整合素连接激酶在C57小鼠Lewis肺癌中的表达及肺岩宁方对其的调控作用

目的探讨肺岩宁方对整合素连接激酶（integrin-linked kinase.ILK）mRNA及蛋白表达的影响。方法建立C57小鼠Lewis肺癌模型。将C57BL-6纯系10周龄雄性小鼠随机分为正常组、模型组、顺铂（DDP）组、肺岩宁方组,每组10只。正常组正常饲养;模型组以0.9%NaCl溶液0.4ml灌胃;顺铂组在造模后第5天开始给药,在开始给药的第1、3、5天,DDP溶液1ml（含DDP0.1mg）腹腔注射,0.9%NaCl溶液0.4ml灌胃;肺岩宁方组在造模后第5天开始给予肺岩宁方药液0.4ml（生药含量36.1g/kg）灌胃。采用Real time PCR和Western blot方法分别检测ILK在移植瘤组织和转移灶发生的肺组织中mRNA、蛋白水平的表达。结果与正常组比较,模型组肿瘤肺转移率、转移灶及Ilk基因表达差异均有统计学意义（P〈0.01）,说明模型成功。与模型组比较,肺岩宁方组可以显著降低肺转移灶的发生的作用（P〈0.01）。各组移植肿瘤组织中,肺岩宁方组ILK基因表达与模型组比较显著降低（P〈0.01）;各组肺组织中,与模型组比较,肺岩宁方组ILK基因表达显著下降（P〈0.01）,而化疗组ILK基因表达反而升高（P〈0.01）。与模型组比较,肺岩宁方组ILK蛋白的表达明显降低（P〈0.01）。结论肺岩宁具有显著降低ILK基因表达的作用,调控Snail信号途径的关键信号分子ILK基因有可能是肺岩宁方抗肿瘤转移的有效作用靶点所在。     

振肌胶囊对大鼠疲劳模型骨骼肌细胞凋亡的影响

用游泳方法建立大鼠疲劳模型,观察爱维治与不同剂量振肌胶囊对大鼠疲劳模型血清乳酸含量及骨骼肌细胞调亡的影响.结果显示:模型组与正常对照组相比大鼠血清乳酸含量明显增高(P＜0.05).中药常规剂量组、中药大剂量组与模型组相比,血清乳酸含量明显降低(P＜0.05).与模型组相比,各组骨骼肌细胞凋亡数目明显减少(P＜0.05),中药大剂量组与中药常规剂量组相比骨骼肌细胞凋亡数目亦明显减少(P＜0.05).爱维治(Actovegin)组与中药大剂量组相比肌细胞凋亡数目统计学上无差异(P＞0.01),推测中药振肌胶囊抗疲劳的机理可能与降低血清乳酸及防止骨骼肌细胞的凋亡有关,其机理有待进一步研究.     

肺岩宁颗粒对肿瘤相关巨噬细胞及Lewis肺癌细胞侵袭能力的影响

目的:观察中药制剂肺岩宁颗粒对肿瘤微环境中的关键成分肿瘤相关巨噬细胞的作用及其对小鼠Lewis肺癌细胞侵袭能力的调节作用。方法:采用肺岩宁颗粒给SD大鼠灌胃制备药物血清;利用Lewis肺癌细胞制作条件培养基(Conditioned medium,CM)并诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞;侵袭实验检测肺岩宁颗粒对Lewis肺癌细胞侵袭能力的影响;ELISA法检测细胞上清中白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、白细胞介素-12(interleukin-12 p40,IL-12)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)水平;Western blot检测肿瘤细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、核转录因子kappa B p65(unclear factor ka PPa B p65,NF-κB p65)蛋白表达。结果:侵袭实验:DDP组、肺岩宁颗粒组的细胞侵袭能力受到抑制,这两组穿过膜的Lewis细胞个数比模型组少(P0.05),在此基础上发现肺岩宁颗粒组穿过膜的Lewis细胞个数比DDP组少(P0.05)。ELISA法:DDP组、肺岩宁颗粒组两组细胞上清液的IL-10的含量水平比模型组低(P0.05),而肺岩宁颗粒组细胞和DDP组比较,肺岩宁颗粒组细胞上清液IL-10的含量水平比DDP组高(P0.05);肺岩宁颗粒组细胞上清IL-12水平明显高于模型组(P0.05),而且肺岩宁颗粒组细胞上清IL-12水平高于DDP组(P0.05);DDP组、肺岩宁颗粒组细胞上清TGF-β1水平均明显低于模型组(P0.05);与模型组比较,DDP组、肺岩宁颗粒组细胞中MMP-2、MMP-9、NF-κB p65的表达均降低,且肺岩宁颗粒组表达更低。结论:肺岩宁颗粒能抑制Lewis肺癌细胞侵袭能力,其机制可能是通过对NF-κB信号通路的干预进一步调节肿瘤相关巨噬细胞,促进M2向M1转化、抑制M2,抑制血清中IL-10、TGF-β1,提升IL-12水平,抑制MMP-2、MMP-9的产生。     

