人红细胞冻干程序优化的实验研究

目的 探讨冻干程序中几种参数设置对红细胞冻干复水后回收率的影响.方法 将红细胞装入细管分别用四种模式对其进行降温,降温完成后将细管取投入25℃水浴中,对其外形变化进行比较判断玻璃化的程度;将冻好的样品放入冻干机搁板上,温度分别设置为-40、-50、-60、-70和-80℃,对样品进行冻干;对干燥开始不同温度、升温速率、红细胞样品在每一温度干燥的时间等多因素加以比较;最后测定了红细胞残余含水量.结果 直接将样品投入液氮中降温,保护液在冷冻或溶化过程中形成玻璃化而未出现冰晶.搁板温度为-70℃和-80℃时红细胞回收率没有显著性差异(P>0.05),这两组与其他各温度下的回收率均有显著性差异(P<0.01).E程序下的红细胞和血红蛋白回收率最高,分别为83.14%±9.55%和85.33%±11.42%.与其他各程序间存在显著差异(与A、B、C相比P<0.01;与D相比P<0.05).随着残余含水量的增多,细胞回收率呈正相关的增加趋势.结论 冻干中采用液氮快速降温,搁板温度预冷至-70℃,开始干燥时的温度越接近样品最初在搁板的平衡温度,红细胞升华干燥阶段升温速率越均匀缓和,红细胞的冻干效果越好.     

紫杉醇透明质酸冻干制剂的制备和药动学研究

目的以透明质酸为载体材料制备紫杉醇透明质酸冻干制剂,并考察冻干制剂在大鼠体内的药动学。方法采用乳匀-冻干法制备冻干制剂;以透射电子显微镜观察其粒子形态;建立冻干制剂及其在血浆中紫杉醇的HPLC分析方法;以紫杉醇注射剂为对照,测定冻干制剂10mg/kgiv给药后,大鼠体内的药动学参数。结果在冻干制剂中,紫杉醇以球形包覆于透明质酸基质中;在溶液中,分散成平均粒径为80nm的包覆微球;大鼠iv冻干制剂和紫杉醇注射剂的药物浓度-时间曲线符合二室模型,其药动学参数AUC分别为(37.68±6.36μg·h/mL和(27.54±5.88)μg·h/mL;CL分别为(0.26±0.04)h-1和(0.38±0.07)h-1。结论透明质酸可能成为一种新的抗癌药物载体。     

盐酸椒苯酮胺冻干制剂辅料筛选

目的考察适合盐酸椒苯酮胺冻干制剂的辅料。方法配制含不同质量分数辅料的盐酸椒苯酮胺溶液(2 mg/mL,5 mL/支),包括甘露醇、蔗糖、乳糖、甘氨酸、右旋糖酐,经冻干后观察制剂的外观、含量、澄清度、颜色、pH等特性,以筛选盐酸椒苯酮胺冻干制剂的辅料。结果冻干制剂复溶后,甘露醇组出现乳浊;3%～5%蔗糖组色偏深;甘氨酸组乳浊并色偏深;乳糖和右旋糖酐组的外观、含量、澄清度、颜色均较佳。结论优选乳糖作为盐酸椒苯酮胺冻干制剂的辅料。     

荆芥内酯纳米粒冻干粉末的制备工艺及质量研究

目的 制备荆芥内酯聚乳酸乙醇酸纳米粒冻干粉末,并探讨其工艺与质量评价标准。方法 以外观、色泽、再分散性为指标,优选支架剂的种类和浓度及冻干工艺;并对该冻干粉末的外观、再分散性、pH值、纳米粒的形态、粒径分布、多分散系数、质量分数、包封率及载药量等质量评价指标进行考察。结果 10%甘露醇作为支架剂可以较好地防止纳米粒的聚集,优化的冻干工艺为-45 ℃预冻10 h,升温至-25 ℃维持5 h,再升温至-5 ℃维持2 h,再升温至10 ℃维持2 h,最后升温至30 ℃维持6 h。冻干粉末的外观和分散性良好,平均pH值为6.25,纳米粒平均粒径为80.2 nm,多分散系数为0.024 8,包封率为52.17%,载药量为28.73%。结论 荆芥内酯纳米粒冻干粉末制备工艺简便、重复性好;所选用的质量评价方法适用于该冻干粉末,可有效反映其性质。     

