高通量测序筛选冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络

目的:筛选冠心病血瘀证相关差异表达非编码RNA(lncRNA),微小RNA(microRNA,miRNA),信使RNA(mRNA),构建基因间调控网络,从转录组层面研究冠心病血瘀证物质基础和病理机制。方法:使用高通量测序技术,分别检测冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证和正常(各5例)lncRNA,miRNA和mRNA表达情况,通过交联分析筛选冠心病血瘀证相关的差异基因表达谱。对获得的差异基因进行功能通路分析,根据基因间Pearson相关分析和star Base靶基因预测平台,构建基因间调控网络,通过网络拓扑分析,筛选其中的关键基因。在另一匹配队列中(每组各15例)对基因调控网络中的关键节点进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)验证。结果:39个lncRNA,229个miRNA和221个mRNA与冠心病血瘀证密切相关。功能与通路分析结果显示,冠心病血瘀证差异表达基因主要与免疫和炎症相关。共有9个lncRNA(均为下调),31个mRNA(11个上调,20个下调)和24个miRNA(14个上调,10个下调)构成共调控网络,包括76个基因间调控关系。CTA-384D8.35,CTB-114C7.4,RP11-567M16.6和hsa-miR-3158-3p是冠心病血瘀证基因调控网络中的关键节点。Real-time PCR结果验证了上述结果。结论:冠心病血瘀证存在lncRNA-miRNA-mRNA差异表达基因谱,其与免疫和炎症密切相关;差异表达基因间存在相互调控关系,并可依此构建冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。对冠心病血瘀证的物质基础进行深度挖掘,可为从转录组层面开展中医证型相关研究提供了一定的科学基础。     

应用基因芯片技术研究冠心病秽浊痰阻证差异表达基因及其通路

目的?探索冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）秽浊痰阻证患者差异表达基因及相关信号通路，从分子水平阐明CHD秽浊痰阻证的生物学特点。方法?纳入2015年2月— 2016年3月就诊于新疆医科大学附属中医医院明确诊断为CHD的患者24例，其中秽浊痰阻证组12例、非秽浊痰阻证组12例，另纳入经冠脉造影术排除CHD的12例受试者为对照组。采集外周血并提取总的RNA，通过Human Genome U133 Plus2.0芯片检测获取基因，使用R语言limma软件包筛选差异表达基因，利用STRING构建差异基因编码蛋白互作网络（PPIs），应用Cytoscape插件识别差异表达基因的核心模块，应用Clusterprofiler软件包对差异表达基因进行GO和KEGG功能富集分析。结果?与对照组比较，CHD患者共筛选出184个差异表达基因，其中165个差异基因表达上调，19个差异基因表达下调。CHD秽浊痰阻证组与非秽浊痰阻证组差异表达基因42个，其中34个差异基因表达上调，8个差异基因表达显著下调，GO和KEGG富集分析中，7个模块显著富集了固有免疫调节、固有免疫正向调节、固有免疫的激活和Fc受体信号通路，模块基因参与了MAPK、NF-κB、PI3K/Akt等信号通路、Ⅰ型糖尿病相关通路、C-型凝集素受体信号通路、剪切应力与动脉粥样硬化相关通路等与CHD有密切关联的信号通路。结论?CHD秽浊痰阻证与冠心病非秽浊痰阻证患者存在显著的差异表达基因，这些差异表达基因显著富集在与冠心病相关的多条功能通路中。     

同卵双生子2型糖尿病患病差异性的基因表达谱比较

目的:分析同卵双生子间的差异表达基因,初步探讨双生子2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)罹患差异性的可能分子生物学特征。方法:根据双生子卵性相似诊断法,评判双生子的指纹、中指毛、耳垂、毛发等26项指标的相似度,判断双生子的卵性(同卵或异卵)。应用基因芯片技术,以双生子的同胞弟弟为健康对照,筛选同卵双生子(Monozygotic Twins,MZT)之间的差异基因表达谱,并通过FatiGO数据库进行基因功能比较。结果:这对双生子为MZT。与健康对照比较,得到双生子的差异表达基因,大双为968个,小双为478个,二者之间相同的显著表达基因有15个,基因功能比较结果见免疫反应功能类基因及细胞因子通路显著表达。结论:同卵双生子T2DM患病的差异性主要与个体的免疫功能差异有关。     

