大黄素对LPS诱导的心肌细胞炎症反应和细胞凋亡的影响及机制

目的探讨大黄素对脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞炎症反应和细胞凋亡的影响及分子机制。方法培养心肌细胞H9c2,以1μg/mL的LPS诱导心肌细胞建立炎症反应模型,实验分为正常对照组、LPS诱导组、LPS+低剂量大黄素组(5μmol/L)、LPS+中剂量大黄素组(10μmol/L)和LPS+高剂量大黄素组(20μmol/L)。采用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞相对存活率;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF?α)、白细胞介素1β(IL?1β)I和白细胞介素6(IL?6)水平;流式细胞术检测细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中核因子?κB(NF?κB)P65、NF?κB抑制蛋白(IκB?α)表达。在LPS+低剂量大黄素组中添加NF?κB激动剂佛波酯(PMA),观察其对心肌细胞炎症反应和细胞凋亡的影响。结果与正常对照组比较,LPS诱导组心肌细胞相对存活率降低,TNF?α、IL?1β和IL?6水平增多,凋亡率升高,NF?κB P65表达上调,IκB?α表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05);低、中、高剂量大黄素均可逆转LPS诱导心肌细胞以上指标,且三剂量组间差异有统计学意义(P<0.05)。而PMA能够逆转大黄素的作用。结论大黄素能够抑制LPS诱导的心肌细胞炎症反应和细胞凋亡,该作用机制与大黄素抑制NF?κB信号通路的激活有关。     

姜黄素调控PI3K/Akt信号通路抑制H9c2心肌细胞的炎症损伤

目的探讨姜黄素对脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞炎症损伤的保护效应,并对其作用机制进行初步研究。方法将H9c2心肌细胞分为对照组、LPS组和姜黄素干预组。除对照组外,其余各组构建LPS诱导的心肌细胞炎症损伤模型。姜黄素干预组分别以10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L姜黄素处理细胞。培养24 h后,CCK8法检测各组细胞的存活率,ELISA法检测各组细胞分泌炎症因子IL-6和TNF-α的水平,Western blot法检测各组细胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达水平。采用PI3K抑制剂LY294002(5μmol/L)预先处理细胞4 h后,加入LPS诱导细胞损伤,再以20μmol/L姜黄素干预细胞,检测各组(对照组、LPS组、LPS+抑制剂组、LPS+姜黄素组和抑制剂+LPS+姜黄素组)细胞的相对存活率、炎症因子水平及PI3K/Akt通路蛋白的表达。结果与对照组相比,LPS组细胞的相对存活率显著降低(P0.05),细胞上清中炎症因子IL-6和TNF-α水平显著升高(P0.05),且PI3K和p-AKT蛋白表达量显著降低(P0.05)。与LPS组细胞相比,不同浓度姜黄素干预后,H9c2细胞相对存活率显著升高(P0.05),细胞分泌的IL-6和TNF-α水平显著降低(P0.05),且PI3K和p-AKT蛋白表达量显著升高(P0.05)。与LPS+姜黄素组相比,抑制剂LY294002干预细胞后,姜黄素对LPS诱导的H9c2细胞炎症损伤的保护作用减弱,细胞存活率明显下降(P0.05),IL-6和TNF-α水平显著升高(P0.05),且PI3K和p-AKT蛋白表达量显著降低(P0.05)。结论姜黄素对LPS诱导的H9c2心肌细胞炎症损伤具有保护效应,其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。     