肺岩宁方对人高转移95-D肺癌细胞侵袭能力及对twist、snail及Sip1表达的影响

目的:在前期体内实验(文章已经发表)证实上皮-间质细胞转化核转录因子twist、snail在肺岩宁方抗肿瘤转移具有重要作用的基础上,进一步体外实验观察肺岩宁方对人高转移95-D肺癌细胞侵袭能力及twist、snail及Sip1基因和蛋白表达的影响。方法:应用不同浓度肺岩宁含药血清干预治疗人高转移肺癌细胞95-D的基础上,采用Tran-swell小室法检测细胞侵袭能力,并应用real-time PCR及Western blot方法检测对上皮-间质细胞转化核转录因子twist、snail及Sip1基因和蛋白表达的影响。结果:Transwell上室加入不同浓度肺岩宁方含药血清后,15%、20%及25%的肺岩宁含药血清的穿膜数量明显低于对照组(P<0.01);Real-time PCR结果表明:与对照组相比较,不同浓度肺岩宁含药血清对Twist均有下调作用(P<0.01),5%、10%、15%浓度的含药血清及DDP对Snail有下调作用(P<0.01);10%、15%肺岩宁方含药血清及DDP对Sip1有下调作用(P<0.05或P<0.01)。Western blot结果表明:5%、10%肺岩宁方含药血清具有显著下调Twist蛋白表达的作用(P<0.01),5%、15%浓度的肺岩宁方含药血清对Snail有下调作用(P<0.01),15%肺岩宁方含药血清对Sip1蛋白有下调作用(P<0.01)。结论:肺岩宁方通过抑制Twist、Snail及SIP1的表达,从而抑制肿瘤异质黏附能力和运动能力来参与肺癌的侵袭和转移。     

肺岩宁方对转移性肺癌小鼠上皮标志因子表达的影响

目的 研究上皮-间质细胞转化相关上皮细胞标志因子在C57小鼠Lewis肺癌中的表达以及肺岩宁方对其mRNA表达的影响. 方法 采用实时PCR观察C57小鼠Lewis肺癌右腋下移植瘤和远处转移灶发生的肺组织中上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)、α-连环蛋白(α-catenin)、β-连环蛋白(β-catenin)mRNA表达及肺岩宁方对其表达的影响.结果 肺岩宁治疗组较模型组肺转移率明显降低(P＜0.01);对于各组移植瘤组织中,肺岩宁治疗组及化疗阳性对照组的移植瘤组织中E-cadherin、α-catenin及β-catenin均较模型组升高(P＜0.01);模型组肺组织中E-cadherin、α-catenin、β-catenin表达明显低于正常肺组织中的表达(P<0.05),而经过肺岩宁方治疗后,三个标志因子均有显著升高(P<0.05或P<0.01).结论 肺岩宁方具有上调上皮细胞标志因子的作用,其可能通过抑制上皮-间质细胞转化过程的发生而达到抗肿瘤转移的作用.     

