新一类抗流感药——神经氨酸酶抑制剂

 目的 介绍神经氨酸酶抑制剂对流感的预防和治疗作用。方法 对近年来国外有关扎那米韦和奥司米韦的药理学、药效学及临床应用的文献进行检索和综述。结果 扎那米韦和奥司米韦具有明显的抗流感病毒活性,对A,B型流感均有疗效,且不良反应小。结论 神经氨酸酶抑制剂有望成为新的抗流感病毒药物。     

抗流感病毒药物研究进展

对抗流感病毒药物中的神经氨酸酶抑制剂和血凝素抑制剂的研究进展进行综述，介绍了已有的神经氨酸酶抑制刺扎那米韦、奥司米韦，具有开发前景的帕洛米韦、CS-8958，以及新型抗流感化合物等的研发状况。     

吡咯烷类神经氨酸酶抑制剂的设计、合成与初步活性研究

 目的合成新型吡咯烷类神经氨酸酶抑制剂,并测定其抑制神经氨酸酶的活性。方法以L-羟脯氨酸为原料,合成一系列神经氨酸酶抑制剂,并用高通量活性筛选方法检测其对神经氨酸酶的抑制活性。结果设计、合成了18个新型的吡咯烷类化合物,其结构经核磁共振氢谱及质谱确定,并发现了几个具有较好活性的化合物。结论吡咯烷类化合物对神经氨酸酶有较高的抑制活性,值得进一步研究。     

紫萁贯众中流感病毒神经氨酸酶抑制剂的筛选

目的:筛选紫萁贯众中具有良好抗流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)活性的化合物。方法:将紫萁贯众已分离得到的23个化合物与18种流感病毒神经氨酸酶进行分子对接,通过评价结合能、结合模式及发生相互作用的氨基酸等指标进行虚拟筛选,得到候选化合物,并通过神经氨酸酶抑制剂实验验证候选化合物抑制NA的活性。结果:候选化合物异银杏双黄酮对NA抑制作用较强,IC_(50)值为(42.54±2.85)μmol·L~(-1)。结论:紫萁贯众中化合物异银杏双黄酮具有较好的流感病毒神经氨酸酶抑制作用,为紫萁贯众在抗流感病毒临床方面的应用提供了科学依据,也为紫萁贯众的深入研究奠定了基础。     

绵马贯众中流感病毒H_5N_1神经氨酸酶抑制剂的筛选

目的:筛选绵马贯众中流感病毒H_5N_1神经氨酸酶(NA,neuraminidase)抑制剂。方法:将绵马贯众中已分离得到的99个化合物建立配体库,从Protein Data Bank(PDB)中下载NA(H_5N_1)的X-ray晶体三维结构文件,采用AutoDock Vina软件筛选出与NA有较好结合作用的化合物,并通过神经氨酸酶抑制实验验证筛选出的化合物对NA的作用。结果:通过分子对接筛选出5个与NA有较好结合的化合物,神经氨酸酶抑制实验结果表明候选化合物中Dryocrassin ABBA对NA的抑制作用最强,IC₅₀为(18.59±4.53)μmol/L。结论:绵马贯众中化合物Dryocrassin ABBA具有较好的抗H_5N_1流感病毒神经氨酸酶的作用。     

截短型H1N1神经氨酸酶基因的表达及其抑制剂的高通量筛选(英文)

目的:利用毕赤酵母表达具有生物活性的H1N1神经氨酸酶并从发酵提取物中筛选其新型抑制剂。方法:截短型H1N1神经氨酸酶编码基因被亚克隆进质粒pPICZαA中以构建重组质粒pPICZαA-NA,线性化的质粒pPICZαA-NA经电转化导入毕赤酵母SMD1168中。随后,诱导鉴定正确的重组子分泌表达重组神经氨酸酶,进而利用该重组酶构建神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选模型以用于发酵提取物的筛选。结果:重组菌株能够分泌表达具有生物活性的截短型H1N1神经氨酸酶,该酶受到两种已知神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦和扎纳米韦)的显著抑制。在此基础上,筛选了20000多个发酵提取物,其中6个提取物对神经氨酸酶产生大于50%的抑制率。结论:具有生物活性的截短型神经氨酸酶可用于构建其新型抑制剂的高通量筛选模型。与从病毒中提取不同,利用毕赤酵母中制备神经氨酸酶制备的方法安全简便,这有利于促进高通量筛选神经氨酸酶新型抑制剂的研究。     