基于MAPKs和NF-κB信号通路的麻黄-桂枝药对抗炎作用机制研究

目的:考察麻黄-桂枝药对对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及其分子机制。方法:体外培养RAW264.7细胞,CCK8法确定麻黄-桂枝作用的最适浓度,设定正常对照组、模型对照组(LPS组)、实验组(25、50、100、200μg/mL的麻黄-桂枝+LPS组),实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6 mRNA的表达,Western blot法检测MAPKs和NF-κB通路中关键蛋白的表达水平。结果:麻黄-桂枝作用的最适浓度为25μg/mL～200μg/mL。与正常对照组比较,模型对照组NO、PGE_2、TNF-α、IL-6含量显著升高,iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平显著上调(P<0.01);与模型对照组比较,麻黄-桂枝100μg/mL～200μg/mL组iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平显著下降(P<0.05或P<0.01)。LPS致炎后,与正常对照组比较,模型对照组30 min P-p65、P-IκB-α、P-p38、P-ERK、P-JNK蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,麻黄-桂枝各组30 min P-p65、P-IκB-α、P-JNK蛋白表达显著降低、P-ERK显著升高(P<0.01)、P-p38无显著差异,12 h后P-p38和P-ERK表达明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:麻黄-桂枝可能通过对炎症细胞因子和促炎介质的调控来减轻炎症反应;并通过调控NF-κB信号通路中p65、IκB-α以及MAPKs信号通路中p38、ERK、JNK蛋白的磷酸化来发挥抗炎作用。     

复方七芍降压片对TNF-α诱导的与平滑肌细胞共培养的血管内皮细胞P2Y6信号通路相关因子表达的影响

目的观察复方七芍降压片对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的与平滑肌细胞共培养的血管内皮细胞中炎症因子与P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表达的影响,探讨其治疗高血压的机制。方法采用内皮细胞和平滑肌细胞构建共培养体系,利用炎症因子TNF-α建立高血压炎症微环境。将共培养好的细胞随机分为正常组、模型组、空白血清组、MRS2578组、厄贝沙坦药物血清组、复方七芍药物血清组、MRS2578+复方七芍药物血清组。MRS2578组和MRS2578+复方七芍药物血清组加入10μmol/L MRS2578。正常组和模型组加入等量培养液,余各组加入10%药物血清及空白血清。采用倒置显微镜观察内皮细胞和平滑肌细胞形态;采用ELISA检测细胞上清液炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-10水平;采用免疫荧光、Western blot、RT-qPCR技术检测内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2的表达。结果与正常组比较,模型组和空白血清组内皮细胞和平滑肌细胞数量明显减少,细胞轮廓不清晰,折光性降低,漂浮的死细胞团块增多;IL-1β含量显著增加,IL-10含量显著减少(P0.01);P2Y6、MEK1/2、ERK1/2荧光强度、灰度值、m RNA水平明显升高(P0.01)。与模型组比较,复方七芍药物血清组内皮细胞和平滑肌细胞折光性增强,细胞形态恢复正常;IL-1β水平明显降低(P0.05);P2Y6、MEK1/2、ERK1/2荧光强度、灰度值、m RNA水平明显降低(P0.01)。结论复方七芍降压片可明显调控TNF-α诱导的内皮炎症反应,改善内皮炎症导致的平滑肌细胞损伤,维持其正常功能,其机制可能与调控内皮细胞P2Y6受体及其下游信号通路MEK1/2、ERK1/2蛋白表达,改善炎症反应有关。     

圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷改善血管内皮细胞损伤作用机制研究

目的:探讨河南道地药材怀菊花中圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对血管内皮细胞损伤的干预作用及作用机制。方法:血管内皮细胞饥饿处理12 h后,以2.5μg/mL LPS诱导24 h,建立血管内皮细胞损伤模型。采用ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、VCAM-1、ET-1水平,TBA法检测MDA水平,羟胺法检测SOD水平,一步法检测NO水平,Western blot法检测细胞内MAPK信号通路p-MEK1/2、MEK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-P38、P38蛋白表达。结果:怀菊花中圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对该模型有明显的干预作用,可显著升高SOD、NO水平,降低TNF-α、IL-6、IL-1β、VCAM-1、ET-1、MDA水平,并显著下调p-MEK1/2、p-ERK1/2的表达。结论:圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷可能通过调节ERK/MAPK信号通路,降低炎症因子、细胞因子及氧化应激水平,从而抵抗LPS诱导的血管内皮细胞损伤。     

芒果苷对慢性炎症MAPK信号通路的影响

目的:探讨芒果苷调控MAPK信号通路而抑制脂多糖(LPS)诱导慢性炎症的机制.方法:60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药泼尼松5 mg·kg-1·d-1组与芒果苷200,100,50 mg·kg-1·d-1组.以LPS间断尾静脉注射建立慢性炎症模型,进行大鼠全血白细胞计数,ELISA测定血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1);RT-PCR检测白细胞MAPK信号通路p8,ERK,JNK基因表达.结果:与模型组比较,芒果苷200 mg·kg-1组全血白细胞总数与血清TNF-α,IL-6,sICAM-1水平明显降低(P＜0.05),白细胞ERK,JNK基因表达下调(P＜0.05),p38基因表达无统计学差异.结论:芒果苷显著抑制LPS诱导慢性炎症的作用机制与其下调MAPK信号通路中ERK,JNK基因表达而降低炎症因子水平有关.     

