淫羊藿苷对强直性脊柱炎成纤维细胞向成骨型分化的影响

目的异位成骨是强直性脊柱炎病理过程的核心环节。成纤维细胞是AS异位成骨的靶细胞,BMP/Smad信号传导通路是骨形成过程中的一条重要通路。该研究通过观察淫羊藿苷对体外培养强直性脊柱炎成纤维细胞增殖和凋亡的作用,同期观察淫羊藿苷对体外培养AS成纤维细胞成骨表型表达及BMP/Smad信号通路蛋白表达的影响,初步探讨淫羊藿苷干预强直性脊柱炎异位成骨的分子机制。方法采用组织学原代培养法,建立人髋关节囊成纤维细胞系,应用免疫组化法鉴定细胞来源。以第3代对数生长期的AS成纤维细胞为研究对象,将实验分为AS空白对照组与淫羊藿苷小剂量组(25μg/mL)、中剂量组(50μg/mL)与大剂量组(100μg/mL)。MTT法检测淫羊藿苷干预下AS成纤维细胞的增殖情况;Annexin V法流式细胞术检测淫羊霍苷对AS成纤维细胞凋亡的影响。检测淫羊藿苷作用下AS成纤维细胞成骨表型的表达状况,观察其ALP活性、胶原合成及OC分泌量。Western blotting技术检测在不同剂量淫羊藿苷干预下,AS成纤维细胞BMP/Smad信号通路中Smad1、Smad5、Smad4及成骨标志基因Cbfa-1蛋白的表达情况。结果淫羊藿苷100μg/mL可明显抑制AS成纤维细胞增殖(P0.05),且无细胞毒产生,各组细胞不同时间点增殖情况无显著差异;淫羊藿苷各剂量组对AS成纤维细胞凋亡均无明显作用。大剂量淫羊藿苷对AS成纤维细胞ALP活性、胶原合成及OC分泌均有明显抑制作用。与AS对照组相比,淫羊藿苷作用后AS成纤维细胞BMP/Smad信号通路Smad1、Smad4、pSmad1以及Cbfa-1蛋白表达受明显抑制(P0.05)。结论淫羊藿苷能有效抑制AS成纤维细胞增殖,且抑制AS成纤维细胞成骨表型的表达,其分子机制可能是淫羊藿苷通过干预BMP/Smad信号通路活化,从而调节成骨标志基因Cbfa-1表达,抑制AS成纤维细胞向成骨型分化,可能是淫羊藿苷干预AS异位成骨的机制之一。     

淫羊藿水提取物对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化的影响及其机制

目的 观察淫羊藿水提取物对SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）骨向分化能力及转化生长因子β₁（TGF-β₁）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）表达的影响,阐释其防治骨质疏松症的作用机制。方法 全骨髓贴壁法分离、纯化大鼠MSCs;以碱性磷酸酶（ALP）活性及ALP染色阳性率确定淫羊藿水提取物促MSCs骨向分化的最佳质量浓度,并以该质量浓度进行MSCs骨向分化实验。按是否添加经典成骨诱导液将大鼠分为对照组、成骨诱导剂组、淫羊藿水提取物（500 μg/mL）组、淫羊藿水提取物（500 μg/mL）＋成骨诱导剂组,每3～4 d各组更换含相应物质培养液1次,连续干预14 d。通过检测各组ALP、I型胶原（Col I）、骨钙素（BGP）和钙化结节等骨向分化指标的变化,以评价淫羊藿水提取物对MSCs骨向分化能力的影响;通过检测TGF-β₁、BMP-2的表达,研究淫羊藿水提取物促MSCs骨向分化的作用机制。结果 淫羊藿水提取物最佳促MSCs骨向分化的质量浓度为500 μg/mL;成骨诱导剂组、淫羊藿水提取物组及淫羊藿水提取物＋成骨诱导剂组均能促进MSCs骨向分化及上调TGF-β₁和BMP-2的表达。结论 淫羊藿促进MSCs骨向分化,上调TGF-β₁、BMP-2的表达可能是其作用机制之一。     

