茉莉酸甲酯对丹参毛状根中丹参酮类成分积累和释放的影响

目的：研究茉莉酸甲酯(methy jasmonat,MJ)对丹参酮类成分的积累和向培养基中的释放的影响。方法：6-7V 悬浮振荡培养ATCC15834 农杆菌诱导的丹参毛状根培养18 d后,液体培养基中加入化学诱导子——茉莉酸甲酯,采用HPLC 的方法,测定MJ处理后不同时间段(2,6,9 d)丹参毛状根中隐丹参酮、丹参酮II_A 的含量以及其在培养基中的含量。结果：毛状根经MJ处理后2,6,9 d隐丹参酮的含量分别达0.039,0.204,0.572 mg·g^-1,分别是同时期未经MJ处理的2.2,8.5,23.8倍；丹参酮IIA的含量达0.251,0.601,1.563 mg·g^-1,分别是同时间期未经MJ处理丹参毛状根的1.9,4.1,6.2倍。结论：MJ能显著促进丹参毛状根中丹参酮类成分的积累并向培养基中释放。     

基于茉莉酸甲酯诱导的丹参毛状根酚酸类成分次生代谢机制研究

目的:研究外源茉莉酸甲酯诱导后丹参毛状根中酚酸类有效成分形成的次生代谢分子机制.方法:用茉莉酸甲酯(MJ,100μmol·L-1)对丹参毛状根进行诱导实验,分别在0,6,12,24,36h收获材料,运用实时定量PCR对丹参中迷迭香酸次生代谢途径上的关键酶基因的mRNA表达水平进行检测.同时,采用LC-MS测定各个时间点毛状根材料中迷迭香酸(RA)、丹酚酸B(LAB)及咖啡酸(CA)的含量.结果与结论:外源性信号分子MJ作用于丹参毛状根,酚酸类成分迅速积累,表现为CA,RA均在诱导后24h达到最大值,LAB的含量36h后达到最高.其诱导机制可能与不同程度的激活RA合成中苯丙氨酸途径上关键酶基因PAL,4CL,C4H与酪氨酸途径中TAT,HPPR基因的表达有关,基因表达在时间呈现先后性,其中,4CL与PAL的贡献度较大.这为今后更深一步的研究丹参水溶性酚酸类成分的次生代谢途径机制提供了依据.     

赤霉素及其合成抑制剂对丹参酮类活性物质含量的影响

目的研究赤霉素及其合成抑制剂对丹参毛状根中丹参酮类活性物质含量的影响.方法分别将不同浓度的赤霉素和多效唑加入到丹参毛状根的液体培养基中,培养25 d后对毛状根中的隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ.含量进行测定.结果赤霉素可以促进丹参毛状根中丹参酮类活性物质的积累,而多效唑则抑制了它们的积累.结论推测多效唑是丹参毛状根中丹参酮ⅡA等化合物的合成抑制剂,且赤霉素可以作为一种有效的丹参酮类活性成分的诱导子.     

ABA及其生物合成抑制剂对丹参毛状根酚酸类成分和关键酶的影响

目的:研究脱落酸(ABA)及其生物合成抑制剂氟啶酮(fluridone),对丹参毛状根酚酸类成分和关键酶的影响。方法:继代培养18 d的丹参毛状根添加不同浓度的ABA及ABA与氟啶酮组合,处理1 d后测定关键酶PAL和TAT活性;处理6 d后测定不同处理的丹参毛状根中酚酸类物质的含量。结果:在一定浓度范围内,低浓度的ABA促进丹参毛状根的生长,高浓度的ABA抑制丹参毛状根的生长;ABA显著促进酚酸类物质的积累,对咖啡酸的诱导表现出正相关,但是迷迭香酸和丹酚酸B的效果,表现出在低浓度效果较好,随浓度增大,诱导效果降低,直到ABA浓度至200μmol.L-1,含量开始上升;当ABA与氟啶酮组合处理时,氟啶酮抑制ABA对丹参毛状根酚酸类的积累,但是有差异;不同浓度的ABA会不同程度的提高PAL和TAT酶的活性,添加ABA生物合成抑制剂,酶活性诱导效果降低。结论:ABA能诱导丹参毛状根中酚酸类化合物积累,同时也能激活合成相关酶的活性;ABA生物合成抑制剂氟啶酮不同程度抑制ABA的诱导效果。     