川芎嗪调控miR⁃31⁃5p/Ednrb通路抑制人肺泡上皮细胞BEAS⁃2B凋亡和炎症反应

目的探讨川芎嗪(TMP)调控miR?31?5p/内皮素受体B(Ednrb)通路对人肺泡上皮细胞BEAS?2B凋亡和炎症反应的影响。方法采用1μg/mL脂多糖(LPS)处理BEAS?2B细胞构建炎症模型。将BEAS?2B细胞分为对照组、LPS组、LPS+川芎嗪5μmol/L组、LPS+川芎嗪20μmol/L组、LPS+川芎嗪80μmol/L组、LPS+miR?con组、LPS+miR?31?5p组、LPS+si?con组、LPS+si?Ednrb组、LPS+川芎嗪+pcDNA组、LPS+川芎嗪+pcDNA?Ednrb组。酶连免疫吸附实验(ELISA)试剂盒检测细胞培养液中白介素IL?1β、IL?6和TNF?α(肿瘤坏死因子)的含量;RT?qPCR和Western blot检测miR?31?5p(炎性相关微小RNA)和Ednrb(内皮素受体B)表达。双荧光素酶报告实验和Western blot验证miR?31?5p对Ednrb的靶向调控关系。结果与对照组比较,LPS组BEAS?2B细胞Ednrb蛋白、凋亡率以及IL?1β、IL?6和TNF?α的水平增加,miR?31?5p表达降低(P<0.01);与LPS组比较,LPS+川芎嗪5μmol/L组、LPS+川芎嗪20μmol/L组、LPS+川芎嗪80μmol/L组BEAS?2B细胞Ednrb蛋白表达、凋亡率以及IL?1β、IL?6和TNF?α的水平降低,miR?31?5p表达升高(P<0.05,P<0.01)。miR?31?5p靶向负性调控Ednrb表达。与LPS+miR?con组比较,LPS+miR?31?5p组BEAS?2B细胞凋亡率以及IL?1β、IL?6和TNF?α的水平降低(P<0.01);与LPS+si?con组比较、LPS+si?Ednrb组BEAS?2B细胞凋亡率以及培养液中IL?1β、IL?6和TNF?α的水平降低(P<0.01);与LPS+川芎嗪+pcDNA组比较,LPS+川芎嗪+pcDNA?Ednrb组BEAS?2B细胞凋亡率、培养液中IL?1β、IL?6和TNF?α的浓度升高(P<0.05)。结论川芎嗪通过上调miR?31?5p/Ednrb通路抑制人肺泡上皮细胞BEAS?2B凋亡和炎症反应。     

ERK1/2信号通路参与美洲大蠊提取物诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的:观察美洲大蠊提取物抗肝癌细胞的凋亡作用是否与胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)介导的凋亡通路有关。方法:以人肝癌SMMC-7721细胞株为研究对象,MTT法检测肿瘤细胞抑制率; Annexin V-FITC/PI染色观察细胞凋亡情况; JC-1染色观察线粒体膜电位情况;蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测细胞核内凋亡诱导因子(AIF)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、大鼠肉瘤蛋白(Ras)、快速反应肉瘤蛋白(Raf)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达。结果:与阴性对照组相比,40、80μg/ml的美洲大蠊提取物可不同程度地抑制SMMC-7721细胞的增殖,诱导其凋亡,降低线粒体膜电位。Western Blot结果显示,与阴性对照组相比美洲大蠊提取物可使核AIF、caspase-3表达增多,而ERK1/2通路的Ras、Raf、p-ERK蛋白表达均有不同程度降低。ERK1/2抑制剂PD98059在抑制ERK1/2信号通路的同时,抑制了SMMC-7721增殖,诱导其凋亡。结论:美洲大蠊提取物诱导SMMC-7721细胞凋亡,抑制其增殖,机制可能与下调Ras/Raf/ERK1/2信号通路有关。     