淫羊藿苷含药血清对体外培养骨髓间充质干细胞增殖及成骨性分化的影响

目的:研究淫羊藿苷含药血清(SI)对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)增殖和成骨性分化的影响。方法:以每0.25g/kg质量淫羊藿苷的剂量灌服成年大鼠,制得淫羊藿苷含药血清,以灌服等体积生理盐水制得对照血清。分别以2.5%,5%和10%3种血清浓度干预rBMSCs,MTT法检测细胞增殖率,同时检测成骨性诱导培养9d后的碱性磷酸酶(ALP)活性,筛选出最佳血清浓度。以最佳血清浓度干预rBMSCs的成骨性分化,比较SI组和对照组之间的钙盐沉积量、骨钙素分泌量;提取Total RNA,RT-PCR检测IGF-1,Runx-2与Osterix mRNA的表达情况。结果:所有浓度的含药血清均能抑制rBMSCs的增殖,但可提高ALP活性。5%的SI浓度为最佳干预浓度,该浓度的含药血清可显著促进骨钙素的分泌和钙盐沉积,提高ALP活性,增强IGF-1,Runx-2与Osterix mRNA的表达。结论:淫羊藿苷经口服后的代谢产物抑制rBMSCs增殖,但可促进成骨性分化,提示淫羊藿苷可以通过口服途径给药,其代谢物是发挥抗骨质疏松活性的主要成分。     

淫羊藿苷对与复合支架共培养脂肪干细胞成骨分化的影响

目的探讨淫羊藿苷对与复合支架共培养的脂肪干细胞成骨分化的影响。方法将透明质酸溶液、丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液按照1∶2∶4的比例配置成混合液,应用3D打印机制作复合支架。将脂肪干细胞随机分为对照组、共培养组和淫羊藿苷组。对照组常规培养脂肪干细胞,共培养组加入复合支架和脂肪干细胞培养,淫羊藿苷组加入复合支架、脂肪干细胞及10μg/L淫羊藿苷培养。成骨诱导7 d后,MTT法检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR检测碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和I型胶原(Col-I)表达水平。结果共培养组和淫羊藿苷组细胞相对存活率明显低于对照组(P均<0.05),但淫羊藿苷组明显高于共培养组(P>0.05);3组间细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05);共培养组和淫羊藿苷组ALP、BSP、RUNX2、Col-I表达水平均明显高于对照组(P均<0.05),淫羊藿苷组BSP、RUNX2表达水平均明显高于共培养组(P均<0.05)。结论淫羊藿苷能促进与复合支架共培养的脂肪干细胞的增殖和成骨分化。     

淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞增殖及纤维连接蛋白表达的影响

目的考查淫羊藿苷(Icariin)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)增殖以及纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)表达的影响。方法采用体外培养HK-2细胞,分为空白对照组、模型组(5 ng·mL~(-1)TGF-β1)、淫羊藿苷不同浓度给药组(5 ng·mL~(-1)TGF-β1+25、50、100、200μg·mL~(-1)淫羊藿苷),培养24 h后给药处理。药物作用72 h后,观察细胞形态变化,并采用MTT法检测细胞增殖情况;采用实时荧光定量PCR法检测细胞FN mRNA的表达;采用ELISA法检测细胞上清液中FN蛋白的含量。结果与空白对照组比较,模型组的细胞增殖受到明显抑制(P0.01),HK-2细胞的FN mRNA表达显著增加(P0.01),细胞培养液中FN蛋白含量显著升高(P0.01)。与模型组比较,25μg·mL~(-1)淫羊藿苷可以促进HK-2细胞的增殖(P0.01),并使细胞形态逐渐趋向正常;不同浓度组的淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞FN mRNA表达以及细胞培养液中的FN蛋白含量均有下调作用,50、100、200μg·mL~(-1)浓度组作用明显(P0.01)。结论淫羊藿苷可能通过促进HK-2细胞增殖与抑制其FN mRNA及蛋白表达,发挥抗TGF-β1诱导的HK-2细胞向成纤维细胞转化的作用。     