五倍子抑制流感病毒神经氨酸酶活性及活性部位的UPLC-Q-TOF-MS分析

目的:研究五倍子的流感病毒神经氨酸酶抑制活性,并采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪(UPLC-Q-TOF-MS)对其活性部位化学成分进行分析。方法:采用神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒检测五倍子乙酸乙酯、乙醇、石油醚及水提取物对流感病毒神经氨酸酶的抑制作用。采用Acquity UPLC BEH C_(18)色谱柱,以0.1%甲酸水-甲醇溶液为流动相,梯度洗脱,电喷雾离子源(ESI)负离子模式,扫描抗神经氨酸酶活性较强的乙酸乙酯及乙醇部位并采集数据。结果:质量浓度为75 mg·L~(-1)时,五倍子4个提取物均显示了一定的神经氨酸酶抑制活性。五倍子的乙酸乙酯、乙醇提取物活性较强,抑制率分别为69.64%,78.24%。从2个提取物中分析鉴定出18个化合物。其中五没食子酸酰基葡萄糖、鞣花酸、没食子酸显示不同程度的神经氨酸酶抑制活性,半数抑制浓度(IC50)分别为46.15,143.42,249.51μmol·L~(-1)。结论:该研究表明五倍子具有较强的抑制神经氨酸酶活性,通过UPLC-Q-TOF-MS明确了五倍子提取物中18个主要成分,为五倍子抗病毒活性研究及其作用机制提供了依据。     

传统中药中H7N9病毒神经氨酸酶抑制剂的计算机虚拟筛选

目的用分子对接方法从传统中药数据库(TCM Database@Taiwan)中筛选H7N9病毒神经氨酸酶抑制剂。方法流感病毒中神经氨酸酶作为一个已经被证明的抗流感药物靶点,从蛋白晶体结果数据库(Protein Data Bank,PDB)中提取晶体结构文件,对其三维结构活性部位进行分析,采用对接软件Auto Dock Vina与数据库中药物小分子进行高通量分子对接。结果得到3个亲和力高于上市的抗流感药物扎那米韦(Zanamivir)的天然小分子化合物,并确定了它们的中草药来源。结论该结果可促进从传统中药中提取、设计以及实验合成新的抗H7N9流感病毒药物。     

靶向血凝素的流感病毒进入抑制剂研究进展

 目的 概述流感病毒包膜蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)的生物学特征，以及以HA为靶点的抗流感病毒进入抑制剂的研究进展。方法 分析、整理和归纳近年来的代表性论文。结果 在流感病毒感染宿主细胞过程中,其包膜糖蛋白HA在病毒的侵入以及与靶细胞的融合过程中起关键的作用。流感病毒与靶细胞结合以及膜融合的过程是药物干预的重要环节。HA由HA1和HA2两个亚基组成，其中HA1亚基与靶细胞膜上的唾液酸受体结合，HA2则为跨膜亚基，介导病毒膜与胞内体膜的融合。流感病毒HA可作为药物的作用靶点，寻找能够抑制流感病毒进入靶细胞的抗流感药物。 作为一种新机制的抗流感药物，流感病毒进入抑制剂可望治疗对现有抗流感药物耐药的流感患者。若与M2离子通道阻断剂、神经氨酸酶抑制剂等抗流感药物联合应用，将有助于提高疗效，降低毒副作用及病毒耐药的发生。结论 流感病毒进入抑制剂作为一种新机制的抗流感药物，将对流感的防治起到突破性的作用。     

中医药治疗流感临床实践指南(2021)

流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病,发病具有季节性,也可全年流行,人群普遍易感,孕产妇、婴幼儿、老年人及慢.性基础疾病患者易发展为重症或危重症病例,死亡风险较高。目前国际指南推荐及中国上市的抗流感病毒药物主要为神经氨酸酶抑制剂,通过干扰病毒的释放从而发挥抗病毒作用4。     

热毒宁注射液及其组分对流感病毒神经氨酸酶的抑制作用研究

目的研究热毒宁注射液及其组分对流感病毒神经氨酸酶（NA）抑制活性。方法通过测定流感病毒NA的荧光强度值来确定热毒宁注射液及其组分对流感病毒NA的抑制活性。结果热毒宁注射液对H1N1、H3N2、B流感病毒NA抑制活性较高,半数抑制浓度（IC50）分别为（46．494±2．25）、（49．774±1．77）、（45．33±5．32）μg／mL。金银花聚酰胺柱洗脱浓缩液、醋酸乙酯萃取液及残液、柱色谱提取物、隐绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸B对H1N1、H3N2、B流感病毒NA酶活性均具有抑制作用。结论热毒宁注射液及其有机酸类成分对流感病毒神经氨酸酶活性均具有一定抑制作用。     

