神经营养因子相关基因在骨髓基质细胞分化为神经元中的表达

目的:体外诱导骨髓基质细胞分化为神经细胞,并观察诱导分化前后神经营养因子及其受体相关基因的表达变化.以探索骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞的可能机制.方法:体外培养经 Percoll(1.073 g/L)分离获得的大鼠骨髓基质细胞并传代扩增,用二甲亚砜(DMSO),丁羟回醚(BHA)诱导分化,采用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,分化后细胞用神经丝蛋白(NF)抗体,胶质源性纤维酸性蛋白(GFAP)抗体作细胞免疫荧光检测.采用半定量RT-PCR检测分化前和分化后2 h,6 h.12 h,24 h和48 h神经生长因子(NGF),脑源性神经因子(BDNF),神经营养因子-3(NT-3)及其相应受体TrkA,TrkB,TrkC和神经营养因子低亲和力受体p75NTR的表达变化.结果:①骨髓基质细胞体外诱导分化后2 h即出现形态学变化.表现为细胞胞体呈球形,突起增多,形态类似神经元.细胞免疫荧光检测显示神经丝蛋白(NF)抗体标记的神经元细胞阳性,GFAP阴性.②在骨髓基质细胞分化前后都有NGF和BDNF持续表达,但分化后NGF表达降低,TrkA,TrkB在分化前细胞中不表达.在诱导分化开始后12 h可以检测到他们的表达,而NT-3,TrkC 在分化前后都不表达.③p75NTR在诱导分化后6 h开始出现表达,12 h后显著降低并很快消失.结论:骨髓基质细胞在体外可以定向诱导为神经细胞,诱导分化前后神经营养因子(NT)及其 Trk 受体和p75受体的表达发生了显著变化,NT与Trk受体及p75受体作用的信号途径可能在骨髓基质细胞分化为神经细胞过程中起重要作用.     

不同方法诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化

目的观察两种方法体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）向神经样细胞分化的效果。方法自大鼠股骨中提取骨髓细胞,利用Percoll法进行BMSC分离、纯化及鉴定。取第5代细胞,应用两种方法进行诱导。方法一（BHA组）：200μmol/L丁羟基茴香醚（BHA）、10 ng/ml碱性成纤维生长因子（bFGF）和2%二甲基亚砜（DMSO）联合诱导细胞;方法二（RA组）：全反式维甲酸（RA）和β-巯基乙醇（β-ME）联合诱导细胞。同时设正常培养的BMSC为对照组。实验过程中对细胞进行形态观察和免疫荧光染色检测神经细胞标志物。结果BHA组诱导5 h,细胞即发生明显的形态改变,出现胞体回缩、突触伸展等神经干细胞的形态特征,而RA组诱导1周未出现神经干细胞形态。免疫荧光染色显示两种方法诱导的细胞均能表达神经前体细胞标志物nestin、β-tubulin和成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）,不表达星形胶质细胞标志物胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）。BHA组与RA组表达NSE的阳性率分别为80.05%和71.61%,两者相比,差异无统计学意义（P〉0.05）;对照组不表达NSE,诱导组与对照组比,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论两种方法均能诱导骨髓间充质干细胞定向分化为表达神经细胞标志物的神经样细胞。     

褪黑激素体外定向诱导骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨褪黑激素(melatonin,MT)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)不同时段向神经细胞分化的情况。方法:采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs,以MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经细胞分化。分别在诱导后3,7,10,14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志(nestin)、神经元细胞特异性标志(neurofilament,NF)和星形胶质细胞特异性标志(GFAP)的表达。结果:MT诱导分化3 d,部分细胞胞体收缩成三角形,有些成为简单的双极或多极细胞。诱导3 d细胞开始表达nestin,7~14 d表达nestin和NF,细胞不表达GFAP。结论:MT可诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。     

体内外环境对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响

目的:探讨体内外环境对骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的影响.方法:①DAPI体外标记MSCs后,直接注入大鼠大脑中动脉梗塞(MACO)模型(n=6)的脑内,2周后取脑组织,用免疫荧光检测MSCs来源细胞的巢蛋白(nestin)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.②体外用全反式视黄酸(ATRA)预诱导24h后,换用改良的神经细胞培养基(MNM)培养18h,免疫组化检测nestin、MAP-2、GFAP的表达.结果:①植入2周后,MSCs在注射部位及其周围广泛分布,仅有少许细胞表达nestin、MAP-2和GFAP.②MSCs在体外诱导后,nestin、MAP-2的阳性率分别为(92.3±3.4)%和(89.6 3.3)%,但不表达GFAP.结论:MSCs在脑内向神经细胞转化的转化率较低,而在体外转化为神经元的转化率相当高,体内外环境对MSCs向神经细胞的分化的过程及机理存在较大差异.     

益气活血化痰中药复方对大鼠胚胎神经干细胞生长分化增殖的影响机制研究?