淫羊藿苷对血小板活化的影响及其分子机制的研究

目的:研究淫羊藿苷对血小板活化的影响,并探讨可能的分子机制.方法:血小板聚集仪检测不同浓度淫羊藿苷对胶原、凝血酶、U46619(TXA2类似物)所诱导的血小板聚集的影响.流式细胞仪检测淫羊藿苷对凝血酶、U46619诱导的血小板P-选择素表达和纤维蛋白原结合的作用.免疫印迹法分析淫羊藿苷可能影响血小板活化的分子机制.结果:淫羊藿苷能够抑制胶原、凝血酶、U46619所诱导的血小板聚集,并且抑制作用呈浓度依赖性.淫羊藿苷能够抑制凝血酶、U46619诱导的P-选择素表达和纤维蛋白原的结合.免疫印迹分析显示,淫羊藿苷抑制了血小板Akt的磷酸化.结论:淫羊藿苷可能通过抑制PI3K信号通路降低血小板活化,抑制动脉血栓的形成.     

淫羊藿苷-透明质酸对兔肩袖腱骨愈合的影响及机制研究

目的 探讨淫羊藿苷-透明质酸结合物对兔肩袖损伤术后腱骨界面愈合的影响及其作用机制。方法 选取30只新西兰雄性大白兔，随机分为假手术组、模型组、淫羊藿苷组、透明质酸钠组、淫羊藿苷-透明质酸组，每组6只。假手术组只进行肩部皮肤切开缝合，其余组兔建立右侧肩袖损伤模型，并在造模1周后进行肩袖重建手术，术后进行关节内注射。假手术组、模型组注射生理盐水，淫羊藿苷组注射生理盐水溶解的淫羊藿苷含药血清冻干粉溶液，透明质酸钠组注射透明质酸钠注射液，淫羊藿苷-透明质酸组注射淫羊藿苷-透明质酸结合物，每周1次，连续注射5周。注射5周后处死各组兔，采用ELISA法检测肩关节液中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，HE染色进行腱骨界面组织病理观察，免疫组化检测腱骨界面组织中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)阳性表达情况。结果 淫羊藿苷组、透明质酸钠组、淫羊藿苷-透明质酸组IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明显低于模型组(P均<0.05),且淫羊藿苷-透明质酸组IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明显低于淫羊藿苷...     

淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化作用的实验研究

目的观察淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)骨向分化的作用特点。方法 (1)采用机械分离及全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,氨基安替吡啉测酚法检测不同浓度的淫羊藿苷在第3、6、9、12、15、18、21天对细胞上清液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响,采用茜素红染色法检测各浓度组BMSCs矿化情况,观察不同浓度的淫羊藿苷促BMSCs骨向分化的作用。(2)将BMSCs细胞分为空白对照组、成骨诱导组及淫羊藿苷组(0.5μg/m L),在培养第7、14、21天检测各组细胞上清ALP活性,并于第14及21天分别检测各组细胞ALP阳性染色率与矿化结节数,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测3个不同时间点各组细胞中核心结合蛋白因子(Runt-related transcripition factor-2,Runx2)及骨钙素(Osteocalcin)mRNA的表达水平。结果 (1)0.05~5.0μg/m L淫羊藿苷均可明显提高细胞上清液中ALP活性,其中0.2~2.0μg/m L浓度组细胞结节数亦明显增加(P0.01)。(2)淫羊藿苷促BMSCs骨向分化时,Runx2 mRNA表达水平及ALP活性均先升后降;Osteocalcin mRNA表达水平则持续上升(P0.01);与成骨诱导组比较,作用14天后,淫羊藿苷组ALP活性及ALP阳性染色率均明显提高(P0.05,P0.01)。结论淫羊藿苷通过上调Runx2基因的表达,促使BMSCs向成骨细胞分化,并通过增加细胞ALP分泌及Osteocalcin基因的表达,促进细胞矿化的发生,从而促使新生成骨细胞的成熟。     

