,利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Western blot鉴定其效价和特异性。结果:经测序鉴定已成功克隆ZNFD基因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约为45 kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论:得到纯化的ZNFD蛋白,制备的多克隆抗体达到了一定的效价,且具有高特异性,为进一步研究ZNFD的功能奠定了实验基础。     

人精子蛋白FSCB的表达、纯化和多克隆抗体制备

目的：构建表达重组人精子蛋白FSCB的重组质粒,获得其纯化重组蛋白并制备其多克隆抗体.方法：分别成功构建了表达人精子全长FSCB蛋白和截短FSCB（FSCBt）蛋白的重组菌株BL21,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法和分子筛层析法纯化目的蛋白FSCBt,免疫接种雌性家兔制备多克隆抗体.结果：重组菌成功诱导表达了重组蛋白FSCB和FSCBt,相对表观分子量分别为230000和30000,重组蛋白FSCBt经纯化后纯度达到95%,制备的多克隆抗体效价达到1∶105,Western Blot显示多克隆抗体与重组蛋白FSCB和FSCBt均具有良好的反应性.结论：人精子蛋白FSCB在重组菌株中得到表达,成功制备高效价的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白在人体组织中的表达、分布以及生物学功能奠定了实验基础.     

人类DLK1基因的克隆、表达、纯化及抗体制备

目的 构建人类DLK1基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究DLK1基因的功能奠定基础.方法 从GenBank中下载人类DLK1基因全长cDNA序列并针对不合信号肽的编码序列设计引物,应用RT-PCR获得目的片段,重组入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得重组DLK1蛋白免疫大鼠制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体滴度.结果 成功构建了DLK1基因重组表达载体pET-28a-DLK1,表达的重组蛋白纯化经SDS-PAGE鉴定后免疫大鼠,得到了高滴度的多克隆抗体.结论 成功的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备为进一步研究DLK1基因的功能及其在肝肿瘤中的作用提供了基础.     

人Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体β基因(PILRβ)的克隆、表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化人Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体蛋白PILRβ,制备并鉴定其多克隆抗体.方法:应用RT-PCR从人的外周血细胞总RNA中反转录并扩增出PILRβ基因,将其克隆到表达载体pET-32a,在大肠杆菌中IPTG诱导表达,经Ni2 -NTA亲和层析柱纯化,纯化后的蛋白多次注射免疫新西兰大白兔,获取多克隆抗血清,ELISA法检测抗体效价,Western印迹检测抗体特异性.结果:获得了较高纯度的PILRβ蛋白(Mr约为42 000)及其抗体,多抗效价达到1:10 000,且特异性较好.结论:成功克隆了PILRβ基因并表达纯化了其蛋白,获得了效价较高、特异性较强的多克隆抗体,为进一步研究PILRβ蛋白的功能和潜在的药物开发打下了基础.     

分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的研制

目的在原核系统中表达并纯化GST-Ag85B融合蛋白,制备兔抗Ag85B多克隆抗体.方法首先构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒pGEX-Ag85B,将此质粒转入大肠杆菌,诱导表达融合蛋白并加以纯化;然后将纯化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗血清,纯化制备多克隆抗体并进行鉴定.结果成功构建了原核表达质粒pGEX-Ag85B,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并成功纯化,用纯化的GST-Ag85B融合蛋白成功制备了兔抗Ag85多克隆抗体.结论制备的多克隆抗体为进一步的研究奠定了基础.     

阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子的原核表达及多克隆抗体制备

目的: 原核表达阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor of Trichomonas vaginalis,TvMIF）并制备多克隆抗体。方法: 采用PCR技术扩增TvMIF基因,并克隆至pTG19 T载体,酶切及测序鉴定后,再定向插入pET 30a(+)载体。将重组载体转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导蛋白表达。采用镍柱亲和层析法纯化TvMIF蛋白,并免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,蛋白质印迹法检测多克隆抗体。结果： 从阴道毛滴虫cDNA中扩增出TvMIF基因片段,测序结果与基因库收录序列一致。成功构建pET 30a TvMIF重组质粒,重组TvMIF蛋白约为15.5 kDa,以可溶性蛋白形式存在。获得TvMIF重组蛋白的多克隆抗体,蛋白印迹法检出TvMIF的特异性条带。 结论： 成功获得阴道毛滴虫MIF蛋白并制备了多克隆抗体,可用于后续研究阴道毛滴虫致病机制。     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的鲍曼不动杆菌杆菌外膜蛋白Caro(-binding protein)融合蛋白并制备抗Caro多克隆抗体,为研究临床鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制奠定基础.方法 构建pET23d-CarO重组表达质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His-CarO融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western印迹检测多克隆抗体的特异性.结果 在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-CarO融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫新西兰大白兔,获得了高特异性的抗CarO抗血清.结论 成功构建pET23d-CarO原核表达质粒,表达并纯化出目标蛋白,制备出高特异性的多克隆抗体.     