不同氮源对丹参和藏丹参毛状根有效成分积累的影响

目的氮素是中药材有效成分积累的重要影响元素,为探讨不同氮源对丹参Salviamiltiorrhiza和藏丹参Salvia castanea毛状根生长和活性成分积累的影响。方法分别采用硝酸铵、水解乳蛋白、蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白和酵母提取物6种氮源处理对丹参和藏丹参毛状根的影响,分析毛状根生长及活性成分积累的变化。结果硝酸铵最有利于2种丹参毛状根的生长。水解乳蛋白能够显著促进丹酚酸类成分的积累,与硝酸铵对照相比,丹参迷迭香酸和丹酚酸B含量分别提高了2.94倍和3.27倍,藏丹参二者含量分别提高了13.74倍和2.01倍。酵母提取物对2种丹参毛状根二氢丹参酮Ι和隐丹参酮积累的促进效果最为显著,水解乳蛋白能显著促进丹参根中丹参酮IIA的积累,牛肉浸膏则对藏丹参中丹参酮IIA积累的促进作用最为显著。结论硝酸铵是2种丹参毛状根生长的最佳氮源,水解乳蛋白是丹酚酸积累的最佳氮源,不同氮源对4种丹参酮的影响不一致,丹参和藏丹参对不同氮源的响应也不一致。该研究不仅对丹参毛状根规模化培养及活性成分工业化生产具有一定指导意义,也对藏丹参资源的开发利用提供了借鉴作用。     

茉莉酸参与介导镧诱导丹参毛状根活性物质的积累

目的:验证氯化镧诱导丹参毛状根活性物质积累的信号分子。方法:采用HPLC法测定丹参毛状根中活性物质含量;采用"loss and gain"策略对信号分子进行验证。结果:茉莉酸甲酯对镧的响应规律与丹参毛状根中活性物质对镧元素响应规律相符且对丹参毛状根活性物质积累起促进作用;经茉莉酸甲酯淬灭剂和抑制剂处理验证发现,抑制剂和淬灭剂对丹参毛状根中活性物质积累起抑制作用,而抑制剂与氯化镧同时处理能逆转抑制剂对活性物质的抑制作用。结论:茉莉酸甲酯是氯化镧诱导丹参毛状根活性物质积累的信号分子,但不是唯一的信号分子。     

茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根中主要莨菪烷类生物碱成分积累和释放的影响

目的:研究茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MJ)对曼陀罗毛状根中主要次生代谢产物东莨菪碱和莨菪碱成分的积累和向培养基中的释放的影响.方法:1/2 MS液体培养C58C1农杆菌诱导的曼陀罗毛状根培养18 d后,液体培养基中加入化学诱导子——茉莉酸甲酯,采用HPLC测定MJ处理后不同浓度梯度及不同时间段(0,3,6,9,12 d)曼陀罗毛状根中东莨菪碱和莨菪碱的含量以及其在培养基中的含量.结果:曼陀罗毛状根经MJ处理后3,6,9,12 d的东莨菪碱的质量分数分别达0.419,0.439,0.431,0.374 mg·g-1,分别是同时期未经MJ处理的1.36,1.42,1.17,1.12倍;莨菪碱的质量分数达1.493,0.817,0.723,0.698 mg·g-1,分别是同时期未经MJ处理曼陀罗毛状根的2.28,1.11,0.63,0.70倍.结论:MJ能显著促进曼陀罗毛状根中东莨菪碱成分的积累并向培养基中释放;MJ能显著促进处理3d和6d后曼陀罗毛状根中莨菪碱成分的积累并向培养基中释放.     