淫羊藿苷与其代谢产物淫羊藿次苷Ⅱ对骨髓间充质干细胞成骨性分化影响的比较研究

目的:研究淫羊藿苷与其主要代谢产物——淫羊藿次苷Ⅱ对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(Rat bonemarrow stromal cells,rBMSCs)成骨性分化的影响。方法:贴壁筛选法体外培养rBMSCs,以5×10-5mol/L的淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ对rBMSCs的成骨性分化进行药物干预,比较淫羊藿苷组、淫羊藿次苷Ⅱ组和不加药的对照组之间碱性磷酸酶(ALP)活性、碱性磷酸酶阳性克隆数(CFU-FALP)、骨钙素分泌量、钙盐沉积量以及钙化结节数量的差异,RTReal-Time PCR法检测bFGF、IGF-1、Osterix和Runx-2的基因表达情况。结果:淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ均可显著增强rBMSCs的ALP活性,促进钙盐沉积和骨钙素的分泌,增加CFU-FALP和钙化结节数量,提高bFGF、IGF-1、Osterix和Runx-2的mRNA水平,但淫羊藿次苷Ⅱ的活性明显高于淫羊藿苷。结论:淫羊藿次苷Ⅱ促进rBMSCs成骨性分化的活性高于淫羊藿苷,提示淫羊藿苷可以通过口服途径给药,其代谢物是发挥抗骨质疏松活性的主要成分。     

肾阳虚大鼠血清对OB-OC共育体系中β-catenin/OPG/RANKL表达的影响及淫羊藿苷的调控作用

目的:观察肾阳虚大鼠血清对共育体系中骨保护素(OPG),胞质蛋白(β-catenin)及核转录因子-κB受体活化因子配体(RANKL)蛋白表达的影响及淫羊藿苷对其的调控,进一步探究其诱导骨质疏松发生的可能机制。方法:取16只雄性SD大鼠,随机分为空白组和模型组,每组8只,模型组以10 mL·kg-1腺嘌呤灌胃建立肾阳虚模型,造模成功后收集血清。体外分离培养成骨细胞(OB)和破骨细胞(OC),采用茜素红、碱性磷酸酶(ALP)及姬姆萨染色观察并鉴定OB,OC用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定,transwell小室建立OB-OC共育体系,设置淫羊藿苷组(100μmol·L-1),空白组,淫羊藿苷(100μmol·L-1)+血清组(10%肾阳虚血清),血清组(10%肾阳虚血清)及Dickkopf1(DKK-1)药物组(100μg·L-1),干预共育体系2 d后,对OC进行计数,微板酶标法检测培养液中TRAP及ALP的含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组OPG,β-catenin及RANKL蛋白的表达。结果:与空白组比较,血清组ALP活性,β-catenin及OPG蛋白表达均明显降低(P0. 05),而OC数量,TRAP活性及RANKL蛋白的表达明显升高(P0. 05);与血清组比较,淫羊藿苷组ALP活性显著降低(P0. 01),与淫羊藿苷组比较,淫羊藿苷+血清组ALP活性及OPG蛋白表达明显降低(P0. 05),TRAP活性及RANKL表达明显升高(P0. 05)。结论:肾阳虚大鼠血清能诱导骨质疏松的发病,其作用机制可能是通过降低ALP活性,下调OPG及β-catenin蛋白的表达,同时提高TRAP活性,上调RANKL蛋白的表达来实现的。     

