rRNA基因内转录间隔区测序分析在中草药鉴定中的应用

目的 :研究rRNA基因内转录间隔区 (internaltranscribdedspacer ,ITS)PCR扩增及碱基测序分析对中草药进行鉴定的方法 ,并探讨该方法的科学性及其应用价值。方法 :应用PCR—碱基测序法对所提取的植物性中药材DNA中的rRNA基因内转录间隔区进行PCR扩增和序列测定 ,以获得不同植物性中药材rRNA基因内转录间隔区扩增产物电泳图谱和碱基序列 ,以此作为中药材的分子鉴定标记。结果 :不同中草药rRNA基因内转录间隔区电泳条带 ,碱基序列组成 ,长度各不相同。结论 :不同植物性中药材rRNA基因内转录间隔区可作为分子生物学水平鉴定中草药的靶基因之一。     

DNA测序建立甘肃当归、大黄种子rRNA基因图谱的研究

目的：对甘肃地道性中药材当归、大黄种子中rRNA基因内转录间隔区进行碱基序列测定，以期建立从分子水平对中草药种子进行鉴定的一种新方法。方法：提取当归、大黄种子中核DNA，利用特异性引物对其rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增，并将扩增产物进行碱基序列测定。结果：经琼脂糖凝胶电泳证实：以上述方法可获得当归、大黄种子DNA中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物；并经测序后得到了当归、大黄种子rRNA基因内转录间隔区的碱基序列，且具有明显的差异和可对比性。结论：不同植物性中药材种子rRNA基因内转录间隔区碱基序列可做为从分子水平进行鉴定的标记。     

rRNA基因间隔区碱基测序对当归进行鉴定的研究

目的 通过rRNA基因内转录间隔区的碱基序列测定。对当归进行分子水平鉴定。方法 常规提取当归种籽DNA，利用合成的特异性引物对其rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增，将扩增产物进行碱基序列测定。结果 琼脂糖凝胶电泳证实当归种籽中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物存在；经测序后得到了当归种籽rRNA基因内转录间隔区的碱基序列。结论 rRNA基因内转录间隔区的碱基序列测定可做为分子水平鉴定植物性中药材的又一有效途径。     

应用rRNA基因间隔区碱基测序对中药(大黄)进行鉴定

目的：对大黄种子中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区进行PCR扩增，对于PCR扩增，并对PCR扩增产物进行碱基序列测定，以期从分子水平建立对中草药的鉴定标准，方法：常规提取当归、大黄种子DNA，利用合成的特异性引物对其DNA中rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增，将扩增产物以四色荧光标记的双脱氧末端终止循环法进行碱基序列测定。结果：经琼脂糖凝胶电泳证实大黄种子中rRNA基因内转录间隔区PRC基因内转录间隔区的完整碱基序列。RRNA基因内转录间隔区的碱基序列可作为分子水平鉴定植物中药材的又一有效途径。     

小秦艽rRNA基因内转录间隔区测序鉴定的初步研究

目的 :对小秦艽种籽中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区进行碱基序列测定 ,以期从分子水平建立对秦艽种籽的鉴定标准。方法 :常规提取小秦艽种籽DNA ,利用合成的特异性引物对其DNA中rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增 ,将扩增产物以四色荧光标记的双脱氧末端终止循环法进行碱基序列测定。结果 :经琼脂糖凝胶电泳证实rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物存在 ,测序后得到了小秦艽种籽rRNA基因内转录间隔区的碱基序列。结论 :rRNA基因内转录间隔区的碱基序列可作为分子水平鉴定植物性中药材的又一途径。     

应用rRNA基因间隔区碱基测序对中药(大黄)进行鉴定

目的:对大黄种子中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区进行PCR扩增,对于PCR扩增,并对PCR扩增产物进行碱基序列测定,以期从分子水平建立对中草药的鉴定标准。方法:常规提取当归、大黄种子DNA,利用合成的特异性引物对其DNA中rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增,将扩增产物以四色荧光标记的双脱氧末端终止循环法进行碱基序列测定。结果:经琼脂糖凝胶电泳证实大黄种子中rRNA基因内转录间隔区PRC基因内转录间隔区的完整碱基序列。RRNA基因内转录间隔区的碱基序列可作为分子水平鉴定植物中药材的又一有效途径。     

家种及野生秦艽、麻花秦艽的rRNA基因间隔区PCR产物电泳图谱的初步研究

目的：分析甘肃不同地区家种及野生中药材秦艽Gentiana macrophylla、麻花秦艽G.straminea中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物的电泳图谱，为秦艽、麻花秦艽等不同品种鉴别和品质评价从分子水平提供依据。方法：提取中药材家种及野生秦艽、麻花秦艽的核基因组DNA，利用合成的特异性PC及引物对所提取的DNA中rRNA基因内转录间隔序列进行nPCR扩增，扩增产物行琼脂糖凝胶电泳以得到电泳图谱并进行分析。结果：琼脂糖凝胶电泳图谱显示不同秦艽DNA中rRNA基因内转录间隔区长度均在360bp左右，已具备足够的遗传信息量进行碱基序列分析。结论：不同秦艽DNA中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物可作为从分子水平进行鉴别的标记之一。     

甘南野生狭叶红景天与四裂红景天的rRNA基因间隔区PCR产物电泳图谱的初步研究

目的:分析甘肃省甘南地区野生狭叶红景天与四裂红景天中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物的电泳图谱,为不同品种鉴别和品质评价从分子水平提供依据.方法:提取2种红景天中药材的核基因组DNA,利用合成的特异性PCR引物对所提取的DNA中rRNA基因内转录间隔序列进行nPCR扩增,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以得到电泳图谱并进行分析.结果:琼脂糖凝胶电泳图谱显示不同种红景天的rRNA基因内转录间隔区ITS1序列长度均在340 bp左右,ITS2序列长度均在410 bp左右,且具有明显的可比性.已具备足够的遗传信息量进行碱基序列分析.结论:不同DNA中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物可作为从分子水平进行鉴别的标记之一.     