温阳活血利水方含药血清对嘌呤霉素损伤小鼠永生系足细胞组织蛋白酶L表达的影响

目的观察温阳活血利水方含药血清对嘌呤霉素损伤的小鼠永生系足细胞组织蛋白酶L(Cathepsin L,CatL)表达的影响。方法体外培养小鼠永生系足细胞,将其分为正常对照组、模型组、地塞米松组、10%温阳活血利水方血清组(简称10%中药血清组)、20%中药血清组及中药血清空白对照组。正常对照组以培养液孵育足细胞24 h,模型组应用嘌呤霉素45 mg/L作用于足细胞24 h;在模型组干预基础上,地塞米松组加用地塞米松1μmol/L共孵育24 h;10%及20%中药血清组分别加用10%及20%的中药血清共孵育24h,并设中药血清空白对照组(单用中药血清孵育24 h)。采用细胞免疫荧光染色观察各组足细胞CatL及其底物Synaptopodin荧光表达改变;异硫氰酸荧光素(FITC)-鬼笔毒环肽(phalloidin)染色标记足细胞纤维肌动蛋白(F-actin),并采用F-actin外周环评分(cortical F-actin score,CFS)半定量分析足细胞F-actin分布。结果与正常对照组比较,模型组足细胞Synaptopodin表达水平明显降低,CatL表达水平升高,F-actin排列紊乱,逐渐向细胞外周分布形成F-actin环,CFS评分明显升高(P0.01)。与模型组比较,地塞米松组、10%、20%中药血清组足细胞Synaptopodin蛋白表达升高,CatL表达水平降低,CFS评分亦降低(P0.05,P0.01)。与地塞米松组比较,10%中药血清组Synaptopodin表达降低(P0.05),20%中药血清组CFS评分明显降低(P0.05)。结论温阳活血利水方能上调嘌呤霉素损伤的足细胞Synaptopodin表达,下调CatL表达水平,减少骨架蛋白F-actin的重构,有助于稳定足细胞actin骨架,改善足细胞融合。     

四逆散含药血清对皮质酮损伤PC12细胞钙敏感受体相关作用机制研究北大核心CSCD

目的探讨四逆散对皮质酮诱导PC12细胞损伤的干预作用是否与钙敏感受体(CaSR)以及细胞凋亡密切相关。方法以四逆散含药血清为干预药物,将PC12细胞分为空白血清组、皮质酮组、2.5%、5%、10%含药血清组,MTT法检测细胞存活率。通过AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法、蛋白免疫印迹技术对细胞凋亡率以及C-Caspase3、C-Caspase9、Bax(6A7)、细胞Cytochrome C蛋白进行检测。通过AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法检测四逆散含药血清联合CaSR激动剂(GdCl3)或CaSR抑制剂(NPS2390)各组细胞的凋亡率。结果与空白血清组比较,皮质酮组存活率、CaSR蛋白表达量降低(P<0.01,P<0.05);皮质酮组凋亡率、C-Caspase3、C-Caspase9、Bax(6A7)以及胞浆Cytochrome C蛋白表达量增加(P<0.01,P<0.05)。与皮质酮组比较,含药血清组存活率增加(P<0.01),5%、10%含药血清组CaSR蛋白表达量及皮质酮+NPS2390组凋亡率增加(P<0.01,P<0.05);含药血清组、皮质酮+GdCl3组凋亡率降低(P<0.01)和10%含药血清组C-Caspase3、C-Caspase9、Bax(6A7)、胞浆Cytochrome C蛋白表达量降低(P<0.01)。与皮质酮+10%含药血清组比较,皮质酮+10%含药血清+NPS2390组凋亡率增加(P<0.01)。与皮质酮+GdCl3组比较,皮质酮+10%含药血清+GdCl3组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论四逆散含药血清可以抑制皮质酮诱导的PC12细胞凋亡,其作用机制与CaSR有关。     