目的研究益气活血化痰药物血清对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞(NSC)生长分化增殖的影响。方法细胞分为空白血清组、含药血清组、阻滞剂组、含药血清+阻滞剂组和培养基对照组5组。采用细胞培养、血清药理学、免疫荧光等技术,观察中药复方血清对大鼠NSC生长分化的影响;相差显微镜进行形态学观察;免疫荧光染色技术,检测各组细胞nestin、神经元特异性烯醇化酶(NES)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察神经干细胞的分化。结果益气活血化痰中药对神经干细胞无毒性,并能够促进神经干细胞生长分化。nestin蛋白在诱导分化24 h内表达最强,诱导72 h后nestin表达明显减弱直至消失。益气活血化痰中药组NES和GFAP阳性细胞数明显增加。结论益气活血化痰药物血清有促进NSC生长分化增殖的作用。     

大鼠脑损伤后survivin表达与神经细胞凋亡的研究

①目的探讨大鼠创伤性脑损伤后在不同时间段神经细胞凋亡及survivin蛋白表达的关系。②方法采用垂直落体的方法制作大鼠脑损伤模型。运用常规HE染色、免疫组织化学、TUNEL及RT-PCR法检测大鼠脑损伤后2、6、12、24、48、72h的组织形态变化、神经细胞的凋亡及survivin的表达。③结果大鼠脑损伤后2h出现TUNEL阳性的神经细胞,伤后72h达到高峰。伤后2h survivin蛋白及mRNA开始表达,survivin蛋白持续升高到伤后72h,survivin mRNA持续升高至伤后48h达高峰。各组间差异均有显著性（P〈0.05）。④结论颅脑损伤可以导致神经细胞凋亡,同时诱导survivin蛋白和mRNA出现时相性的表达,并参与细胞凋亡的调控。     

刺五加体外诱导骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的 研究刺五加体外诱导骨髓基质细胞(MSCs ) 分化为神经元样细胞.方法 采用全骨髓贴壁筛选法分离培养MSCs.含刺五加的无血清DMEM/ F12 诱导MSCs 的分化.间接免疫荧光法、Western blot及RT-PCR检测巢蛋白(nestin)、β-Tubulin III及GFAP蛋白和mRNA的表达.结果 MSCs在体外传代扩增至第3代,CD44 、CD54表达阳性已达90%以上,而CD14表达阳性下降至2.37%.刺五加诱导后,MSCs胞体收缩,突起伸出,类似神经元;免疫荧光、Western blot及RT-PCR均显示刺五加诱导后的细胞nestin、β-Tubulin III蛋白和mRNA表达阳性,而GFAP表达阴性.结论 刺五加可以在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞.     

大鼠骨髓间质干细胞定向分化为神经元的实验研究

【目的】研究体外培养骨髓来源的表达nestin的成年大鼠骨髓间质干细胞（MSC）并诱导分化神经元样细胞的潜能，为中枢神经系统疾病的细胞移植治疗提供理想的供体。【方法】采用全骨髓法分离培养成年SD大鼠MSC，传至第6代的MSC接种在前一天涂有100ug／L多聚赖氨酸的塑料培养瓶或培养皿中，用含100mL／LFBS的DMEM／F12培养液添加10ng／mLbFGF的培养液培养并以DMSO、BHA与Forskolin等诱导剂联合诱导MSC分化为神经元。流式细胞仪鉴定诱导前MSC的细胞表面抗原，免疫荧光检测诱导前及诱导后6h、12h、24h神经元特异性抗原nestin、NF-200和GFAP表达率。【结果】流式细胞仪检测传至第6代MSC表面抗原CD29和CD44阳性率分为98．8％，96．6％，CD34和CD45阴性。免疫荧光鉴定传至第6代的MSC表达nestin阳性率为57．1％±6．9％，不表达NF-200和GFAP。诱导后30min可见神经元样细胞出现，诱导后6h、12h、24h经nestin和NF．200免疫荧光鉴定，诱导后6h、12h、24hnestin阳性率分别为96．5％±1．9％，88．1％±5．4％，33．5％±5．4％，NF-200阳性率分别为90．1％±2．9％，97．5％±1．3％，98．1％±1．6％。【结论】骨髓来源的nestin阳性的MSC具有神经祖细胞特性并且可诱导分化为神经元样细胞，可作为种子细胞用于神经系统疾病的治疗。     

大鼠骨髓间充质干细胞在体外向神经元样细胞的分化

目的探讨2-ME与BHA对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的作用。方法大鼠股骨中分离MSCs,贴壁法体外扩增、传代。以二巯基乙醇（2-ME）预诱导,再加入2-ME、3-叔丁基-4羟基茴香醚（BHA）诱导。免疫细胞化学染色检测巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管联合蛋白-2（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、1-氨基丁酸（GABA）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达,以鉴定分化细胞的表型特征。尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）作为细胞分裂标记检测MSCs增殖特性。结果细胞诱导后具有神经细胞的形态,并被BrdU标记,nestin、NSE、MAP-2、AchE、GABA表达阳性,而GFAP、TH表达为阴性。结论2-ME和BHA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

人神经干细胞体外诱导分化及在体裸鼠胃肠道的移植

目的:探索人神经干细胞体外诱导分化,以及在体移植人裸鼠(免疫缺陷小鼠)幽门部后的存活及分化状况.方法:取10周左右流产人胚胎神经干细胞,体外悬浮培养、传代和诱导分化,用免疫荧光方法检测神经干细胞标志物神经上皮干细胞蛋白(nestin)、肠道神经细胞标志蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)和神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP);取体外悬浮培养3个月的人神经干细胞移植入裸鼠的幽门部,检测神经十细胞在幽门局部的存活和分化状况.结果:免疫荧光染色显示体外培养的人神经干细胞nestin阳性,诱导分化后PGP9.5和GFAP阳性.将人神经干细胞移植入裸鼠幽门部后连续检测到第6周,可见细胞存活,但免疫荧光染色未能榆测到神经细胞和神经胶质细胞的分化标志.结论:人神经干细胞可以成功地在体外培养、传代和诱导分化,移植入裸鼠幽门部后可在局部存活,对干细胞移植治疗胃肠道神经系统失调性疾病进行了初步探索.