丹酚酸B在大鼠骨髓间充质干细胞分化过程对心肌早期基因Nkx2.5 GATA-4 mRNA表达的影响

目的:探讨丹参单体丹酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrowmes-enchymal stem cells,MSCs)分化为心肌样细胞的情况及Nkx2.5、GATA-4 mRNA的表达,从而确定大鼠MSCs体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。方法:选用成年近交系Wistar大鼠,利用percoll分离液进行密度梯度离心法和直接贴壁法进行分离、提纯MSCs,并进行培养扩增。免疫组化方法对第9代MSCs表面抗原进行鉴定。分别应用10μmol/L5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)及250μg/L SalB联合5-aza(5-aza+SalB)对第9代的MSCs进行联合诱导24h,于诱导后第4周,用实时荧光定量RT-PCR法检测GATA-4和Nkx2.5基因表达。结果:①第9代MSCs免疫组化染色CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达。②诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。5-aza组、5-aza+SalB组均出现明确的心肌早期分化基因与5-aza组相比,5-aza+SalB组的NKx2.5、GA-TA-4 mRNA表达明显增加。结论:SalB具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用,并且在Nkx2.5基因表达上丹酚酸B的优势更加明显。     

复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞特异基因GATA-4的表达

目的:观察复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞特异基因的表达。方法:分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪鉴定细胞表面标记;采用复方丹参滴丸的含药血清体外定向诱导第4代MSCs,观察特异基因GATA-4的表达。结果:大鼠MSCs细胞表面抗原CD90、CD106阳性,CD34、CD45、CD31阴性。经含药血清、5-Aza体外诱导大鼠MSCs,细胞上清液中调节心肌发生的专有基因GATA-4的浓度有明显改变。结论:复方丹参滴丸可能有调控心肌发生的专有基因GATA-4的作用,启动细胞向心肌样细胞方向分化。     

三七总皂苷对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用

目的探讨三七总皂苷(PNS)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分化为心肌样细胞。方法采用骨髓细胞体外培养技术分离大鼠MSCs,用流式细胞仪检测细胞表面标志,用第8代MSCs进行体外心肌细胞诱导分化,采用相差显微镜、免疫组化及RT-PCR鉴定心肌细胞。结果大鼠MSCs细胞表面抗原CD44阳性,CD34阴性;经PNS体外诱导后细胞形态发生变化,其细胞免疫组化呈结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnI)阳性;RT-PCR显示诱导后细胞转录肌球蛋白重链mRNA水平增加。结论大鼠MSCs体外在PNS诱导下可分化为心肌样细胞,为应用MSCs治疗心肌损伤提供了动物实验方法。     

血府逐瘀汤含药血清体外诱导骨髓基质干细胞表达Desmin和α-actin的实验研究

目的 观察血府逐瘀汤含药血清能否诱导骨髓基质干细胞（MSCs）分化为心肌样细胞,以寻找安全有效诱导MSCs向心肌细胞分化的诱导剂。方法 采用血清药理学方法进行诱导,制备血府逐瘀汤大鼠含药血清,分离培养大鼠 MSCs,MTT法检测血清细胞毒性,选用生长良好的P3细胞进行实验,将实验细胞分为3组,即空白对照组、血府逐瘀汤大鼠含药血清诱导组、5－氮胞苷诱导组。免疫细胞化学染色法检测心肌结蛋白（Desmin）,α型心肌肌动蛋白（α-actin）的表达情况。结果 诱导前各组MSCs细胞Desmin和α-actin表达阴性,个别弱阳性;其弱阳性表达率各组比较差异无统计学意义（P>0.05）。诱导后空白对照组MSCs细胞Desmin和α-actin表达阴性,个别弱阳性;血府逐瘀汤含药血清组和5－氮胞苷体外培养诱导组,MSCs细胞Desmin和α-actin表达阳性,其阳性表达率与空白对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 血府逐瘀汤含药血清具有体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为心肌样细胞的趋势,其作用可能参与了Desmin和α-actin的表达。     