冠心止痛胶囊阻断MAPK信号通路改善棕榈酸诱导血管内皮细胞损伤的研究

为了研究冠心止痛胶囊(GXZT)对血管内皮细胞脂毒性损伤的影响,探索GXZT防治动脉粥样硬化可能的作用机制,该实验用棕榈酸(palmitic acid, PA)刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)复制脂毒性损伤模型,将细胞分为正常对照组(NC,15%正常血清)、模型组(PA,0.6 mmol·L~(-1) PA+15%正常血清)、GXZT高剂量组(GXZT-H,0.6 mmol·L~(-1) PA+15%GXZT血清)、中剂量组(GXZT-M,0.6 mmol·L~(-1) PA+10%GXZT血清+5%正常血清)和低剂量组(GXZT-L,0.6 mmol·L~(-1) PA+5%GXZT血清+10%正常血清)。用CCK-8法检测不同组HUVEC的细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,JC-1荧光探针标记后用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP),Western blot检测丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路关键蛋白p38、ERK1/2、JNK1/2总蛋白和磷酸化蛋白表达,并计算蛋白的磷酸化水平。实验结果显示,与NC组相比,PA组的细胞活力和MMP显著降低(P0.01,P0.01),细胞凋亡率显著增加(P0.01),MAPK信号通路p38、ERK1/2、JNK1/2的磷酸化水平显著增加(P0.01,P0.01,P0.01)。与PA组相比,GXZT-H、GXZT-M、GXZT-L的细胞活力和MMP均显著升高(P0.01,P0.01,P0.01),细胞凋亡率显著降低(P0.01),p38、ERK1/2、JNK1/2 MAPK信号通路的磷酸化蛋白表达减少,磷酸化水平显著降低(P0.01,P0.01,P0.01)。综上所述,GXZT 3个剂量组均可改善PA诱导的HUVEC脂毒性损伤,其机制可能是通过阻断MAPK信号通路减少内皮细胞凋亡而发挥作用。     

大黄虫丸对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响

目的从细胞增殖和凋亡角度探讨大黄虫丸治疗慢性粒细胞白血病的可能机理。方法 16只裸鼠随机分为空白组和中药高、中、低剂量组,每组4只。中药高、中、低剂量组分别给予浓度为1.97、0.9、0.45 g/ml的大黄虫丸溶液灌胃,每组0.2 ml/(10 g·d),每日1次,连续7天,空白组给予等量生理盐水。停药次日,分离血清制备大黄虫丸含药血清。应用MTT法检测大黄虫丸含药血清对慢性粒细胞白血病系K562细胞增殖的影响,细胞克隆形成实验检测对细胞克隆形成的影响,用Annexin V FITC/PI法检测对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果中药高剂量组在72 h时生长抑制率明显高于中药中、低剂量组(P0.01)。中药各剂量组克隆形成率较空白组明显下降(P0.01),中药中、高剂量组克隆形成率明显低于中药低剂量组(P0.01)。中药高剂量组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及合计凋亡率均较中药低、中剂量组升高明显(P0.05或P0.01)。中药低、中、高剂量组G0/G1期细胞显著高于空白组,G2/M期细胞下降(P0.01),并且以中药高剂量组明显。结论大黄虫丸能抑制K562细胞增殖和诱导其凋亡,将其阻滞于G0/G1期,并且高剂量的大黄虫丸效果最好。     

真武汤抗大鼠心肌细胞凋亡机制的体外实验研究

目的:通过真武汤抗大鼠心肌细胞凋亡机制的体外实验研究,阐述真武汤抗心肌细胞凋亡的具体机制。方法:(1)采用MTT法分别观察于3 h、6 h、12 h三个时间点异丙肾上腺素对心肌细胞活性的影响,测定细胞存活率,选择建立体外心肌细胞损伤模型所需异丙肾上腺素的最佳时间及剂量;(2)筛选真武汤含药血清的最佳浓度;(3)实验分为模型对照组[异丙肾上腺素(10~6 mol/L)]、空白对照组、真武汤组(异丙肾上腺素+10%含药血清)、卡托普利组[异丙肾上腺素+卡托普利(10-6mol/L)];(4)AO/EB双重荧光染色和流式细胞仪检测心肌细胞凋亡;(5)Western blotting方法测定培养心肌细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。结果:(1)异丙肾上腺素对心肌细胞的生长有抑制作用;异丙肾上腺素10μmol/L作用6h后,细胞存活率降低明显。(2)真武汤含药血清浓度的选择:各组心肌细胞与相应干预措施作用48h后,各干预组细胞活性均低于空白组,差异有统计学意义(P0.05);卡托普利组及不同浓度含药血清组细胞活性均高于异丙肾上腺素组(P0.05);20%含药血清组、10%含药血清组与卡托普利组相比细胞存活率相似,差异无统计学意义,但考虑到中药的细胞毒作用及成本,选择10%含药血清组进行后续实验。(3)AO/EB双重荧光染色检测细胞凋亡:与空白组比较,真武汤组及西药组可见明显抑制心肌细胞凋亡。(4)流式细胞仪检测心肌细胞凋亡:模型对照组细胞凋亡率明显升高,与空白对照组比较有显著差异(P0.01);卡托普利组及真武汤组与模型对照组相比细胞凋亡明显降低,有统计学差异(P0.05)。(5)Western Blotting检测结果:真武汤组和卡托普利组与模型对照组相比较,Caspase-3蛋白表达降低(P0.05)。结论:真武汤能降低心肌细胞损伤,抑制心肌细胞凋亡,其机制可能与调节Caspase-3蛋白表达有关。     