坦西莫司脂质体冻干剂的制备及大鼠药代动力学

制备坦西莫司脂质体冻干剂,优化其处方及工艺,并进行大鼠药代动力学研究。用薄膜分散法制备坦西莫司脂质体,采用冷冻干燥法制备脂质体冻干剂,单因素实验考察最佳处方为:磷脂浓度24 mg/mL,药物与磷脂质量比1∶40,磷脂与胆固醇质量比10∶1,冻干保护剂蔗糖与磷脂的质量比2∶1。复溶后粒径(100.8±6.74)nm,包封率(95.24±3.58)%。透析法研究脂质体的体外释放行为,37 ℃下,在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中24 h释放不到30 %。用高效液相色谱法研究最佳处方脂质体的大鼠药代动力学,其最高血药浓度为市售制剂Torisel^®的3.06倍,生物利用度为Torisel^®的2.49倍。实验结果显示,经过处方工艺优化后的坦西莫司脂质体冻干剂包封率较高,具有缓释效果,可以显著提高坦西莫司在大鼠体内的生物利用度。     

日本刺沙蚕纤溶酶的酶学性质及其分类

［摘 要］ 目的：探讨日本刺沙蚕纤溶酶（NJF）的最适反应温度和最适反应pH 值以及金属阳离子和蛋白酶抑制剂对酶活性的影响,确定NJF的酶学分类。方法：采用偶氮酪蛋白(azocasein)水解法测定NJF的最适温度及最适pH 值;利用10种金属阳离子（Na⁺ 、K⁺ 、Cu ²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Al³⁺和Hg^2+）确定金属离子对NJF酶活性的影响;采用9种蛋白酶抑制剂（PMSF、EDTA、EGTA、β-巯基乙醇、苯甲脒、碘乙酸、抑肽酶、胃酶抑素A和大豆胰蛋白酶抑制剂）确定NJF的蛋白酶分类。结果：NJF具有较宽的热稳定性及pH稳定性范围,在40～80℃及pH7～11范围内有较好的稳定性,NJF酶最适温度为60℃, 最适pH值为9;Hg²⁺能够强烈地抑制NJF的酶活性,Cu²⁺具有较弱的抑制作用,而其他金属阳离子对酶活性无明显抑制作用;NJF的酶活性能被典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF完全抑制。结论：NJF是一种典型的丝氨酸蛋白酶。     

一种新的具有纤溶活性的N-V蛋白酶酶学性质分析

目的： 测定N-V蛋白酶的最适反应温度、最适反应pH值及酶促反应动力学常数（Km）,并对其进行蛋白酶分类。 方法 ：利用纤维蛋白平板法测定N-V蛋白酶最适反应温度、最适反应pH值。以L-亮氨酸-p-硝基苯胺酯(Leu-pNA)作为底物,测定N-V蛋白酶的Km值。利用L-反式环氧琥珀酰亮氨酰氨基（4-胍基）丁烷（E64）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、1,10-邻菲啰啉、抑肽酶作为抑制剂对N-V蛋白酶的纤溶活性进行抑制作用,确定其蛋白酶分类。结果：N-V蛋白酶最适反应温度为50℃,最适反应pH值为8～9, Km值为1.97×10^-3mol •L^-1 ,PMSF有效抑制N-V蛋白酶的纤溶活性(P<0.01）,而E64、1,10-邻菲啰啉啉、抑肽酶对其活性均无明显抑制作用(P>0.05）。结论： N-V蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类。     