不同元素对丹参毛状根生长及丹参酮类成分积累的影响

目的:研究不同浓度大量、微量、有机元素对丹参毛状根生长量及丹参酮类成分积累的影响。方法:以6,7-V液体培养基为基本培养基,分别将其大量、微量和有机元素的含量设定为缺失(0)、1/8、1/4、1(对照)、4、8倍,取培养相同时间的毛状根测定其增长倍数,利用HPLC法测定二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A的含量。结果:大量元素可显著影响丹参毛状根的生长和丹参酮类成分的积累,其中大量元素缺乏时可显著促进丹参酮类成分的积累,但其生长量受到明显抑制,而过量大量元素虽可在一定程度上提高生长量,但丹参酮类成分并无显著增长;微量元素和有机元素的改变对毛状根的生长和丹参酮类成分的积累无显著影响。结论:大量元素是影响丹参毛状根生长和丹参酮类成分积累的主要因素,大量元素缺乏(逆境)可显著促进丹参酮类成分积累,为毛状根培养及不同品质丹参形成机理研究提供了一定的基础。     

稀土元素镧对丹参活性物质积累及其合成途径中酶基因表达的影响

该文研究了镧对丹参毛状根中活性物质积累及其合成途径中酶基因表达的影响,为揭示土壤因子镧影响丹参药材品质形成的环境机制奠定基础。采用HPLC测定丹参毛状根中活性物质含量;采用Tiangen多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA,采用Takara反转录试剂盒合成c DNA,采用PCR荧光定量试剂盒进行实时定量分析,采用SPSS软件进行数据分析。结果显示镧处理对丹参毛状根内丹参酮类和酚酸类的积累表现出显著的促进效应,处理后9 d其酚酸类成分含量达到峰值,丹参酮类成分含量随处理时间的延长而增加(15 d内);镧处理后丹参体内活性物质积累的峰值时间相对滞后于酶基因表达的峰值时期,FPPS,TAT,HPPR 3个酶基因与丹参酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B含量变化趋势相似,暗示FPPS,TAT,HPPR 3个酶基因在镧诱导的丹参活性物质积累中发挥重要作用。     

活性氧在密旋链霉菌Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用

作者前期研究成果显示密旋链霉菌Act12可以上调丹参酮生物合成途径上的关键酶基因的表达大幅提高丹参毛状根中丹参酮含量。该实验则进一步研究了活性氧在Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累的作用。在继代培养21 d的丹参毛状根中添加Act12不同的诱导子及诱导子组合,分别测定不同收获期毛状根的生物量,毛状根中活性氧积累量,丹参酮类成分的积累量和关键酶基因表达量。Act12诱导后丹参毛状根中活性氧含量上升,HMGR和DXR基因表达上调,最高分别达到对照的32.4,4.8倍,毛状根中丹参酮积累增加,最高达到对照的10.2倍;加入活性氧抑制剂CAT和SOD后,丹参毛状根中的活性氧含量较Act12处理显著下降,HMGR和DXR基因表达也明显下降,毛状根中丹参酮含量较Act12处理下降了74.6%。活性氧介导了Act12诱导丹参酮积累,Act12很可能是通过ROS信号通路激活了MVA和MEP途径,从而提高了丹参酮在毛状根中的含量。     

外源施加生长素吲哚-3乙酸对丹参根系形态和有效成分积累的影响

目的研究不同质量浓度的生长素吲哚-3乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)及施加方式对丹参Salvia miltiorrhiza根系形态和有效成分积累的影响。方法 IAA设置0、5、10、20、30mg/L5个质量浓度,分别采用叶面喷施和根部浇灌的方法处理丹参植株,测定各处理组中丹参根系形态学指标及酚酸类成分和丹参酮类成分的含量。结果 IAA处理总体上促进了丹参侧根的发育和丹参酮类成分的积累。2种施加方式相比,叶面喷施更有利于酚酸类成分含量的提高。结论外源施加IAA对丹参根系发育和有效成分的合成积累均具有调控作用,进一步深入探究IAA对3个生理过程的作用机制具有重要的理论和实践意义。     