玉屏风散及过敏煎合止嗽散对PM2.5致Th17/Treg失衡诱发肺损伤大鼠的影响

目的观察PM2.5致辅助性T细胞17(TH17)与调节性T细胞(Treg)失衡诱发的大鼠肺损伤及不同中药治法的干预作用。方法将SPF级雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、中药1组和中药2组。采用气道滴注方法建立PM2.5致肺损伤模型,模型组和正常组予生理盐水灌胃,中药1组和及中药2组分别予玉屏风散及过敏煎合止嗽散灌胃。ELISA检测各组肺泡灌洗液(BALF)及血清白细胞介素(IL)-17、IL-10、IL-8、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、黏蛋白(MUC)5AC含量;免疫组化检测肺组织Foxp3、IL-17的表达。结果与正常组比较,模型组血清和BALF IL-8、IL-17、NE、MUCAC含量显著升高,IL-10含量明显降低(P0.05,P0.01),肺组织IL-17蛋白表达明显增加、Foxp3蛋白表达明显降低(P0.01);与模型组比较,中药1组及中药2组血清和BALF IL-8、IL-17、NE含量明显降低,BALF IL-10明显升高,中药2组血清IL-10明显升高(P0.05),肺组织IL-17蛋白表达明显降低、Foxp3蛋白表达明显增加(P0.01),病理学变化明显改善。结论 PM2.5可通过引起Th17/Treg失衡诱发肺损伤,玉屏风散及过敏煎合止嗽散均可明显改善PM2.5致大鼠肺组织病理损害,并可改善PM2.5导致的TH17/Treg失衡。     

中药肺岩宁颗粒调节晚期肺癌患者Th17/Treg失衡的作用

目的:评估肺岩宁颗粒调节非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血Th17/Treg失衡的作用及Th17/Treg在疗效评价中的意义。方法:选择我院收治的60例NSCLC患者,随机分为治疗组(n=30)和对照组(n=30),同时20例健康志愿者作为健康对照组,治疗组患者口服肺岩宁颗粒治疗,对照组口服1/10剂量的"肺岩宁颗粒"进行模拟治疗,健康对照组服用生理盐水,疗程为8周。比较两组患者近期的疗效,同时以Treg细胞、Th17细胞和Th17/Treg比值为检测指标,评价肺岩宁颗粒的治疗作用和对免疫功能的调节作用。结果:治疗组有效率和疾病控制率均高于对照组。治疗前,两组外周血Treg细胞比例、Th17细胞比例和Th17/Treg比值差异均无统计学意义(P0.05);治疗后与对照组比较,治疗组外周血Treg细胞比例明显降低(P0.01),而Th17细胞比例和Th17/Treg比值明显升高(P0.01)。此外,在经治疗后,无淋巴结转移的NSCLC患者Treg细胞比例显著低于出现淋巴结转移的NSCLC患者(P0.05),而Th17细胞比例和Th17/Treg比值高于出现淋巴结转移的NSCLC患者(P0.05)。鳞癌患者外周血中Treg细胞比例明显低于腺癌患者,而Th17细胞比例和Th17/Treg比例明显高于腺癌患者,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:肺岩宁颗粒对非小细胞肺癌具有一定的疗效,其作用机制与调节Treg细胞/Th17细胞比例失衡有关,并且对无淋巴结转移和鳞癌患者的治疗更为有效。Th17/Treg细胞检测可作为非小细胞肺癌疗效观察的重要客观指标。     