抗癌先导物T-OA在不同介质中的平衡溶解度及表观油水分配系数

目的测定抗癌先导物T-OA在不同pH（1¹0）缓冲溶液和表面活性剂溶液中的平衡溶解度,在正辛醇-水/缓冲液体系中的表观油水分配系数。方法采用高效液相法测定了T-OA在不同pH（1¹0）缓冲溶液和表面活性剂溶液中的浓度,采用摇瓶-HPLC法测定了T-OA的表观油水分配系数。结果 T-OA在37℃缓冲液中随pH的增高平衡溶解度逐渐增大,最大平衡溶解度为5.10 mg/L;在32 g/L的十二烷基硫酸钠溶液中其平衡溶解度提高到706.97 mg/L;T-OA的表观油水分配系数为544.71(Ig P_app=2.74),且随溶液pH的增高逐渐降低。结论 T-OA的水溶性较差,可采用适当浓度的十二烷基硫酸钠和吐温80作为溶出介质,这为今后的剂型选择提供了参考。     

冬凌草甲素长循环冻干脂质体的制备及大鼠体内药动学研究

目的：研究处方及工艺,制备冬凌草甲素长循环冻干脂质体,延长冬凌草甲素体内循环时间。 方法：乙醇注入法制备冬凌草甲素长循环脂质体,冷冻干燥技术制备脂质体冻干制剂。使用葡聚糖凝胶柱纯化脂质体,单因素实验考察不同处方因素对脂质体包封率的影响,研究冻干脂质体复溶后粒径大小、分布及体外释放曲线。大鼠尾静脉给药后,HPLC测定血药浓度,KineticaTM软件计算药动学参数,比较长循环脂质体与普通制剂的药动学特性。 结果：最优长循环脂质体处方为：大豆磷脂∶胆固醇∶DSPE-PEG 2000=1∶0.5∶1.8（w/w）,药脂比为1∶6（w/w）。葡萄糖∶甘露醇=3∶1合用作为冻干保护剂,脂质体包封率约65%。复溶后脂质体平均粒径164 nm,分布均匀,长循环脂质体体外释放具缓释效果。大鼠静脉注射冬凌草甲素制剂均符合二室模型,长循环冻干脂质体的MRT约为普通脂质体及溶液组的2倍和6倍;AUC约为普通脂质体及溶液组的2倍及3倍,差异均具统计学意义（P<0.05）。 结论：选用合适的处方及工艺可得到包封率较高的冬凌草甲素长循环脂质体冻干制剂,显著提高冬凌草甲素大鼠体内循环时间和生物利用度。     

盐酸林可霉素的萃取与结晶提纯

为了降低盐酸林可霉素粗品中的B组分含量,采用萃取与结晶相结合的方法,分别研究了萃取结晶过程中萃取剂种类、用量、原料浓度、溶液pH等条件以及溶析结晶过程中的混合速率对产品纯度的影响。结果表明：丁醇或氯仿有较高的萃取效率;降低原料浓度或在萃取、反萃时分别保持溶液pH为11和5均有利于提高产品中的A组分含量;结晶过程中提高搅拌速率有利于提高产品纯度。以氯仿为萃取剂,经过单级萃取,结晶后产品中A组分纯度最高可达97.86%。     

HPLC-ELSD测定三两半药酒中黄芪甲苷的含量

目的:采用HPLC-ELSD测定三两半药酒中黄芪甲苷的含量。方法:采用Diamonsil C18色谱柱,以乙腈-水（28:72）为流动相,流速1.0ml·min^-1,柱温30℃,漂移管温度45℃,载气为N₂,流速3.5 ml·min^-1。采用外标两点法计算含量。结果:黄芪甲苷在（0.56-11.20）mg·L^-1浓度范围内有良好线性关系（r=0.9999）,平均加样回收率为98.4%,RSD为0.95%。结论:本方法快速简便,结果准确,可用于该制剂中黄芪甲苷的定量分析。     