绵马贯众中间苯三酚类化合物抗流感病毒的活性筛选

目的基于绵马贯众中间苯三酚类成分寻找具有良好抗流感病毒活性的化合物。方法将25个绵马贯众中间苯三酚类化合物与12种流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)进行分子对接,通过评价结合能、结合模式及发生相互作用的重要氨基酸等指标进行虚拟筛选。通过神经氨酸酶抑制实验验证其中4个候选化合物体外抑制NA的活性,在此基础上,采用犬肾MDCK细胞通过细胞病变(CPE)法对候选化合物M22的抗病毒活性进行进一步的验证。结果通过分子对接筛选出5个与NA有较好结合能力的候选化合物;NA抑制实验结果表明候选化合物中M22对NA抑制作用最显著;CPE实验结果表明M22对多种流感病毒毒株均具有较好的抑制作用。结论绵马贯众中候选化合物M22具有较好的抗流感病毒作用,为开发新的抗流感病毒药物的深入研究奠定了基础。     

板蓝根化学成分与抗流感病毒神经氨酸酶活性相关性的探讨

目的探讨板蓝根化学成分与体外抗流感病毒神经氨酸酶(NA)活性的相关性。方法采用UPLC法建立不同产地板蓝根提取液的指纹图谱,并选取已知共有峰进行定量测定,采用试剂盒法测定药物抑制流感病毒NA活性,对化学信息和生物效应进行灰色关联分析和单因素相关分析,以探索其相关性。结果不同产地药材、不同提取方法得到的样品的化学成分量与生物效应均有一定的差异。UPLC指纹图谱各共有峰中已知峰(R,S)-告依春和尿苷与抑制流感病毒NA活性相关性较强,其中(R,S)-告依春量与生物效应显著相关。结论基于NA活性检测结果,初步明确了板蓝根化学成分量与生物效应的相关性,为板蓝根抗病毒有效成分的筛选和提取提供数据参考。     

Evaluation of the anti-neuraminidase activity of the traditional Chinese medicines and determination of the anti-influenza A virus effects of the neuraminidase inhibitory TCMs in vitro and in vivo

Etnopharmacological relevance

Neuraminidase (NA) inhibitors are currently the most effective drugs to treat influenza A viruses infection. Many traditional Chinese medicines (TCMs) have been used in the clinics to treat influenza. The anti-viral mechanisms of these TCMs and their inhibitory effects towards NA need to be systematically tested.

Aim of the study

To evaluate the anti-NA activity of the TCMs and the anti-influenza A virus effects of the NA inhibitory TCMs in vitro and in vivo.

Material and methods

We tested the inhibitory activity of water extracts from 439 TCMs towards NA. The in vitro anti-influenza virus activities of the 5 TCMs were evaluated using the strain A/California/7/2009 (H1N1) NYMC X-179A of influenza A virus. A randomly selected TCM with NA inhibitory activity, Melia toosendan extract, was further evaluated using a mouse model infected with influenza A virus.

Results

Five TCMs, Duchesnea indica (Andr.) Focke [Fragaria indica Andr.], Liquidambar formosana Hance., Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc., Melia toosendan Sieb. et Zucc., and Prunella vulgaris L., exerted potent inhibitory activity towards NA. These TCMs in the range of 25-250 μg/mL had the ability to reduce virus-induced cytopathic effect (CPE) and the virus yield in MDCK cells. Melia toosendan significantly reduced death rate and prolonged mean day to death (MDD) of the viral infected mice.

Conclusions

This study describes five TCMs exerted strong inhibitory activities towards NA, and exhibited antiviral effect against influenza A virus by reducing viral reproduction and reduced CPE of the viral infected cells. Melia toosendan, significantly reduced death rate and prolonged survival of the H1N1 viral infected mice.     

Antiviral activity of puerarin as potent inhibitor of influenza virus neuraminidase

Puerarin is a major isofiavone compound isolated from the root of Pueraria lobata. It was reported that puerarin had antioxidant, antiinflammatory, antitumor, cholesterol lowering, liver protective, and neuroprotective properties. However, few studies have explored the antiviral effect of puerarin and its target mechanism related to influenza virus. Here, the antiinfluenza activity of puerarin in vitro and in vivo and its mode of action on the potential inhibition of neuraminidase (NA) were investigated. Puerarin displayed an inhibitory effect on A/FM/1/1947(H1N1) (EC₅₀ = 52.06 μM). An indirect immunofluorescence assay indicated that puerarin blocked the nuclear export of viral NP. The inhibition of NA activity confirmed that puerarin can block the release of newly formed virus particles from infected cells. Puerarin (100 and 200 mg/kg/d) exhibited effective antiviral activity in mice, conferring 50% and 70% protection from death against H1N1, reducing virus titers, and effectively alleviating inflammation in the lungs. The molecular docking results showed that puerarin had a strong binding affinity with NA from H1N1. The results of the molecular dynamics simulation revealed that puerarin had higher stable binding at the 150‐loop region of the NA protein. These results demonstrated that puerarin acts as a NA blocker to inhibit influenza A virus both in cellular and animal models. Thus, puerarin has potential utility for the treatment of the influenza virus infection.     