加味宫外孕Ⅰ号方含药血清对体外培养的输卵管妊娠滋养细胞凋亡率和细胞周期的影响

目的:运用血清药理学方法,观察加味宫外孕Ⅰ号方含药血清对体外培养的输卵管妊娠滋养细胞凋亡率和细胞周期的影响。方法:根据血清药理学的方法,用SD大鼠制备中药组(加味宫外孕Ⅰ号方含药血清),西药组(甲氨蝶呤含药血清)和对照组(正常血清),分别加入体外培养的滋养细胞培养体系中。培养72 h后,流式细胞法测定3组的细胞凋亡率和细胞周期。结果:中药组与对照组相比,滋养细胞凋亡率显著上升(P0.01),细胞周期发生阻滞,G0/G1期细胞百分比显著增多(P0.01);中药组与西药组相比,差异均无统计学意义(P0.05)。结论:加味宫外孕Ⅰ号方诱导滋养细胞凋亡,改变细胞周期进程可能是其发挥杀胚效应的机制之一。     

健脾补土组方对体外神经元缺氧损伤后的凋亡情况及INT、ILK、FAK表达的影响

目的:观察健脾补土组方对新生SD鼠神经元体外培养缺氧造模后的凋亡情况以及INT、ILK、FAK表达的影响,探讨其减少神经元凋亡的作用机制。方法:原代分离培养新生SD鼠神经元,接种于六孔板中,并分为正常血清对照组、正常血清+低氧组、低氧+正常血清+神经生长因子组、低氧+健脾补土组方含药血清组、低氧+健脾补土组方含药血清+整合素抗体组。将标本放入37℃三气培养箱中,诱导24 h后,恢复正常条件培养4h。用流式细胞术检测检测神经元凋亡,RT-qPCR法检测INT、ILK、FAK mRNA的表达,用免疫细胞化学法和Western blot法检测INT、ILK、FAK蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,其余各组神经元凋亡率均显著增加(P0.01),INT、ILK、FAK mRNA及蛋白表达显著减少(P0.01);与低氧模型组比较,健脾补土组INT、ILK、FAK mRNA及蛋白表达显著增强(P0.01)。结论:健脾补土组方能够减少缺氧损伤后神经元细胞凋亡,其作用机制可能与其通过上调INT、ILK、FAK表达有关。     

糖痹康对高糖培养雪旺细胞自噬相关蛋白的影响

目的:研究发现细胞自噬是糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)的重要发病机制之一,本研究探讨治疗DPN的中药复方糖痹康(Tangbikang,TBK)对高糖环境下大鼠雪旺细胞(rat Schwann cells,RSC)自噬相关蛋白的影响。方法:利用SD大鼠制备TBK含药血清,并采用50 mmol·L~(-1)的葡糖糖(Glu)RSC细胞培养基制备高糖RSC细胞模型。实验总共分为6组:正常组(Con,20%正常大鼠血清),高糖组(Glu,50 mmol·L~(-1)Glu+20%正常大鼠血清);弥可保组(MKB,50 mmol·L~(-1)Glu+20%弥可保含药血清);TBK高剂量组(TBKH,50 mmol·L~(-1)Glu+20%TBK含药血清);TBK中剂量组(TBKM,50 mmol·L~(-1)Glu+10%TBK含药血清+10%正常大鼠血清);TBK低剂量组(TBKL,50 mmol·L~(-1)Glu+2.5%TBK含药血清+17.5%正常大鼠血清)。干预48 h后,采用细胞增殖实验细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测RSC细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬蛋白(Beclin 1)和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)的表达水平。结果:与Con组比较,高糖因素使得Glu组RSC增殖活性显著降低(P0.01),细胞凋亡率显著增加(P0.01),且自噬相关标志蛋白Beclin 1和LC3Ⅱ显著下降(P0.01);与Glu组比较,MKB组与TBKH组RSC细胞增殖显著减弱(P0.01),MKB组,TBKH和TBKM组RSC细胞凋亡率显著减小(P0.01),MKB组和TBKH组RSC细胞自噬标志蛋白Beclin 1和LC3Ⅱ的表达水平显著升高(P0.01)。结论:TBK能够促进高糖环境下RSC细胞自噬,减少凋亡,具有一定的神经保护作用,该研究为DPN新药研发奠定基础。     