气相色谱法测定柑橘类果皮挥发油柠檬烯含量的方法研究

目的 建立柑橘类果皮挥发油测定柠檬烯含量的方法。方法 采用水蒸气蒸馏法提取柑橘果皮中的挥发油,气相色谱法测定挥发油中柠檬烯含量。色谱条件:色谱柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm);氢火焰离子化检测器(flame inoization detector, FID);进样口温度250 ℃;检测器温度250 ℃。程序升温:起始温度70 ℃,保留16 min,以30 ℃/min升温至250 ℃,保留1 min。载气氮气的流速1 mL/min;分流比100∶1,进样量1 μL。结果 柠檬烯在0~17.6 mg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系(r²=0.999 0),平均加样回收率为103.4%(n=9),峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为2.10%(n=9)。结论 本实验方法重复性好、灵敏度和准确性高,可用于柑橘类果皮挥发油中柠檬烯含量的评价方法。     

反相高效液相色谱法同时测定利肝宁片中对羟基苯乙酮和绿原酸的含量

目的:建立利肝宁片中对羟基苯乙酮和绿原酸的含量测定方法,为利肝宁片的质量控制提供依据。方法:采用紫外双波长同时测定的反相高效液相色谱法。色谱柱:安捷伦ZORBAX Eclipse XDB C18;流动相:(体积分数)0.05%磷酸溶液-乙腈(9010);流速:1.0 mL·min^-1;柱温:35℃;检测波长:275 nm(对羟基苯乙酮)和327nm(绿原酸)。结果:在选定的色谱条件下,对羟基苯乙酮峰和绿原酸峰与其他峰分离度良好。对羟基苯乙酮浓度在2.545~20.36 mg·L^-1范围内与峰面积有良好的线性关系(r=0.9997);平均回收率(n=6)为98.97%,RSD=1.72%。绿原酸浓度在10.31~82.47 mg·L^-1范围内,与峰面积有良好的线性关系(r=0.9998);平均回收率(n=6)为98.05%,RSD=1.04%。结论:该方法专属性强、灵敏度高,可用于利肝宁片中对羟基苯乙酮和绿原酸的含量测定。     

高效液相色谱法测定复方刺五加片中维生素B1的含量

目的:建立测定复方刺五加片中维生素B1含量的方法。方法:采用高液相色谱法,以IhertsiI ODS-3v C18(Φ4.6×250mm,5μm)色谱柱分离,以乙腈:0.3%磷酸溶液(含5mmoL?L-1庚烷磺酸钠)=15:85为流动相,流速为1.0ml?min-1,检测波长246nm。结果:线性范围0.2?g～2.0?g,r=0.9999,测得平均回收率99.7%,RSD=1.76%。结论:高效液相色谱法简便、准确、灵敏度高、准确度好,可作为复方刺五加片含量测定的方法。     

不同冻干保护剂在外泌体储存中的研究

目的:通过测试海藻糖等不同冻干保护剂,分析其对外泌体的完整性、分散度以及生物学功能的保护作用。方法:超速离心法收集293T细胞来源的外泌体,在冻干过程中加入50～200 mmol/L赖氨酸、2%和4%乳糖、2%海藻糖和5%菊粉等不同的冻干保护剂;通过透射电镜分析外泌体的颗粒形貌、分散度;利用纳米粒度分析仪分析外泌体粒径分布和数量;利用血浆外泌体诱导血管成管实验,检测冻干后血浆外泌体诱导血管生成的能力;免疫印迹分析储存不同时间的外泌体上的标志蛋白CD63和CD81的表达情况;利用激光扫描共聚焦分析不同储存时间的外泌体被C2C12细胞摄取的能力。结果:50、100、200 mmol/L赖氨酸可以维持冻干293细胞外泌体完整性,但是不同浓度赖氨酸都无法解决外泌体冻干时的聚集问题。5%菊糖在冻干外泌体的分散度上表现良好,但是造成外泌体膜破损。4%乳糖和2%海藻糖可以维持外泌体形貌完整并保持外泌体分散度,并且保护效果相当。2%海藻糖冻干后血浆来源外泌体能诱导血管内皮细胞成管。将外泌体用2%海藻糖冻干后室温储存1 d、1周和1个月,和-80 ℃组外泌体相比,冻干外泌体仍然保持原有的形貌和分散度,不会改变外泌体的粒径分布,外泌体总颗粒数也没有差异（P＞0.05）,并且总颗粒数显著高于不加冻干保护剂组（F＝28.8,P＜0.001）。常温条件下储存1个月,和-80°C组外泌体相比,冻干外泌体标志蛋白CD63和CD81表达水平没有差异,而不加海藻糖的外泌体CD81和CD63蛋白表达水平明显下降。添加2%海藻糖冻干后的外泌体常温储存不同时间后依旧能被细胞摄取,不会影响外泌体作为纳米载体的进入细胞的固有属性。结论:2%海藻糖可作为外泌体的冻干保护剂,为外泌体的运输和长期储存提供可行的方案。     