复方丹参滴丸干预骨髓间充质干细胞移植后心肌再生的实验研究

目的探讨复方丹参滴丸（CDDP）对骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗急性心肌梗死（AMI）的干预作用,初步探讨活血化瘀类中药对MSCs移植后分化成活的影响,为中药干预MSCs移植治疗AMI提供动物实验基础。方法体外分离、纯化、培养鉴定SD雄性大鼠MSCs,选用3～4代MSCs,梗死区多点位注射,移植于心梗模型大鼠体内。移植前用CM-DiL对MSCs进行标记,并观察移植4周后,MSCs在宿主梗死边缘区的分化成活情况,免疫荧光标记法检测宿主冰冻切片组织中连接蛋白CX43的表达,氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色,测定MI面积。结果流式细胞鉴定培养细胞表达CD90、CD106,不表达CD34、CD45、CD31表面抗原;术后4周,荧光显微镜下观察心肌组织冰冻切片,看到被红色CM-DiL标记的植入细胞并在同一视野看到了相应的CX-43阳性表达,MSCs移植＋CDDP组CX-43阳性表达理想;MI面积测定结果显示,MSCs移植＋G-CSF组、MSCs移植＋CDDP组、MSCs移植组与模型组比较,差异有显著性（P〈0.01）;MSCs移植＋G-CSF组、MSCs移植＋CDDP组与MSCs移植组比较差异有显著性（P〈0.05）,两组之间无显著性差异（P〉0.05）。结论CDDP可能通过多靶点诱导干预大鼠AMI后植入干细胞的成活以及向心肌样细胞的分化,能显著减小梗死面积。     

黄芪甲苷联合5-氮胞苷诱导MSCs分化为心肌样细胞的实验研究

目的探讨黄芪甲苷(AST)与5-氮胞苷(5-aza)联合应用对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的影响。方法采用贴壁培养法分离大鼠MSCs,流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD34和CD44。分组诱导培养4周:I组(空白对照组)、II组(100 mg/L AST+5μmol/L 5-aza)、III组(10μmol/L 5-aza)、IV组(5μmol/L 5-aza)。利用免疫荧光法对诱导后细胞进行鉴定,观察心肌特异性结构蛋白cTnT、Desmin的表达,计算诱导分化率。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测诱导后MSCs中心钠素(ANP)mRNA的表达水平;以ELISA法检测诱导后细胞内环磷酸腺苷(cAMP)的水平。结果大鼠MSCs细胞表面抗原CD34阴性,CD44阳性;药物诱导后细胞形态发生显著变化,AST联合5-aza诱导能高效表达心肌特异性蛋白cTnT、Desmin,诱导分化率别为8.33%,18.00%。提高ANP mRNA的表达水平,亦能显著增加诱导后细胞内cAMP的含量。其作用效果与5μmol/L 5-aza诱导组比较,具有显著性差异(P<0.05或P<0.01),与10μmol/L 5-aza诱导组作用效果相当(P>0.05)。结论黄芪甲苷联合5-氮胞苷能在体外成功诱导MSCs分化为心肌样细胞,可使5-aza最佳诱导浓度从10μmol/L降至5μmol/L,而诱导效果不变。AST联合5-aza诱导后细胞与正常心肌细胞不仅形似,更具备相似的生理功能。     

丹酚酸B对大鼠骨髓间充质干细胞分化过程中Desmin、α-actinmRNA表达的影响

[目的]探讨丹参单体丹酚酸B(SalB)在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的情况及Desmin和α-actin mRNA的表达,确定大鼠MSCs体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点.[方法]选用成年近交系Wistar大鼠,利用percoll分离液进行密度梯度离心法和直接贴壁法进行分离、提纯MSCs,并进行培养扩增.免疫组化方法对第9代MSCs表面抗原进行鉴定.分别应用10μmol/L5-氮胞苷(5-azaeytidine,5-aza)及250μg/L SalB联合5-aza(5-aza+SalB)对第9代的MSCs进行联合诱导24 h,于诱导后第4周,用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PcR)法检测Desmin、α-actin mRNA的表达.[结果] 1)第9代MSCs免疫组化染色CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达.2)诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构.5-aza组、5-aza+SalB组均出现明确的心肌早期分化基因与5-aza组相比,5-aza+SalB组的Desmin和α-actin mRNA表达明显增强.[结论] SalB具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用.     