复方参鹿颗粒含药血清对较低危骨髓增生异常综合征p38MAPK磷酸化的抑制作用

目的观察复方参鹿颗粒(CSG)含药血清对较低危骨髓增生异常综合征(lower-risk MDS)骨髓单个核细胞(BMMNC)p38MAPK磷酸化、CD34~+细胞凋亡和正常造血干/祖细胞集落(CFU-HSPC)形成的影响。方法 16只清洁级Wistar大鼠,随机分为空白血清组、CSG组,每组8只,制备空白血清和CSG含药血清。体外骨髓细胞培养分为空白血清组、CSG组、SB203580组和SB202474组。分离lower-risk MDS患者BMMNC,与10%各组血清或p38抑制剂共培养,Annexin V/PI双染流式细胞术检测CD34~+细胞凋亡率, Western Blot检测p38、p-p38蛋白表达。MACS分离骨髓CD34~+细胞,用半固体甲基纤维素与10%各组血清或p38抑制剂共培养,观察CFU-HSPC形成,FISH检测集落中异常克隆细胞群体的比例。结果与空白血清和SB202474组比较,CSG、SB203580组的凋亡率、p-p38蛋白表达减少(P0.05);CFU-HSPC形成数增加(P0.01);形成的集落中异常克隆细胞比例降低(P0.05)。CSG和SB203580组的p-p38蛋白表达和异常克隆细胞比例呈正相关(P0.01)。结论 CSG含药血清能改善lower-risk MDS骨髓无效造血,其机制可能与抑制p38蛋白磷酸化,减少骨髓CD34~+细胞凋亡,并恢复骨髓正常造血细胞的优势生长有关。     

肾复康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞HK-2纤维化模型的影响及其机制研究

目的:探讨肾复康含药血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞株HK-2间质转化的影响及其分子机制。方法:以HK-2细胞作为研究对象,常规培养后将细胞进行如下分组及刺激处理:空白对照组、模型对照组(10 ng/ml TGF-β1刺激)、32 g/kg尿毒清30%含药血清组(30%尿毒清含药血清+TGF-β1刺激)、18.32 g/kg肾复康10%、30%含药血清组(10%或30%肾复康含药血清+TGF-β1刺激)。MTT法检测肾复康含药血清对HK-2细胞活力的影响;显微镜下观察各组细胞间形态学的差异;ELISA法检测各组细胞上清液中I型胶原(collagen I)和纤维连接蛋白(fibronectin)的水平;q-PCR法检测各组细胞内E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形纤维蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和整联蛋白连接激酶(ILK)基因的表达水平;蛋白免疫印迹法检测Smad2/3总蛋白、核蛋白表达及其磷酸化水平;蛋白免疫印迹法检测下游的ILK蛋白表达水平。结果:肾复康含药血清对HK-2细胞的存活率无抑制作用;与空白对照组比较,模型对照组细胞形态由上皮样的铺路石状变成间质样的长梭形,E-cadherin的mRNA水平显著下调(P0.01),Vimentin、α-SMA和ILK的mRNA水平显著上调(P0.01),Smad2/3的蛋白磷酸化及核内水平显著上调(P0.01);与模型对照组比较,肾复康各含药血清组E-cadherin的mRNA水平显著上调(P0.01),Vimentin、α-SMA和ILK的mRNA水平显著下调(P0.05或P0.01),Smad2/3的蛋白磷酸化及核内水平明显下调(P0.05或P0.01)。结论:肾复康能逆转TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞HK-2纤维化模型的上皮间质转化,其作用机制可能与其抑制胞内Smad2/3-ILK信号通路的活化有关。     