小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:体外原核表达小鼠Foxp3蛋白,并以其免疫家兔,制备多克隆抗体。方法:从质粒Foxp3-pMD-18T扩增小鼠Foxp3全长基因,亚克隆至原核表达载体pET-32 a,转化E.coliBL-21;IPTG诱导表达目的蛋白,N i2 -NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白;纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹检测抗体特异性。结果:成功构建了Foxp3-pET-32 a原核表达载体,表达和纯化了目的蛋白;ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论:成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。     

Tum5蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的制备Tum5蛋白多克隆抗体并纯化。方法利用pQE30-Tum5重组质粒在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗Tum5多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度,亲和层析法纯化兔抗Tum5多克隆抗体。结果利用pQE30-Tum5重组质粒,经原核表达和亲和层析获得Tum5蛋白;利用Tum5蛋白制备多克隆抗体,纯度大于95%。结论利用原核表达的Tum5蛋白成功地制备了兔抗Tum5多克隆抗体。     

胞嘧啶脱氨酶的原核表达和多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD)，制备鼠抗大肠杆菌CD多克隆抗体，方法：亚克隆CD基因到原核表达载体pMAL-c2和pBV222中，并转化入大肠杆菌DH5α内，诱导表达并纯化MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果：通过重组质粒的酶切筛选出重组阳性克隆，成功地表达和纯化出MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD成功制备了鼠抗CD多克隆抗体，并用6his-CD和GST-CD重组蛋白进行Western印迹分析，证实了抗体的正确性，结论：应用多克隆抗体可以检测体内外CD基因的表达，为临床前和临床上深入开展CD基因的生物治疗研究提供重要的实验材料。     

大鼠新基因PMP22CD的克隆以及多克隆抗体的制备

目的:通过PCR克隆PMP22CD基因,构建原核表达载体PET-32a(+)/PMP22CD,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究该基因的功能奠定基础.方法:通过PCR的方法克隆PMP22CD基因,选择抗原性较强的C-端,构建原核表达载体PET32a(+)/PMP22CD,在大肠杆菌BL21(DE3 Lysis)中诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白以包涵体的形式存在,应用电洗脱的方式获得重组蛋白,免疫新西兰大白兔,获得抗血清,通过琼脂糖双扩和Western Blot检测抗血清效价和特异性.结果:经测序鉴定成功克隆PMP22CD基因,并构建PET-32a(+)/PMP22CD重组质粒,表达融合蛋白,免疫新西兰大白兔,获得PMP22CD多克隆抗体.结论:得到了纯化的PET-32a(+)/PMP22CD融合蛋白,获得了效价高、特异性强的抗体.     

重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的重组表达人细胞核输入蛋白α（Importin α）,制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达GST-Importin α重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果 RT-PCR扩增出的Importin α基因片段（1300bp）与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GST-Importin α重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。     

结核分枝杆菌Rv0808基因的克隆、表达、纯化及抗原性研究

目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)体内诱导基因Rv0808,并制备多克隆抗体,研究其编码蛋白的抗原性,了解诊断应用价值。方法高保真PCR扩增Rv0808基因,克隆入表达载体pET-30a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3),测序正确的克隆用IPTG诱导表达。用镍柱纯化重组蛋白,然后用纯化蛋白免疫新西兰白兔,制备和纯化多克隆抗体。将重组蛋白分别与多克隆抗体和结核病患者血清进行Western blot鉴定,并尝试用多克隆抗体进行免疫组化染色检测巨噬细胞中M.tb。结果成功构建了pET-30a(+):Rv0808重组表达载体。经过重组蛋白的可溶性表达及纯化后,SDS-PAGE结果显示在66kD处有一单一蛋白条带。将此蛋白免疫新西兰白兔后获得了效价为6400的多克隆抗体。重组蛋白与多克隆抗体可以发生免疫反应,但却不能检测出结核患者血清中的相应抗体。用此多克隆抗体也无法检测出巨噬细胞中的M.tb。结论结核分枝杆菌Rv0808编码蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,但可能对于结核病的诊断价值较小。     

大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达和纯化大鼠腺苷酸转运体（ANT1）蛋白并制备其多克隆抗体.方法：通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E. coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,Ni2＋-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果：成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10^3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr32×10^3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论：利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.     

Smarcad1重组蛋白表达及多克隆抗体验证

目的:建立稳定的实验室多克隆抗体制备流程，选择Smarcad1作为目的基因进行重组蛋白表达纯化与多克隆抗体制备，并对其进行特异性验证。方法:以本实验室的pcDNA3.1-Flag-Smarcad1质粒作为模板，构建pET-16b-Smarcad1-F1原核表达质粒。表达Smarcad1-F1蛋白，并纯化。利用蛋白质免疫印迹，蛋白质免疫共沉淀和免疫荧光实验检测抗体特异性。结果:PCR鉴定结果显示，成功构建pET-16b-Smarcad1-F1表达质粒。蛋白表达纯化实验中，考马斯亮蓝染色检测，相较于诱导前，加入IPTG后Smarcad1蛋白成功诱导表达，且纯化出分子量为27 kD的目的蛋白。Western印迹证明，制备的抗体能够特异性识别内源性Smarcad1蛋白。蛋白质免疫共沉淀实验显示，相较于对照组，制备的抗体能够与Smarcad1蛋白结合。免疫荧光实验检测所制备抗体的特异性，结果显示制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白。结论:成功构建了Smarcad1原核表达质粒，利用原核蛋白表达纯化出Smarcad1蛋白，利用该蛋白制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白，为后续原核表达蛋白及多克隆抗体制备提供思路。