黄芪注射液预处理对大鼠骨髓间充质干细胞定向分化的诱导作用研究

目的:研究黄芪注射液预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的定向诱导作用.方法:在无菌条件下从成年大鼠胫骨骨髓分离出MSCs,以1:3的比例传代,取第3代的细胞,接种后随机将MSCs分为5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导分化组、黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组及对照组,用相差显微镜观察各组细胞形态变化;免疫细胞化学鉴定MSCs表面标志物及心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ.结果:培养后的细胞表面CD44表达阳性;黄芪注射液诱导组、5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导分化组、黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组诱导后的细胞形态发生改变,细胞之间形成连接,排列方向趋于一致,免疫组化检测结果显示肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)表达均阳性,黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组表达相对更强,与其他组相比有显著差异.结论:黄芪注射液可体外诱导MSCs分化为心肌样细胞,采用黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化的方式相对其他的方法更具优势.     

黄芪含药血清诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的:探索黄芪含药血清诱导骨髓间充质干细胞(MSC)分化为心肌样细胞的作用。方法:采用日本大耳白兔制备黄芪含药血清,分离SD大鼠MSC进行传代培养。用黄芪含药血清和5-Aza进行诱导分化,免疫组化法检测诱导后细胞心肌肌钙蛋白、结蛋白表达,RT-PCR反应测定α-MHC和β-MHC表达。结果:诱导后细胞心肌肌钙蛋白、结蛋白表达阳性,并可以表达心肌特异性的肌球蛋白。结论:黄芪含药血清可诱导MSC分化为心肌样细胞。     

养心通脉有效部位方对MSCs向心肌样细胞分化的影响

目的观察养心通脉有效部位方对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分化为心肌样细胞的诱导作用。方法体外培养大鼠MSCs,设养心通脉有效部位方(YTF)组、5-氮胞苷(5-aza)阳性对照组和低糖DMEM组,体外诱导分化心肌样细胞;用免疫细胞化学方法观测其心肌肌丝蛋白(Desmin)、肌球蛋白重链(MHC)的表达,用RT-PCR的方法检测心肌转录因子GATA-4 mRNA的表达。结果大鼠MSCs体外向心肌样细胞分化诱导后,在DMEM组中未发现Desmin和MHC阳性细胞;而YTF组和5-aza组的Desmin及MHC免疫组化染色均可见阳性免疫复合物,与DMEM组比较,YTF组和5-aza组Desmin、MHC、GATA-4 mRNA表达的相对光密度(IOD)值均明显提高(P<0.01,P<0.05),而且YTF组Desmin、MHC的IOD也明显高于5-aza组(P<0.05),但YTF组GATA-4 mRNA的IOD值与5-aza组比较无统计学差异。结论 YTF在体外可诱导MSCs向心肌样细胞分化。     

强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

目的观察强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外增殖的影响。方法使用密度梯度离心法分离大鼠MSCs，5-溴脱氧嘧啶（Brdu）和CD44、CD54双重免疫组化鉴定，传3代后的MSCs分为强肌健力口服液含药血清组和空白血清对照组，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测2组MSCs的生长情况。结果强肌健力口服液含药血清组以浓度依赖方式促进MSCs的增殖活力，与相应浓度的空白血清对照组比较差异有显著性意义（P〈0．05，P〈0．01）。结论补脾法（强肌健力口服液含药血清）能促进干细胞的生长。     

麦冬内生真菌与麦冬生长周期

目的：研究不同生长阶段麦冬根部的内生真菌。方法：采集不同生长阶段的麦冬根段，切片染色法观察麦冬根内真菌显微结构及真菌侵染的特征，分析麦冬内生真菌与麦冬发育的关系。结果：麦冬根内含有丰富的内生真菌，苗期根内逐渐出现菌丝并形成大量菌丝团，块根发生初期菌丝连续分枝形成丛枝，块根生长和块根膨大期内存在大量泡囊。结论：麦冬根内的真菌为丛枝菌根真菌，不同生长阶段，根内出现内生真菌的菌丝、丛枝、泡囊，显示内生菌可能与麦冬生长、活性成分的合成有关。     