肺岩宁方调控TGF-β介导的骨转移相关PTHrP/RANKL信号通路抗肺癌侵袭转移

目的:探讨肺岩宁方通过调控转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)介导的骨转移相关甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)/NF-κB受体活化因子配体(receptor or activator of NF-κB ligand,RANKL)信号通路抗肺癌细胞侵袭转移的作用机制。方法:体外培养A549肺癌细胞,用不同终浓度肺岩宁方进行处理,未加肺岩宁方为空白组。分别采用cell counting kit-8(CCK-8)检测肺岩宁方对A549细胞增殖抑制作用,计算半数浓度抑制率(IC50);采用转移小室(transwell)侵袭实验、划痕实验检测肺岩宁方对A549细胞体外侵袭及迁移的抑制作用;以及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TGF-β,PTHrP,RANKL蛋白表达。结果:肺岩宁方作用于A549肺癌细胞48 h后,与空白组相比,肺岩宁方(12.5,25,50 mg·L~(-1))组穿膜细胞明显减少(P0.05,P0.01);肺岩宁方(12.5,25,50 mg·L~(-1))组的划痕距离较空白组明显降低(P0.05,P0.01);且肺岩宁方(25,50 mg·L~(-1))组作用于A549细胞后,TGF-β蛋白表达明显下调(P0.05),其对应下游靶基因PTHrP及RANKL蛋白也发生明显表达下调(P0.05)。结论:肺岩宁方可抑制A549肺癌细胞的侵袭迁移能力,直接下调TGF-β基因及其下游靶基因PTHrP,RANKL蛋白表达,且具有浓度相关性。本研究证实了肺岩宁方通过调控TGF-β介导的骨转移相关PTHrP/RANKL信号通路,以达到抗肺癌侵袭转移的作用机制,这为肺癌临床靶向治疗提供了一定的实验依据,也显示了肺岩宁方作为抗肺癌侵袭转移药物广泛的应用前景。     

肺岩宁方对A549裸鼠移植瘤VEGF与HIF-1α表达的影响

目的 观察肺岩宁方对A549裸鼠移植瘤的抑制作用及对VEGF、HIF-1α表达的影响.方法 将A549荷瘤鼠随机分为4组:模型组、化疗组、肺岩宁方组和综合治疗组,化疗组和综合治疗组DDP0.1mg腹腔注射3 d,肺岩宁方组和综合治疗组中药灌胃21 d.观察抑瘤率,RT-PCR和免疫组化法检测移植瘤VEGF和HIF-1α表达.结果 肺岩宁方组抑瘤率为34.17%,低于模型组(P＜0.05):RT-PCR结果显示,综合治疗组、肺岩宁方组和化疗组的VEGF mRNA的表达明显低于模型组(P＜0.05,P＜0.01);综合治疗组HIF-1α mRNA的表达水平低于模型组(P＜0.05),其余各组无显著差异.VEGF、HIF-1α光密度指数化疗组、肺岩宁方组和综合治疗组均明显低于模型组(P＜0.01).结论 益气养精法为主的肺岩宁方有一定的抑制肺癌生长的作用,且与顺铂有协同作用,肺岩宁方可能通过对HIF-1α的抑制,达到对VEGF的表达调控,从而抑制血管生成,控制肿瘤生长.     

寿胎丸含药血清对自然流产患者滋养层细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的探讨寿胎丸防治自然流产的可能作用机制。方法体外分离培养自然流产患者滋养层细胞,并用不同浓度(5%、10%、20%)寿胎丸含药血清干预24h(寿胎丸含药血清组),并以空白血清及地屈孕酮含药血清分别作为空白对照(空白血清组)及阳性对照(地屈孕酮含药血清组),每个浓度3个复孔。检测各组不同药物浓度血清干预后滋养层细胞总凋亡比例及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果与空白血清组比较,寿胎丸含药血清组和地屈孕酮含药血清组各浓度药物血清干预后能降低滋养层细胞总凋亡比例,上调Bcl-2蛋白水平,在浓度为10%和20%的药物血清干预后下调Bax蛋白水平(P0.05),并且呈一定的剂量依赖性(P0.05)。结论寿胎丸含药血清呈剂量依赖性减少自然流产患者滋养层细胞凋亡,可能与上调Bcl-2蛋白、下调Bax蛋白有关。