金属离子和小分子物质对耐铬(Ⅵ)菌株M52还原能力的影响

目的：研究从厦门近岸海域沉积物样品中分离筛选出的芽孢八叠球菌属菌株Sporosarcina saromensis M52在含不同浓度六价铬[Cr（Ⅵ）]培养基中的生长情况，定位Cr（Ⅵ）还原酶，探讨金属离子和小分子物质对耐Cr（Ⅵ）菌株M52还原能力的影响。方法：将M52菌株的种子液接种于含不同浓度（0~600 mg·L^-1） Cr（Ⅵ） LB培养基中，培养0~48 h后用紫外分光光度法测量600 nm处M52菌液的吸光度（A）值，观察M52菌株在含0、50、100、200、400和600 mg·L^-1Cr（Ⅵ）的LB培养基中的生长情况。将M52菌液超声破碎前、破碎后后离心所得胞内和胞外活性物质与对照组M52菌液在37℃、pH 7.5条件下培养0、12、24和48 h，用二苯碳酰二肼分光光度法分别测定溶液中Cr（Ⅵ）的浓度，计算各时间点胞内和胞外活性物质中Cr（Ⅵ）的还原率。在LB培养基中分别加入0.2 mmol·L^-1的Mn²⁺、Fe²⁺和Cu²⁺，1 mmol·L^-1SDS、1% Triton X-100和吐温80作为处理组，以未作处理的LB液体培养基为对照组，将种子液以4%浓度接种于处理组和对照组，计算M52菌株在0、6、12、24、36和48 h对Cr（Ⅵ）的还原率，分析金属离子和小分子物质处理组中M52菌株对Cr（Ⅵ）还原率的变化。结果：当Cr（Ⅵ）浓度低于100 mg·L^-1时，随浓度增加菌株生长加快；当100mg·L^-1≤Cr（Ⅵ）浓度<600 mg·L^-1时，随浓度增加菌株生长受到抑制；当Cr（Ⅵ）浓度高于600 mg·L^-1时，M52菌株几乎不生长。与对照组比较，M52菌株对Cr（Ⅵ）的还原率在细胞内外均升高（P<0.05），胞内Cr（Ⅵ）的还原率最高。与对照组比较，Cu²⁺和Fe²⁺存在情况下M52菌株对Cr（Ⅵ）的还原率升高（P<0.05），且Cu²⁺>Fe²⁺，Mn²⁺存在情况下M52菌株对Cr（Ⅵ）的还原率降低（P<0.05）；与对照组比较，小分子物质SDS、Triton X-100和吐温80存在时，M52菌株对Cr（Ⅵ）的还原率降低（P<0.05），且SDS > Triton X-100 > 吐温80。结论：低浓度Cr（Ⅵ）可以促进M52菌株生长，高浓度Cr（Ⅵ）则会抑制菌株生长，M52菌株对Cr（Ⅵ）的还原主要发生在胞内，Cu²⁺和Fe²⁺可促进M52菌株还原Cr（Ⅵ），吐温80、Triton X-100和SDS可抑制M52菌株还原Cr（Ⅵ）。     