微小RNA-34a对强直性脊柱炎滑膜成纤维细胞成骨分化的影响

目的:探讨miRNA-34a对强直性脊柱炎(AS)滑膜成纤维细胞成骨分化的影响及其机制。方法:将滑膜成纤维细胞分为正常组(来自创伤性骨折患者的细胞)、AS对照组(来自AS患者的细胞)、AS+NC组(转染阴性对照并给予转化生长因子-β1(TGF-β1)和骨形态发生蛋白2(BMP-2)处理AS细胞)和AS+miRNA-34a寡核苷酸模拟物(miRNA-34a mimics)组(转染miRNA-34a mimics并给予TGF-β1和BMP-2处理AS细胞),采用实时-PCR检测各组细胞中miRNA-34a和成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(Runx2) mRNA以及Notch信号通路的Notch1受体与其下游靶基因Hes1 mRNA的表达水平;将Notch信号通路激活剂rhNF-κB加入含miRNA-34a mimics的细胞中,观察ALP、OCN和Runx2 mRNA的表达变化。结果:与正常组相比,AS对照组和AS+NC组细胞中miRNA-34a表达降低,ALP、OCN、Runx2、Notch1和Hes1 mRNA的表达水平均明显升高(P0.05);与AS+NC组相比,AS+miRNA-34a mimics组细胞中miRNA-34a表达升高,而ALP、OCN、Runx2、Notch1和Hes1 mRNA的表达水平均明显降低(P0.05)。给予rhNF-κB作用后,miRNA-34a mimics对ALP、OCN和Runx2 mRNA的抑制作用减弱。结论:miRNA-34a可通过调控Notch信号通路抑制AS滑膜成纤维细胞的成骨分化能力。     

补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下强直性脊柱炎成纤维细胞增殖、周期及凋亡的影响

目的探讨补肾强脊颗粒对强直性脊柱炎(AS)的作用机制。方法以体外培养的AS髋关节囊组织的成纤维细胞为实验对象,分正常组,AS对照组,AS诱导组,兔空白血清组,补肾强脊颗粒小、中、大剂量组和SASP对照组。在细胞因子骨形态发生蛋白(BMP)与转化生长因子-β(TGF-β)的诱导刺激下,观察补肾强脊颗粒对细胞因子诱导后的AS成纤维细胞增殖(样本5个,采用酸性磷酸酶法)、细胞周期(样本3个,采用PI法流式细胞术)及细胞凋亡率(样本3个,采用Annexin V法流式细胞术)的影响。结果补肾强脊颗粒含药血清作用后,对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.01);使细胞因子诱导下的AS成纤维细胞G0/G1期细胞比例显著增加(P<0.05),S期的细胞比例降低(P<0.01);促使细胞因子诱导下的AS成纤维细胞早期凋亡率、晚期凋亡率均有不同程度的增加(P<0.01)。结论补肾强脊颗粒可以通过抑制细胞因子对成纤维细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响而达到抑制成纤维细胞进一步向成骨型的分化。     

淫羊藿苷对人牙周膜细胞OCN表达水平的影响

目的：探讨淫羊藿苷对人牙周膜细胞骨钙素（OCN）表达水平的影响,为淫羊藿苷治疗牙周病提供依据。方法：体外培养人牙周膜细胞,矿化诱导条件下将第3代细胞与10～0.001μg/mL6个浓度的淫羊藿苷作用,Elisa测定OCN表达水平。结果：人牙周膜细胞在矿化诱导条件下与不同浓度淫羊藿苷作用72小时后,1～0.01μg/mL组的OCN表达水平均较对照组显著增加（P＜0.05）;10μg/mL组OCN表达水平较对照组低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：淫羊藿苷在一定浓度范围内可促进人牙周膜细胞骨向分化。     

淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原表达和BGP影响的实验研究

目的:研究淫羊藿甙对体外培养的大鼠成骨细胞功能的影响,探讨淫羊藿甙促进成骨的细胞及分子机制。方法:实验分组将不同浓度的淫羊藿甙加入到其中进行共培养,其对于成骨细胞增殖和分化的影响通过MTT比色实验、BGP含量的放免法检测以及用荧光二抗的免疫组化实验测定Ⅰ型胶原的表达来进行。结果:淫羊藿甙能促进成骨细胞Ⅰ型胶原的表达和BGP的合成。结论:淫羊藿甙具有刺激体外培养成骨细胞增殖、分化和矿化的功能。     