丹参类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)基因全长克隆及其生物信息学分析

根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆类贝壳杉烯氧化酶(Sm KOL)全长c DNA,并进行生物信息学分析;采用实时定量PCR检测茉莉酸甲酯(Me JA)诱导丹参毛状根不同时期的Sm KOL表达水平。克隆得到的Sm KOL全长c DNA由1 884个核苷酸组成,具有完整编码框,编码519个氨基酸,蛋白相对分子质量约为58.88 k Da,等电点p I 7.62;实时定量PCR结果表明该基因受Me JA诱导后,表达水平在36 h时达到最大值。从丹参毛状根中克隆得到1条Sm KOL全长c DNA,为进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制提供了靶基因。     

丹参2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)基因全长克隆及其生物信息学分析

目的:从丹参毛状根中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)全长基因,并进行生物信息学分析.方法:根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆SmMCS全长cDNA,并对SmMCS进行蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测Ag+诱导子诱导丹参毛状根不同时期的SmMCS基因转录水平.结果:克隆的SmMCS全长cDNA由988个核苷酸组成,具有完整编码框,编码234个氨基酸,蛋白相对分子质量约24.6 kDa,等电点pI 8.53;实时定量PCR结果表明该基因受Ag+诱导后表达水平在12 h时急剧上升并达到最高值.结论:从丹参毛状根中克降得到一条SmMCS全长cDNA,为进一步研究丹参酮类成分的生物合成和萜类次生代谢提供靶基因.     

茉莉酸甲酯对丹参毛状根中水溶性酚酸类化合物积累的影响

 目的 研究茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MJ）对丹参毛状根生长和其中丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B 3种化合物含量的影响。方法 以MJ浓度和添加时间为2个影响因素,设计5个水平的正交实验,观察不同MJ浓度和添加时间对丹参毛状根生长和丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B 3种化合物含量的影响。结果 MJ的加入对丹参毛状根生长有一定抑制作用,并能显著改变丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B的含量。在接种第15天添加浓度为300 μmol·L-1MJ、共培养15 d的毛状根中丹参素含量达（0.510±0.054）%,约为对照样品（0.179±0.02)%的2.85倍;接种第20天加入浓度为300 μmol·L-1MJ、共培养10 d的毛状根中迷迭香酸的含量达（14.358±0.710）%,约为对照样品（7.021±0.403）%的2倍;接种0天时添加200 μmol·L-1 MJ、共培养30 d的丹参毛状根中丹酚酸B的含量高达（1.592±0.120）%,约为对照样品（0.189±0.05）%的8.42倍。结论 茉莉酸甲酯能明显改变丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B在丹参毛状根中的积累,并且随MJ浓度和添加时间的改变呈现一定规律性,这对丹酚酸类化合物在植物体内生物合成途经的研究有一定借鉴意义。     

丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析

目的:建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系。方法:考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培养时间诱导丹参毛状根的效率,共培养外植体用400 g.L-1Cef水除菌5 min,接种在MS+400 g.L-1Cef+2.5 g.L-1Hyg的固体培养基上,完全除菌后转接入6,7-V+2.5 g.L-1Hyg液体培养基继代培养,GFP荧光检测阳性毛状根,PCR检测农杆菌特征基因rolC,并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮I的积累。结果:用丹参叶片基部诱导毛状根,成功率可达到93.3%;农杆菌侵染10 min诱导效率最高为63.3%;共培养2～3 d诱导效果最好;PCR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性;丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论:成功建立起丹参转基因毛状根离体培养体系,为进一步的基因工程应用打下基础。