红景天注射液HPLC指纹图谱研究

?目的:建立红景天注射液的色谱指纹图谱,为红景天注射液的质量控制提供依据。方法:采用高效液相色谱法进行检测,以Agilent XDB C18（150 mm×4.6 mm,5 μm）色谱柱为固定相,乙腈-水(0.07%磷酸)为流动相进行梯度洗脱,流速0.8 mL·min^-1,检测波长278 nm,柱温30 ℃;并以中国药典指纹图谱相似度评价系统2004版对注射液进行指纹图谱数据分析。结果:所建立的色谱条件能够有效分离红景天注射液的主要成分,确定了6个共有峰,以化学对照品比对结合HPLC-MS鉴定了其中5个色谱峰,分别为没食子酸、对羟基苯甲酸、酪醇、红景天苷和对香豆酸。方法学考察结果表明,文中所建分析方法精密度RSD≤ 1.90 %、重现性RSD ≤ 0.32 %、稳定性RSD ≤ 1.63 %,均符合要求。对9个批次注射液进行的指纹图谱分析结果表明相似度均大于0.96。结论:文中所建立的指纹图谱分析方法准确可靠,可以用于红景天注射液的质量控制。     

对比超声定量评价肾脏血流量的实验研究

目的 为评价对比超声(contrast-enhancedultrasound,CEU)定量肾脏血流量的准确性。方法 10只实验犬均分别在3种剂量(3、8和16mg·min^-1·kg^-1)多巴胺作用下,同步进行多普勒肾动脉血流量测定和对比超声肾皮质血流定量。标准化的肾动脉血流量(ml·min^-1·g^-1)等于肾动脉血流量除以肾脏质量。结果 与静息状态相比,在3种剂量多巴胺作用下肾动脉血流量均增加(P<0.05),且在低中剂量时肾动脉血流量随剂量的增加而增加(P<0.05),而在高剂量时肾动脉血流量的增加较低中剂量时减少(P<0.05)。对比超声测得的肾皮质血流量具有以上相似的血流变化特征,而且对比超声定量的肾皮质血流量与标准化的肾动脉血流量之间有良好的正相关(r=0.88,P<0.001)。结论 对比超声能准确地定量评价肾脏血流量。     

丁酸氯维地平注射乳剂中依地酸二钠的含量测定

目的:建立测定丁酸氯维地平注射乳剂中微量依地酸二钠的高效液相色谱法。方法:采用Agilent ZORBAX Extend-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),梯度洗脱流动相A为0.66 %四丁基氢氧化铵溶液-乙腈(3:1)(pH6.5),B相为甲醇-水(9:1),流速为1.0 mL·min^-1,进样量50 μL,检测波长为254 nm。结果:依地酸二钠峰不受辅料干扰,在8.04~80.37 ?g·mL^-1内线性关系良好(r=0.999 9),加样回收率为97.78%（n=9, RSD=0.62%）,定量限0.402 μg,供试品中依地酸二钠含量分别为46.7 μg·mL^-1、47.0 μg·mL^-1、49.6 μg·mL^-1。结论:该方法准确可靠、专属性强,可用于丁酸氯维地平注射乳剂中依地酸二钠的含量测定。     

HPLC法检测人血浆中多潘立酮浓度及其药代动力学研究

目的:建立测定人体血浆中多潘立酮的高效液相色谱（HPLC）法,并测定健康志愿者口服多潘立酮片24h内血药浓度。方法:血浆样品碱化后以有机溶剂提取,色谱柱为Inertsil ODS-35μm 150×4.6mm,0.05moL·L^-1磷酸二氢钠（pH2.8）:乙腈:四氢呋喃（78:22:0.5）为流动相,流速1.4ml·min^-1,荧光检测波长为λex=285nm,λem=325rm。结果:多潘立酮本法线性范围为:1～100ng·ml^-1（r=0.9995,n=7）;最低定量限1ng·ml^-1;低、中、高3种浓度的平均回收率分别为（109.48±3.90）%,（108.5±1.50）%,（102.76±0.32）%;日内、日间精密度RSD均<4%。结论:本检测方法简便、快速、经济、准确,可用于测定人血浆中多潘立酮的浓度。