山奈酚干预对D-氨基半乳糖/脂多糖诱导小鼠急性肝衰竭的保护作用

目的探讨山奈酚对D-氨基半乳糖(D-Ga IN)/脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肝衰竭(acute hepatic failure,AHF)的干预作用。方法 37只C57 BL/6小鼠按完全随机分组法分为正常对照组(10只)、AHF模型组(13只)、山奈酚干预组(14只)。AHF模型组小鼠腹腔注射D-Ga IN(700 mg/kg)/LPS(10μg/kg),作用6 h,建立AHF模型;山奈酚干预组小鼠于建模前2 h尾静脉注射5 mg/kg的山奈酚,后腹腔注射D-Ga IN(700 mg/kg)/LPS(10μg/kg),作用6 h,建立AHF模型。正常对照组腹腔注射等量生理盐水。检测血清ALT、AST水平,观察肝脏组织病理学变化,检测肝脏组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达,检测NF-κB通路相关分子表达及肝细胞凋亡情况。结果与AHF模型组比较,山奈酚干预组小鼠的生存率提高(P0.05)。与正常对照组比较,AHF模型组血清ALT和AST水平升高(P0.05),炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达升高(P0.05),肝脏组织中NF-κB信号通路相关分子IκB-α表达降低(P0.05),p-NF-κBp65表达升高(P0.05),肝脏病理损伤严重,细胞凋亡增多;与AHF模型组比较,山奈酚干预组血清ALT和AST水平降低(P0.05),炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达降低(P0.05),肝脏组织中NF-κB信号通路相关分子IκB-α升高(P0.05),p-NF-κBp65表达降低(P0.05),肝脏病理损伤减轻,细胞凋亡减少。结论山奈酚干预通过抑制炎症反应对D-Ga IN糖/LPS诱导的小鼠AHF发挥保护作用。     

化脂复肝颗粒通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3减轻Kupffer细胞炎症改善非酒精性脂肪性肝病机制研究

目的:探讨化脂复肝颗粒在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中对Kupffer细胞(KCs)TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路的影响。方法:将分离培养的KCs随机分为空白组、LPS干预组、LPS+空白血清组、LPS+化脂复肝组、高糖+对照组、高糖+LPS干预组、高糖+LPS+空白血清组、高糖+LPS+化脂复肝组,LPS干预浓度为100 ng/ml,高糖干预为于KCs培养基中另加入葡萄糖30 mmol/L。用CCK-8法检测各组KCs增殖情况; 酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组KCs培养基上清液中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量; 反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组KCs中TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β的基因表达情况。结果:CCK-8检测显示,空白及高糖培养对照组KCs细胞不断增殖,长势良好; LPS+化脂复肝组与高糖+LPS+化脂复肝组KCs缓慢增殖,非高糖组KCs均较含高糖组KCs增殖速率更快; 而LPS或高糖+LPS诱导模型组及各加空白血清组KCs于第6小时开始出现凋亡,含高糖组KCs均较非高糖组KCs凋亡速率更快。非高糖各组与含高糖各组中促炎因子TNF-α、IL-1β含量以及炎症相关基因(TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、NF-κB/p-65、TNF-α、IL-1β、IL-18)表达水平均呈相同变化趋势,且含高糖各组上述促炎因子及炎症相关基因表达水平均较非高糖组高。以非高糖组为例,LPS诱导模型组和LPS+空白血清组的促炎因子TNF-α与IL-1β含量均显著高于对照组(P<0.05),炎症相关基因TLR4、MyD88等的mRNA表达水平也均显著高于对照组(P<0.05),而LPS诱导模型组与LPS+空白血清组间上述各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05); 与LPS诱导模型组或LPS+空白血清组比较,LPS+化脂复肝组促炎因子TNF-α与IL-1β含量均显著降低(P<0.05),炎症相关基因TLR4、MyD88等的mRNA表达水平也均显著降低(P<0.05)。结论:化脂复肝颗粒含药血清可改善KCs活力,有效减轻KCs炎症反应,减少KCs细胞焦亡的发生,具有显著的抗炎、抗氧化损伤及保肝作用,其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65/NLRP3信号通路的激活相关。     