淫羊藿苷对rBMSCs成骨和成脂分化的影响

目的:研究淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)成骨和成脂方向分化的影响。方法:在37℃5%CO2和饱和湿度的条件下贴壁筛选法体外培养rBMSCs。采用1×10-5mol.L-1的淫羊藿苷干预rBMSCs的成骨性分化,第3,6,9,12天进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定,第15天进行钙化结节染色,第12,24,48,72 h提取总RNA,采用实时聚合酶链反应(Real time PCR)方法分析检测骨成型蛋白2(BMP-2)和骨特异性转录因子(Runx-2)mRNA表达水平。采用1×10-5mol.L-1的淫羊藿苷干预rBMSCs的成脂性分化,第5,10,15,20天进行甘油三酯含量的测定,第21天进行油红O染色,于12,24,48,72 h提取总RNA,采用Real Time PCR方法分析检测PPARγ和C/EBPα的mRNA表达水平。结果:淫羊藿苷显著提高了细胞中ALP的活性,增加了钙化结节数,并且升高了成骨性相关因子BMP-2和Runx-2的基因表达量。淫羊藿苷降低了细胞中甘油三酯的含量,减少了脂滴的形成,并且减弱了成脂转录因子过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)和增强子结合蛋白(C/EBPα)的基因表达量。结论:淫羊藿苷对rBMSCs分化的调节有双向性,即它在促进rBMSCs成骨性分化的同时又抑制rBMSCs成脂分化。     

抗纤灵方对体外培养肾成纤维化细胞TGF-β1/p38MAPK信号通路干预的实验研究

目的:观察抗纤灵含药血清对大鼠成纤维细胞TGF-β1和p38MAPK、α-SMA、Ⅰ型胶原的抑制作用。方法:将抗纤灵方煎至含原药材2g/ml,氯沙坦钾配成含药0.33mg/ml,给大鼠灌胃(正常组给予蒸馏水灌胃),制备抗纤灵血清、氯沙坦钾血清和正常血清。用DMEM培养基稀释血清,将其分为正常血清组、TGF-β1组、抗纤灵组、抗纤灵组+TGF-β1、氯沙坦钾组和氯沙坦钾+TGF-β1组。以大鼠的成纤维细胞为材料,采用Westernblot法检测大鼠成纤维细胞p38MAPK、α-SMA、Ⅰ型胶原和TGF-β1的表达。结果:加入TGF-β1刺激因子的细胞表达TGF-β1和p38MAPK、α-SMA、Ⅰ型胶原较正常大鼠血清组明显增强,抗纤灵及氯沙坦钾含药血清可明显抑制其表达。结论:抗纤灵含药血清可以通过抑制大鼠的成纤维细胞TGF-β1的表达,减少细胞外基质p38MAPK、α-SMA、Ⅰ型胶原的沉积,从而延缓肾纤维化的进程。     