甲型H1N1流感病毒NA蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备

目的:利用原核系统表达甲型H1N1流感病毒NA蛋白,制备NA特异性单克隆抗体。方法:采用RT-PCR技术扩增A/Shenzhen/71/09病毒株NA基因,通过原核表达系统表达含6×His标签NA重组蛋白,利用镍离子亲和柱进行纯化。使用NA蛋白以100g/只剂量免疫BALB/C小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤技术筛选分泌NA特异性单克隆抗体的细胞株,采用Western-blot方法对单抗进一步验证。结果:成功克隆A/Shenzhen/71/09NA基因,长度约1400bp。将NA基因克隆入原核表达载体pET-21b(+),经IPTG诱导后在大肠杆菌包涵体中检测到目的蛋白,分子量约50kd。采用尿素变性处理后借助6×His标签对蛋白进行纯化。用纯化蛋白免疫小鼠,将脾细胞与SP2/0细胞融合,使用ELISA检测细胞上清NA抗体,共筛选1株持续分泌NA抗体的杂交瘤细胞株7C11。Western-blot验证该单克隆抗体可以特异性结合NA抗原。结论:成功表达甲型H1N1流感NA蛋白,获得1株分泌NA抗体的单克隆细胞株,从而为后续甲流诊断及疫苗研制奠定基础。     

传统中药中H7N9病毒神经氨酸酶抑制剂的计算机虚拟筛选

目的:运用计算机虚拟筛选技术从传统中药数据库(TCM database@Taiwan)中快速搜索H7N9亚型流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的中药小分子抑制剂。方法:采用Auto Dock Vina软件对蛋白质晶体结构数据库PDB中NA与小分子抑制剂扎那米韦形成的复合物(PDB代码为4MWX)三维结构活性部位进行分析,基于传统中药配体库进行分子对接初次筛选。综合运用传统中药系统药理学数据库及分析平台TCMSP及Accelrys公司开发的Discovery Studio 2.5分子模拟软件包内TOPKAT模块计算药代动力学参数和毒性预测对分子对接结果进行2次筛选。结果:以原配体(扎那米韦)的自由结合能为阈值,筛选出中国传统中药数据库中3个类药性良好的化学成分与NA亲和力高于上市的抗流感药物扎那米韦的天然小分子化合物,并且确定了它们的中草药来源。结论:该研究结果可促进从传统中药库中提取、设计及实验合成新抗H7N9流感病毒药物。     

秦艽抗甲型流感病毒的药效学实验研究

目的：研究秦艽抗甲型流感病毒的药理作用。方法：复制甲型流感病毒感染小鼠肺部感染性疾病动物模型，以利巴韦林为阳性对照，观察秦艽对甲型流感病毒感染小鼠的保护作用。结果：秦艽提取物可明显延长甲型流感病毒感染小鼠存活天数和存活率；对甲型流感病毒感染小鼠肺指数、肺组织形态学都有保护作用，与模型组比较具有显著性差异（P〈0．05）。结论：秦艽具有较好的抗甲型流感病毒感染的作用，值得开发利用。     

秦艽抗甲型流感病毒的药效学实验研究

目的:研究秦艽抗甲型流感病毒的药理作用。方法:复制甲型流感病毒感染小鼠肺部感染性疾病动物模型,以利巴韦林为阳性对照,观察秦艽对甲型流感病毒感染小鼠的保护作用。结果:秦艽提取物可明显延长甲型流感病毒感染小鼠存活天数和存活率;对甲型流感病毒感染小鼠肺指数、肺组织形态学都有保护作用,与模型组比较具有显著性差异（P<0.05）。结论:秦艽具有较好的抗甲型流感病毒感染的作用,值得开发利用。     

基于抗病毒活性检测的板蓝根质量生物评价方法及优化研究

目的建立基于抗病毒活性检测的板蓝根质量生物评价方法并进行优化研究。方法分别采用红细胞凝集活性检测法和流感病毒神经氨酸酶(NA)活性检测法,建立板蓝根抗病毒活性生物测定方法,并对所建立的两种方法进行对比分析与优选。结果两种方法可用于对不同样品进行活性检测和区分,结果重复性较好(RSD=7.0%、5.78%);Pearson相关性分析表明板蓝根凝集活性与NA抑制活性之间具有显著相关性(P<0.01,r=?0.81),进一步印证了凝集活性测定法与抗病毒药理作用的关联性;在安全性、经济性、简便性和实用性等方面凝集活性检测法优势明显,可作为板蓝根质量生物测定的优选方法。结论本研究优选凝集活性检测法用于板蓝根质量的生物测定,与抗流感病毒药效相关,提高了其现行质量控制水平,并为中药质量生物测定方法的研究提供参考。