羊胎素对体外骨髓基质细胞的增殖和向成骨细胞分化的影响

目的探讨羊胎素对体外培养的SD大鼠骨髓基质细胞(Marrow Stroma Cells,MSCs)的影响。方法用MTT法检测MSCs的增殖;PNPP偶氮法检测MSCs碱性磷酸酶(ALP)的活性;细胞ALP染色观察成骨细胞的形成。结果在含羊胎素原液的0.625%,1.25%,2.5%和5%时对体外培养的SD大鼠MSCs有明显的促进增殖的作用(P<0.01);在含羊胎素原液的2.5%及5% 成骨诱导剂时,ALP的活性明显高于诱导剂对照组(P<0.05),而在含羊胎素原液的2.5%和5%浓度组,ALP的活性明显高于空白对照组及诱导剂对照组(P<0.001);细胞ALP染色呈强阳性,加药组颜色明显深于对照组和诱导剂对照组。结论羊胎素对体外培养的SD大鼠MSCs的增殖和向成骨细胞分化具有明显的促进作用。     

左归丸对间充质干细胞向软骨细胞分化过程中Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达的影响

目的观察左归丸含药血清对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向软骨细胞定向分化过程中MSCs增殖、Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达的影响。方法分离培养大鼠MSCs,体外诱导其向软骨细胞分化,诱导同时分别以高（57 g/kg）、中（28.5 g/kg）、低（9.5 g/kg）浓度左归丸含药血清及大鼠空白血清刺激细胞。CCK-8法检测各组对MSCs增殖的影响。将第3代MSCs分为空白对照组（加入大鼠空白血清）、诱导对照组（加入诱导液及大鼠空白血清）及左归丸含药血清组（加入诱导液及中浓度左归丸含药血清）,采用RT-PCR、免疫组织化学和Real-time PCR检测诱导分化软骨细胞中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达。结果与空白对照组比较,不同浓度左归丸含药血清均能促进MSCs增殖（P〈0.05）,其中以中浓度组最为明显（P〈0.05）。诱导第21天RT-PCR和免疫组织化学显示诱导对照组和左归丸含药血清组MSCs中均可见Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达,其中左归丸含药血清组中Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于诱导对照组。Real-time PCR结果显示,诱导第21天左归丸含药血清组蛋白多糖mRNA相对表达定量分别约是第7、14天表达量的16倍和3倍（P〈0.05）,并明显高于同期诱导对照组（P〈0.05）。结论左归丸含药血清能促进MSCs增殖、Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因表达,可能是其软骨保护作用的分子基础之一。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性研究

目的:进一步研究兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分离和培养方法及其生物学特性,为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。方法:通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养兔MSCs。测定其接种贴壁率,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,利用甲基噻唑基四唑(methyl thiazdyl tetrazolium,MTT)法测定MSCs生长曲线,并应用流式细胞术测定细胞表面标记物。结果:MSCs接种12h后贴壁率为95%以上,细胞倍增时间约为30.8h,平均传代时间约5～7d;培养的MSCs阳性表达CD29、CD44、CD105,阴性表达CD34。结论:在适宜的实验条件下,体外培养的MSCs能够稳定生存增殖并保持多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

不同采收期及加工条件对川麦冬多糖含量的影响

目的研究川麦冬块根发育期多糖的动态积累规律,比较不同加工条件对麦冬多糖含量的影响。方法应用浓硫酸-蒽酮显色,紫外-可见分光光度计法对麦冬药材进行多糖含量测定。结果川麦冬在12月份至4月的块根生长期中,多糖含量呈逐渐升高趋势,进入4月份后,多糖含量趋于稳定。结论不同加工条件对麦冬多糖的含量有一定影响。     