淫羊藿黄酮类主要成分促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖分化作用及机制的影响

目的:探讨淫羊藿黄酮类主要成分朝藿定A,朝藿定B,朝藿定C,淫羊藿苷,淫羊藿次苷对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的促进作用,并对其作用机制进行预测。方法:采用全骨髓细胞贴壁法分离纯化SD大鼠BMSCs做原代培养。实验分为朝藿定A+成骨诱导培养基(1×10~(-8)mol·L~(-1))组,朝藿定B+成骨诱导培养基(1×10~(-8)mol·L~(-1))组,朝藿定C+成骨诱导培养基(1×10~(-8)mol·L~(-1))组,淫羊藿苷+成骨诱导培养基(1×10~(-8)mol·L~(-1))组,淫羊藿次苷组+成骨诱导培养基组及成骨诱导培养基组(空白组)6组。加入药物进行干预14 d后,采用定性与定量相结合的方法,通过茜素红染色、细胞骨架染色、碱性磷酸酶定量分析,对淫羊藿5种黄酮类主要成分促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化作用进行药效学评价;在此基础上,基于BATMAN-TCM网络药理学研究平台,对相关靶点和通路进行预测分析,探讨其潜在作用机制。结果:BMSCs在作用浓度为1×10~(-8)mol·L~(-1)的药物浓度作用下诱导14 d,通过细胞骨架染色,各给药组均可明显观察到多角形成骨细胞增多;通过茜素红染色,各给药组可明显观察到大量的矿化结节的形成;通过碱性磷酸酶含量测定,与空白组比较,各给药组碱性磷酸酶含量升高,其中朝藿定C,淫羊藿苷组有显著性差异(P0.05),淫羊藿次苷组具有极显著性差异(P0.01)。同时网络药理学分析表明,5种黄酮类成分在促进增殖和分化方面共得到33个潜在作用靶点,并富集分析得到8条信号通路,其中activation of MAPK activity,estrogen signaling pathway已有实验报道。结论:淫羊藿黄酮类主要成分朝藿定A,朝藿定B,朝藿定C,淫羊藿苷,淫羊藿次苷均具有促进BMSCs向成骨方向分化的作用,其中朝藿定C,淫羊藿苷,淫羊藿次苷的作用效果显著,网络药理学分析结果从整体上阐释了多成分的作用机制,为进一步实验验证提供参考。     

淫羊藿苷对类风湿关节炎小鼠NLRP3炎性小体信号通路的影响

目的探讨淫羊藿苷对类风湿关节炎小鼠的干预作用及NLRP3炎性小体信号通路的影响。方法将50只雄性DBA/1小鼠随机分为对照组、模型组、淫羊藿苷10 mg/kg组、淫羊藿苷20 mg/kg组、淫羊藿苷40 mg/kg组,每组10只。模型组和淫羊藿苷各组尾巴根部皮下注射含Ⅱ型胶原的完全弗氏佐剂诱导类风湿关节炎模型,在第21天二次免疫造模后,淫羊藿苷各组开始给予相应剂量淫羊藿苷灌胃,对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水,均每天1次,连续3周。观察各组小鼠关节炎评分和关节肿胀度;眼球取血,采用ELISA法检测各组小鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)水平;分离关节滑膜组织,采用HE和番红O染色观察各组小鼠关节滑膜的病理变化;采用RT-PCR检测各组小鼠滑膜组织中IL-1β和IL-18 mRNA表达水平;采用Western blot法检测各组小鼠滑膜组织中NLRP3炎性小体信号通路分子(IL-1β、Caspase-1及NLRP3)表达水平。结果首次免疫21 d后,模型组及淫羊藿苷各组小鼠的关节炎评分开始增加,模型组小鼠的关节炎评分持续增加至实验结束;从第27天开始,淫羊藿苷各组小鼠的关节炎评分与模型组比较呈剂量依赖性降低(P均0.05)。淫羊藿苷各组关节肿胀度均明显低于模型组(P均0.05),且呈剂量依赖性降低。模型组小鼠血清中IL-1β、IL-18水平和滑膜组织中IL-1βmRNA、IL-18 mRNA、IL-1β、Caspase-1、NLRP3表达水平均显著高于对照组(P均0.05);淫羊藿苷各组小鼠血清中IL-1β、IL-18水平和滑膜组织中IL-1βmRNA、IL-18 mRNA、IL-1β、Caspase-1、NLRP3表达水平均显著低于模型组(P均0.05),且呈剂量依赖性降低。病理结果显示模型组小鼠滑膜组织中出现严重的炎性细胞浸润、基质破坏及钙含量显著减少,淫羊藿苷各组炎性症状及基质破坏减轻,钙含量显著增加。结论淫羊藿苷可通过抑制NLRP3炎性小体介导的炎症反应来缓解类风湿关节炎,对类风湿关节炎的治疗具有潜在价值。