血瘀体质中lncRNA和mRNA表达谱分析及调控网络研究

目的:为了更客观地探索血瘀体质的微观特征,本研究从转录组学水平首次初步揭示血瘀体质外周血中lncRNA和mRNA的表达谱特征及其相关作用网络。方法:运用Agilent Human lncRNA+mRNA 4×180 k表达谱芯片,从血瘀体质(BSC,n=11)和平和体质(BC,n=9)者的外周血中分离单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs),采用"limma"方法筛选出2组差异有统计学意义的lncRNAs和mRNAs,对差异基因进行GO功能和KEGG信号通路的显著性富集分析,通过构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图并寻找其作用通路中关键的hub基因。结果:差异表达的lncRNAs和mRNAs均能够将血瘀体质和平和体质进行区分。血瘀体质中差异有统计学意义的lncRNAs 394个(139个上调,255个下调)和mRNAs 410个(159个上调,251个下调)。结果显示,血瘀体质差异基因显著聚集在生长发育调节和细胞信号传导相关作用通路,例如,MAP激酶活性的正向调控、血管生成的正向调控、腺苷酸环化酶活性的激活、卵巢卵泡发育、γ-氨基丁酸能突触以及PI3K-AKT信号通路等。通过构建PPI并筛选了一些核心基因,如,FGF2、VEGFA、HIST1H2BK和PHF5A等。结论:血瘀体质易感冠心病,脑卒中等循环系统疾病和疼痛性疾病等物质基础可能与lncRNAs/mRNAs的生长发育调节和细胞信号传导失调相关。     

“正常-脑瘫”脾肾两虚型双生子的基因表达谱研究

目的研究脾肾两虚型脑瘫双生子的差异基因表达谱,从基因表达水平探讨脾肾两虚型脑瘫发生的分子机制。方法利用基因芯片技术对筛选的两对"正常-脑瘫"脾肾两虚型双生子进行基因表达谱实验,利用GO、KEGG等数据库对获得的差异表达基因进行生物信息挖掘。结果两对脑瘫双生子差异表达基因均涉及多个GO类及KEGG通路,其差异表达基因注释到的通路大多与免疫功能相关。结论免疫功能的异常可能是脾肾两虚型脑瘫发生的关键病机之一。     

衰老大鼠睾丸组织受何首乌饮调控差异表达基因的筛选

目的筛选出衰老大鼠睾丸组织受何首乌饮调控的差异表达基因。方法根据实验要求将雄性大鼠分为4组,每组各10只:青年对照组(12月龄);自然衰老组(18月龄);何首乌饮1组(何首乌饮4.8g/100g,灌胃60d,18月龄);何首乌饮2组(何首乌饮4.8g/100g,灌胃30d,18月龄),采用基因芯片技术筛选睾丸组织受何首乌饮调控的差异表达基因,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行验证。结果基因芯片共筛选出差异表达基因21260个,自然衰老组和青年对照组大鼠睾丸组织差异表达基因有2100个,其中受何首乌饮直接调控的基因有912个,其中衰老后691个基因表达明显上调,221个基因表达下调,用何首乌饮干预60d后,上调的691个基因明显下调,下调的221个基因明显上调;通过GO分析睾丸组织受何首乌饮调控的基因参与的生物学过程有繁殖,免疫代谢,细胞生长发育死亡等;Pathway分析,这些基因主要分布在59条通路上;经qRT-PCR检测结果与芯片结果一致。结论何首乌饮延缓大鼠睾丸组织衰老是一个多途径、多靶点协同作用的过程,但其具体作用机制尚不明确,有待进一步研究。     

血瘀质非创伤性股骨头坏死miRNA差异表达筛选及生物信息学分析

目的筛选血瘀质、非血瘀质非创伤性股骨头坏死(NONFH)患者与健康人外周血中差异表达的miRNA,建立miRNA表达谱,分析其生物学信息,为血瘀质NONFH的防治提供依据。方法选取血瘀质、非血瘀质NONFH患者各10例(NONFH组)和健康志愿者8例(正常组),采用RT-PCR检测其血浆miRNA相对表达量,筛选差异表达的miRNA。应用实时荧光定量PCR对差异表达的hsa-miR-365a-3p、hsa-miR-483-3p进行验证。采用TargetScan、microRNAorg、PITA在线数据库对差异miRNA进行靶基因预测,并进行靶基因生物信息学分析。结果与正常组比较,NONFH组有差异表达的miRNA50个,其中上调21个,下调29个。与非血瘀质NONFH组比较,血瘀质NONFH组有差异表达的miRNA 33个,其中上调10个,下调23个。经筛选,最终确定血瘀质NONFH差异表达miRNA 5个。实时荧光定量PCR验证结果与miRNA芯片结果相符。3个在线数据库共筛选出交集靶基因11个,仅表达下调miRNA中hsa-miR-365a-3p检出交集靶基因11个,余未检测出交集靶基因。GO分析显示,差异表达miRNA主要与受体结合、蛋白及酶的活性有关。Pathway分析显示,血瘀质NONFH差异表达miRNA靶基因主要富集于轴突导向、Rap1、赖氨酸降解、Fc epsilon RI、甘油磷脂代谢、T细胞受体、血小板活化、成骨细胞分化等多个信号通路。结论血瘀质NONFH差异表达miRNA可能通过调控Rap1、赖氨酸降解、甘油磷脂代谢、血小板活化、成骨细胞分化、Ras、PI3K-Akt等信号通路参与NONFH发生发展过程。     