贝母素乙抑制MEK/ERK的磷酸化对新生小鼠柯萨奇B病毒性心肌炎心肌细胞凋亡和炎症水平的影响

目的:探究贝母素乙抑制MEK/ERK的磷酸化对新生小鼠柯萨奇B病毒性心肌炎心肌细胞凋亡和炎症水平的影响。方法:48只新生BALB/c小鼠中随机挑8只作正常对照组,剩余小鼠采用柯萨奇B3病毒感染小鼠构建CVB3心肌炎动物模型,建模成功后再随机分为曲美他嗪1 mg/kg阳性对照组、模型对照组和贝母素乙2. 5、5、10 mg/kg组;分别尾静脉注射或者灌胃相应药物,连续处理28 d,1次/d;检测小鼠心脏功能指标(心率HR、左心射血分数LVEF、左心室缩短分数FS、左心室壁厚度LVWT及左心室收缩末期容积LVESV);采用ELISA法检测血清中心损标记物肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(Mb)、炎症因子白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)及一氧化氮合酶(i NOS)的含量,HE染色观察心肌损伤情况,RT-PCR和Western blotting检测Caspase-3、Caspase-9、丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平。结果:与正常对照组相比,CVB3模型组小鼠心肌细胞损伤显著,其HR、LVEF、FS、LVWT水平显著降低,心肌组织中炎细胞数、LVESV水平、Mb、CK、CK-MB、IL-6、TNF-α、IL-1β、i NOS含量明显升高,Caspase-3、Caspase-9、MEK及ERK磷酸化水平显著上调(P <0. 05);与CVB3模型组相比,贝母素乙各组小鼠心肌细胞损伤明显减轻,其HR、LVEF、FS、LVWT水平显著升高,心肌组织中炎细胞数、LVESV水平、Mb、CK、CK-MB、IL-6、TNF-α、IL-1β、i NOS含量明显降低,Caspase-3、Caspase-9、MEK及ERK磷酸化水平显著下调(P <0. 05)。结论:贝母素乙可保护柯萨奇B病毒性心肌炎新生小鼠心肌受损,抑制心肌细胞的凋亡,并显著改善其心脏功能,缓解炎症水平,可能与抑制MEK/ERK的磷酸化有关。     

ERK1/2与p38信号通路介导三七皂苷R1抗H_2O_2致心肌细胞损伤作用

目的:研究三七皂苷R1对过氧化氢(H2O2)诱导乳鼠心肌细胞损伤的影响及对细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase,ERK1/2)与p38通路的调节。方法:以50μmol/L H2O2干预原代培养心肌细胞3 h建立氧化损伤模型,分别观察0.1、1、10μmol/L三七皂苷R1对细胞活力、凋亡及细胞内过氧化物酶LDH、MDA及SOD的表达情况,再检测p-ERK1/2及p-p38蛋白水平;分别以ERK1/2与p38通路特异性阻断剂干预细胞,观察两者对心肌细胞的影响。结果:三七皂苷R1显著增加细胞活力,抑制细胞凋亡,降低LDH与MDA浓度,增加SOD活性,并且能明显降低p-ERK1/2与p-p38表达,以10μmol/L三七皂苷R1干预效果最明显(P0.01)。阻断ERK1/2与p38通路后,细胞活力增加,凋亡率降低,LDH与MDA浓度降低,SOD活性明显增加。结论:三七皂苷R1能显著减轻H2O2诱导心肌细胞损伤,增加细胞活力,降低凋亡率,主要与调节ERK1/2及p38信号通路有关。     