三七总皂苷在骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞中的调解作用研究

目的:探讨三七总皂苷在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞中的调解作用。方法:①实验材料:成年健康Wister大鼠(雌雄不限),SRF级,体质量(150±30)g;②实验方法:无菌的条件下从大鼠的股骨中分离并继代培养MSCs细胞,当传至第5代时,先用完全培养液[含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]进行预诱导,再更换无血清培养液(含三七总皂苷0.25g/L)进行诱导,采用免疫组织化学SABC法检测神经丝蛋白(NF-M)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白43(GAP-43)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:①采用三七总皂苷诱导后,大多数MSCs呈神经元样细胞分化。经免疫组织化学鉴定,上述细胞表现为NSE、MAP-2和NF染色阳性,呈棕黄色,而GFAP染色阴性。②采用三七总皂苷进行诱导时,MSCs的胞体逐渐增大,并伸出细长的突起,在突起的末端出现分支,有些相邻细胞的突起还成网状连接。③三七总皂苷诱导MSCs转变为类似于神经元样的形态,经免疫组织化学鉴定,大多数细胞表现为NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43染色阳性,并在胞质和突起中有棕黄色的物质,而GFAP染色均为阴性。SABC法显示NSE和MAP-2阳性细胞数分别为(72.64±2.04)%和(73.5±2.17)%。结论:三七总皂苷在体外能使MSCs向神经元样细胞转化,且具有神经元样细胞的特性,这为MSCs治疗相关疾病提供了理论基础。     

基于数据挖掘分析治疗消渴古方的用药规律

目的探讨中医治疗消渴方剂的配伍规律与用药规律,为临床用药提供借鉴。方法收集整理《中华医方》治疗消渴的方剂,建立方剂数据库的基础上,采用SPSS软件进行频数分析、关联规则处理,对高频药类、药物、药对、方剂年代进行分析。结果纳入研究的方剂共482首,涉及药物374种,累计用药次数达3784次。清热药、补气药、利水渗湿药、补阴药是治疗消渴方剂的常用药类,清热药、补阴药、收涩药、补阳药是使用最多的种类味数,麦冬、天花粉、人参、黄连、茯苓是高频药物,使用频次前15味中药占总体用药次数的41.49%,其中包括清热药(6味)、补虚药(4味)、解表药(2味)、利水渗湿药(1味)、收涩药(1味)、温里药(1味),补虚药又包括补气药(3味)、补阴药(1味)。麦冬配天花粉、麦冬配人参、人参配茯苓、黄连配天花粉是高频配伍结构,北宋、明代两朝代的方剂数量最多。结论采用数据挖掘方法可系统总结中医治疗消渴方剂的组方规律,提供临床用药依据。益气养阴,清热生津,祛邪扶正是治疗消渴基本原则,麦冬、天花粉、人参、黄连等是高频用药。     

兔异体骨髓间充质干细胞穴位与静脉移植对梗死区CD31及bFGF影响的实验研究

目的:进行穴位移植与静脉移植两种不同移植途径来观察兔异体骨髓间充质干细胞(MSCs)对梗死区CD31及bFGF表达的影响的研究。方法:将已建立心肌梗死模型的日本大耳白兔随机分为3组,包括模型对照组、穴位注射干细胞组、静脉注射干细胞组。用开胸结扎冠状动脉前降支的方法建立急性心肌梗死模型,进行间充质干细胞分离、培养、传代、流式细胞仪检侧兔MSCs表面标志、收集、BrdU标记、Brdu标记率的检测,利用免疫组化法检测。结果:梗死心肌组织中CD31平均光密度值,与正常组相比较,穴位注射干细胞组均降低,P<0.01,静脉注射干细胞组略升高,P>0.05;与模型对照组比较,穴位注射组P<0.05,静脉注射组P<0.01;穴位注射组与静脉注射组比较,P=0.05。梗死心肌组织中BFGF平均光密度值,与正常组相比较,穴位注射干细胞组升高,P<0.05,静脉注射干细胞组降低,P<0.01;与模型对照组比较,穴位注射组P<0.05,静脉注射组P<0.01;穴位注射组与静脉注射组比较,P<0.01。结论:穴位与静脉注射骨髓间充质干细胞显著促进了梗死心肌组织周围内皮细胞的激活、增殖、迁移,显著改善梗死区血液循环。但与穴位组相比较静脉组CD31没有显著差异。穴位注射骨髓间充质干细胞显著促进了梗死心肌组织中表达促毛细血管新生细胞因子bFGF。