基于高通量测序的人工培殖冬虫夏草僵虫颜色变化转录组分析

目的:探索人工培殖冬虫夏草Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.外观品质形成的分子基础。方法:以重庆和康定人工培殖冬虫夏草僵虫为材料,利用Illumina Hiseq 2500高通量测序技术进行转录组测序分析,基于差异倍数(FC)和错误发现率(FDR)筛选差异表达基因,具体筛选条件为|log2FC|>1、FDR<0.05。结果:共获得21942个转录本,利用DEGSeq筛选获得1575个差异表达基因,其中上调表达基因626个、下调表达基因949个;基因本体(GO)数据库和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析结果显示,这些差异表达基因主要集中于氨基酸代谢、折叠-分选-降解、糖代谢、转运和分解代谢、辅酶因子和微生物代谢等途径;筛选到66个颜色变化差异表达基因,包含46个氧化还原酶活性相关基因、12个过氧化物酶体相关基因、3个单加氧酶活性调节相关基因、3个黑化反应相关基因、2个活性氧代谢相关基因,其中tyr1、TYR基因可能是冬虫夏草僵虫颜色变化的关键功能基因。结论:利用高通量测序技术和生物信息分析获得了人工培殖冬虫夏草僵虫转录组信息特征,为阐明人工培殖冬虫夏草僵虫颜色变化的调控机制研究提供参考。     

气郁体质中lncRNA和mRNA表达谱分析及调控网络研究

目的:首次初步揭示气郁体质外周血中lncRNA和mRNA的表达谱及其相关作用网络。方法:运用lncRNA+mRNA人基因表达芯片V4.0(4×180K),从气郁体质(7例)和平和体质(9例)者的外周血中分离单个核细胞,使用R语言limma包筛选出两组显著差异表达的lncRNAs和mRNAs进行Gene Ontology功能和Ingenuity Pathway Analysis(IPA)通路的显著性富集分析,并寻找lncRNA近距离调控的靶基因。结果:气郁体质中有268个lncRNAs(156个上调和112个下调)和251个mRNAs(154个上调和97个下调)。GO功能和IPA通路富集结果表明,这些差异基因主要富集到免疫和激素调节失常相关通路。确定了9个lncRNA-mRNA相互作用对,如,LY86-AS1-F13A1、SBF2-AS1-ADAM2和FANK1-AS1-ADAM12等。结论:本研究首次揭示气郁体质易感抑郁、焦虑等精神障碍疾病的物质基础可能与lncRNAs/mRNAs的免疫和激素调节失常相关。     

基于转录组测序技术探讨复方蛇龙胶囊治疗膜性肾病大鼠潜在机制

目的:应用高通量转录组测序(RNA-seq)技术检测膜性肾病大鼠肾组织基因表达变化,分析复方蛇龙胶囊可能的作用机制。方法:采用改良Border法建立膜性肾病大鼠模型,设置模型组和复方蛇龙胶囊高、中、低剂量组(1.5、0.75、0.375 g/kg),每天灌胃1次,连续干预8周。采用RNA-seq技术检测复方蛇龙胶囊干预前后的差异表达基因,通过基因本体(GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析、蛋白质相互作用(PPI)及关键基因分析,筛选关键基因以及关键通路。结果:与模型组相比,复方蛇龙胶囊低、中、高剂量组共筛选出差异表达基因685个,其中535个上调基因,150个下调基因。GO富集分析显示差异表达基因主要涉及细胞膜结构,参与物质跨膜运输、细胞粘附与迁移,调控跨膜转运蛋白活性,KEGG富集分析显示差异表达基因主要富集在PI3K/Akt和MAPK信号通路。蛋白质相互作用网络筛选出Egfr、Fn1、Rac3、Frk、Cdh1、Agt、Hspg2、Itga8、Akt3和Fgfr2共10个关键基因,GO功能富集分析显示关键基因主要富集在细胞膜表面及间质,参与跨胞外基质组织及粘附过程,调控激酶活性,KEGG富集分析结果显示关键基因主要富集在PI3K/Akt信号通路。结论:调控肾足细胞自噬与凋亡可能是复方蛇龙胶囊作用的重要机制,与PI3K/Akt信号通路相关基因表达有关。