黄芪甲苷基于MEK5/ERK5信号通路对阿尔茨海默病大鼠小胶质细胞活性的影响

目的研究黄芪甲苷基于丝裂原激活蛋白激酶5(MEK5)/细胞外信号调节激酶5(ERK5)信号通路对阿尔茨海默病(AD)大鼠小胶质细胞活性的影响。方法清洁级健康SD雄性大鼠60只,随机选取10只为正常组,其余50只建立AD模型,然后随机分为模型组、阳性对照组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组,每组10只。阳性对照组给予石杉碱甲(0.02 mg/kg)干预,正常组和模型组分别给予等体积的0.9%NaCl溶液,黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组分别给予15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg的黄芪甲苷。各组均干预21 d,检测白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,以及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、MEK5、ERK5表达。结果与正常组相比,模型组、阳性对照组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组IL-1、TNF-α水平及GRP78、CHOP、MEK5、ERK5表达升高(P0.05);与模型组相比,阳性对照组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组IL-1、TNF-α水平及GRP78、CHOP、MEK5、ERK5表达降低,且随剂量增加而降低(P0.05)。结论黄芪甲苷基于MEK5/ERK5信号通路对AD大鼠小胶质细胞的活性具有抑制作用,可减少AD大鼠神经细胞的凋亡。     

金雀异黄素对脂多糖诱导人肺泡上皮细胞A549炎症及凋亡的影响

目的观察金雀异黄素对脂多糖(LPS)诱导人肺泡上皮细胞A549发生炎症与凋亡的影响,探讨其改善肺损伤的作用机制。方法 CCK-8法检测不同浓度金雀异黄素和/或LPS干预细胞12 h后的活力;RT-PCR检测金雀异黄素对LPS诱导的炎性因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达;TUNEL法检测细胞凋亡;Western blot检测信号通路的变化。结果金雀异黄素(1、5、10μmol/L)对细胞活力无明显影响,LPS(1μg/m L)可显著降低细胞活力,而金雀异黄素与LPS共同干预则细胞活力呈浓度依赖性升高;RT-PCR结果显示,LPS可显著提高炎性因子的基因表达,而金雀异黄素则可呈浓度依赖和时间依赖抑制其表达;TUNEL染色结果显示,金雀异黄素(10μmol/L)与LPS联合干预12 h可显著减少LPS诱导的细胞凋亡;Western blot结果显示,金雀异黄素(10μmol/L)与LPS(1μg/m L)协同刺激A549细胞30 min可显著抑制LPS诱导的IκBα、p65信号通路的磷酸化水平。结论金雀异黄素可抑制LPS诱导的人肺泡上皮细胞发生炎症和凋亡,从而发挥保护作用。     

宁心痛颗粒及其有效组分抑制HSP60诱导的THP-1细胞炎症反应的实验研究

目的观察NF-κB、MAPKs信号通路在介导重组人热休克蛋白60(HSP60)诱导巨噬细胞(Mφ)炎症反应中的作用,探讨益气活血方宁心痛颗粒的抗炎机制。方法采用人急性单核白血病细胞株(human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)体外培养模型,结合血清药理学与中药组分配伍方法进行论证。将THP-1细胞诱导分化为Mφ,分为对照组(Mφ+培养液)、HSP60(10μg/mL)组、黄芪多糖(APS,200μg/mL)组、藁本内酯(LIG,20μg/mL)组、APS(200μg/mL)+LIG(20μg/mL)组、含药血清(3%)组、辛伐他汀(15μg/mL)组,各药物干预组以相应治疗药物预处理24h后,除对照组外,其余各组均加入终浓度为10μg/mL的HSP60。检测磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)、MAPKs[包括p-p38、胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)]蛋白表达及TNF-α、IL-6含量。结果与对照组比较,HSP60组的p-NF-κB及p-p38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达和TNF-α、IL-6含量升高(P0.01);与HSP60组比较,各药物干预组检测蛋白表达和TNF-α、IL-6含量均降低(P0.05,P0.01);与APS组比较,APS+LIG组、含药血清组和辛伐他汀组检测蛋白表达和TNF-α、IL-6含量均降低(P0.05,P0.01);与LIG组比较,APS+LIG组检测蛋白表达均降低(P0.05,P0.01),TNF-α、IL-6含量差异无统计学意义(P0.05),含药血清组和辛伐他汀组检测蛋白表达及TNF-α、IL-6含量均降低(P0.05,P0.01);含药血清组和辛伐他汀组均较APS+LIG组蛋白表达和TNF-α、IL-6含量降低更明显(P0.05,P0.01),且辛伐他汀组降低蛋白表达的效果优于含药血清组(P0.01)。结论 NF-κB及MAPKs信号通路是HSP60诱导THP-1源性Mφ发生炎症反应的关键信号通路,宁心痛颗粒含药血清、APS、LIG、APS配伍LIG可不同程度通过调控以上通路发挥抗炎效果,其中宁心痛颗粒含药血清的效果最强。     

五味子乙素介导Traf6/NF-κB信号通路抑制心肌细胞肥大实验研究

目的:研究五味子乙素抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导心肌细胞肥大的作用及其机制。方法:原代培养心肌细胞,用LPS(1 mg/L)诱导心肌细胞肥大,考察IκBα抑制剂BAY11-7082和不同剂量五味子乙素对心肌细胞肥大的影响。采用计算机图像分析系统观察细胞大小;考马斯亮蓝法分析细胞总蛋白量;ELISA试剂盒检测白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)表达量;免疫印迹技术检测心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和Traf6/NF-κB信号通路蛋白表达水平。结果:与LPS诱导组相比,五味子乙素和BAY11-7082均可以抑制LPS诱导的心肌细胞肥大,体现在蛋白含量降低,细胞体积减小,ANP蛋白表达降低(P0.05);五味子乙素还能够降低炎症反应,表现在细胞外液中炎症因子IL-6和TNF-α水平降低(P0.05),Traf6、p65蛋白表达量降低(P0.05)及IκBα蛋白水平升高(P0.05),且呈浓度依赖性。此外,高剂量五味子乙素与BAY11-7082对心肌细胞肥大的保护作用相近。结论:五味子乙素能抑制LPS诱导原代心肌细胞肥大,对心肌细胞的保护作用主要通过抑制Traf6/NF-κB信号通路的活化来实现。     

内脏脂肪素诱导血管内皮细胞损伤的MAPK信号通路及丹参酮ⅡA磺酸钠的干预作用

目的:研究内脏脂肪素(visfatin)参与血管内皮细胞损伤的机制及丹参酮ⅡA磺酸钠保护作用的机制。方法:培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC,1×105/mL),用visfatin(250μg·L-1)刺激HUVEC 4 h,以丹参酮ⅡA(30,60,120 mg·L-1))干预24 h,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中高敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、金属基质蛋白-9(MMP-9)水平,用Western blotting方法观察丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路中p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的活化情况。分别用p38 MAPK,ERK,JNK特异性抑制剂进行预处理细胞,再给予visfatin(250μg·L-1)刺激4 h,检测细胞上清液中hs-CRP,TNF-α,MMP-9水平。结果:与正常组比较,模型组细胞活力显著降低,细胞上清炎症因子hs-CRP,TNF-α,MMP-9显著增高,细胞内p38 MAPK,ERK,JNK磷酸化蛋白表达显著增高。与模型组比较,丹参酮ⅡA呈剂量依赖性地降低visfatin导致的hs-CRP,TNF-α,MMP-9高表达,并能抑制p38MAPK,ERK1/2磷酸化活化,但对JNK无显著抑制作用。用p38 MAPK,JNK,ERK1/2特异性抑制剂预刺激,可阻止visfatin诱导的hs-CRP,TNF-α,MMP-9细胞因子大量表达。结论:visfatin可能通过激活MAPK磷酸化信号通路,诱导炎症细胞因子高表达,促使血管内皮细胞炎症反应,丹参酮ⅡA通过抑制MAPK信号通路p38,JNK的激活,抑制visfatin诱导的炎症因子高表达,从而减少血管内皮细胞损伤。     

基于NF-κB通路的芒果苷干预脂多糖诱导的细胞炎症作用机制研究

目的研究芒果苷对小鼠巨噬细胞RAW 264.7的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法采用脂多糖(LPS)诱导RAW 264.7细胞炎症模型。实验分四步:(1)细胞存活率实验分5组,即:空白组、LPS组、LPS+不同浓度(50、100、150μg/mL)芒果苷组。MTT法检测细胞存活率。(2)一氧化氮(NO)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白介素6(IL-6)分泌实验分6组,即:空白组、LPS组、LPS和不同浓度芒果苷(50、100、150μg/mL)组、LPS+BAY 11-7082[核因子κB(NF-κB)抑制剂]组。Griess法检测NO分泌量,ELISA法检测IL-1β、TNF-α及IL-6分泌量。(3)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与环氧化酶-2(COX-2)mRNA及蛋白表达实验分组同细胞存活率实验。实时荧光定量PCR检测iNOS及COX-2 mRNA水平变化,Western blot检测iNOS及COX-2蛋白表达水平。(4)细胞质、细胞核中NF-κB表达实验分3组,即:空白组、LPS组、LPS+150μg/mL(终末浓度)芒果苷共处理组, Western blot检测细胞质、细胞核中NF-κB p65蛋白表达量。结果 (1)与空白组比较,LPS组显著降低RAW264.7细胞存活率(P0.05);与LPS组比较,50～150μg/mL芒果苷预处理对RAW264.7细胞增殖无显著影响(P0.05)。(2)与空白组比较,LPS组NO、IL-1β、TNF-α、IL-6分泌量显著升高(P0.05);与LPS组比较,除50μg/mL芒果苷预处理组NO、TNF-α分泌量无显著变化外(P0.05),其余各组NO、IL-1β、TNF-α、IL-6分泌量均显著降低(P0.05)。(3)与空白组比较,LPS组iNOS、COX-2 mRNA及蛋白表达量均显著升高(P0.05);与LPS组比较,50～150μg/mL芒果苷预处理组iNOS、COX-2 mRNA及蛋白表达显著下降(P0.05)。(4)与空白组比较,LPS组细胞质中NF-κB p65蛋白量减少,细胞核中则增多(P0.05);与LPS组比较,150μg/mL芒果苷预处理组细胞质中NF-κB p65蛋白量升高,细胞核中蛋白量减少(P0.05)。结论芒果苷可能通过抑制NF-κB信号通路,而抑制iNOS、COX-2表达及相关炎症因子的分泌,干预LPS诱导的RAW264.7细胞炎症。     

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨刺芒柄花素对LPS诱导的大鼠子宫内膜上皮细胞损伤的影响

目的:探讨刺芒柄花素通过调控Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)/核转录因子κB(NF-κB)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的大鼠子宫内膜上皮细胞损伤的影响。方法:以LPS诱导大鼠子宫内膜上皮细胞损伤,采用CCK8法检测细胞活性;采用RT-qPCR法检测TLR4过表达效率;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6含量;Western Blot法检测TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白的表达。结果:与空白对照组比较,模型对照组细胞抑制率、细胞凋亡率、炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明显增加,p-P65/P65、p-IκBα/IκBα、MyD88和TLR4蛋白表达明显上调(P<0.05或P<0.01);与模型对照组相比,刺芒柄花素12μmol/L组细胞抑制率、细胞凋亡率、炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明显降低,p-P65/P65、p-IκBα/IκBα、MyD88和TLR4蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01);TLR4过表达...     

半夏有效成分大黄酚对肿瘤坏死因子-α诱导人脑微血管内皮细胞的作用机制

目的:研究半夏有效成分大黄酚对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的作用机制。方法:体外培养HBMEC,用TNF-α诱导HBMEC造模,将细胞分为正常组、模型组、大黄酚组、依达拉奉组。采用噻唑蓝比色(MTT)法检测大黄酚对HBMEC增殖能力的影响,用逆转录PCR法(RT-PCR)检测TNF-α,白细胞介素-6(IL-6),IL-8 mRNA的表达,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α,IL-6,IL-8,磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)和磷酸化细胞外调节蛋白激酶(pERK)的含量,用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测p-JNK,total JNK,p-ERK和total ERK的蛋白表达。结果:在256μmol·L~(-1)浓度时,大黄酚对HBMEC细胞有明显的抑制作用(P0.01)。与模型组比较,在64~128μmol·L~(-1)浓度时,大黄酚对模型细胞生长有明显的促进作用(P0.05);大黄酚组TNF-α,IL-6,IL-8 mRNA表达明显下降(P0.01);大黄酚组TNF-α,IL-6,IL-8,p-JNK和p-ERK的含量明显减少(P0.05);大黄酚组磷酸化JNK/JNK,磷酸化ERK/ERK表达明显下降(P0.05)。结论:半夏有效成分大黄酚具有抑制TNF-α诱导HBMEC损伤作用,可能是通过下调ERK/JNK信号通路减少炎症相关因子TNF-α,IL-6和IL-8的表达。