不同种群蒲公英的内转录间隔区（ITS）序列及其亲缘关系分析

 目的对20个不同种源蒲公英样品内转录间隔区（ITS）序列进行序列测定与分析,分析其遗传关系。方法用特异引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后,用PCR产物直接测序法测序。用DNASRTAR软件分析测序结果。结果各样品的内转录间隔区序列总长为711bp,ITS1、5.8S、ITS2序列长度分别为225、262、226bp。5.8S区较为保守,ITS1和ITS2碱基频率差异显著。结论内转录间隔区序列分析技术可用于蒲公英不同种群的亲缘关系分析。     

rRNA基因内转录间隔区作为遗传标记的应用现状及前景

随着分子生物学技术的不断发展,rRNA基因内转录间隔区(ITS)作为一种遗传标记,已经被广泛应用于微生物菌种分类与鉴定、中药材鉴定和品质评价、植物种质资源鉴定、动物种系发生、遗传多样性与亲缘关系、病原诊断、系统发育研究等不同方面的研究。文章就近年来rRNA基因内转录间隔区的应用现状及前景进行综述。     

中药地枫皮及其伪品假地枫皮的DNA条形码鉴定

目的:评价和比较几个常用DNA条形码候选序列对地枫皮及伪品假地枫皮的鉴定作用。方法:采集不同产地的地枫皮及假地枫皮样品,进行总DNA提取,选取核基因内转录间隔区2(ITS2)序列、叶绿体rbcL,mat K基因序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,纯化产物测序,利用Condon Code Aligner V3. 7. 1校对拼接。结果:地枫皮及假地枫皮rbcL序列进行多次PCR扩增及测序结果均不理想,初步推测地枫皮及假地枫皮rbcL序列太长,进化较慢,不适合作为地枫皮及假地枫皮种间鉴别;地枫皮及假地枫皮的matK基因序列测序成功率分别为0和76. 8%,可能是不同类群的植物matK序列的引物标准不一;对地枫皮及假地枫皮的ITS2序列PCR扩增及测序结果最为理想,测序的成功率分别为89. 3%及91. 2%,对测序结果序列进行分析,地枫皮的ITS2序列总长度均为268个碱基,存在2个变异位点;假地枫皮的ITS2序列总长度均为430个碱基,存在4个或3个变异位点。实验结果说明地枫皮及假地枫皮ITS2序列较短,有明显的变异性,便于扩增,表明ITS2序列用于地枫皮及假地枫皮的分子鉴定优于rbcL和matK序列。结论:ITS2序列作为标准的DNA条形码能够有效地鉴定地枫皮及其伪品假地枫皮。     

5S-rRNA基因间区序列变异用于金银花药材道地性研究初探

目的;研究金银花药材道地性形成的基因基础。方法：用SDS法提取金银花Lonicera japonica不同居群,外类群细毡毛忍冬L.similis和山银花L.confusa的总DNA,进行5S－rRNA基因间区的PCR扩增和测序,并用软件Mega进行分析。结果：Lonicera L.属植物5S－rRNA基因间区约210bp,其中G＋C含量较高,达70％左右,不同居群的L.japonica碱基序列有差别,通过测序可以进行鉴别。L.confusa与L.japonica间的遗传距离较大。结论：种间5S－rRNA基因间区的序列差异大于种内;道地药材之间的遗传距离较小;道地与非道地药材之间的遗传距离大于道地药材之间的遗传距离。     

不同产地浙贝母的基因序列及生物碱含量比较

目的：探讨道地药材形成的基因基础。方法：以AS和AS－1为引物对4个不同产地浙贝母的5S－rRNA基因间区进行了PCR扩增和测序,并采用酸性染料比色法测定了它们的总生物碱含量及用柱前衍生化气相色谱法测定了其中2个单体生物碱的含量。结果：不同产地浙贝母的5S－rRNA基因间区具有相同的碱基序列,均为588bp;它们的总生物碱含量相当,气相色谱结果也表明,它们含有相同的单体生物碱,只是各单体生物碱的含量不同,结论：不同产地浙贝母的差异不是由碱基序列, 而是由小环境因素引起的。     

基于ITS2条形码的中药材牛膝及其易混品DNA分子鉴定

目的利用糖体rRNA基因内转录间隔区(ITS2)序列,对牛膝及其易混品进行鉴定分析。方法提取牛膝及其易混品的DNA,使用ITS2通用引物进行PCR扩增并测序,拼接校对并去除低质量碱基获得目的序列,利用MEGA 7.0对目的序列进行分析比对,计算种内、种间遗传距离,利用邻接法(NJ)构建系统聚类树,同时应用ITS2数据库网站预测其ITS2二级结构。结果牛膝的ITS2序列长度为193 bp,与所有易混品种间遗传距离为0.178～0.958。NJ树显示牛膝单独聚一支,另外牛膝有明显ITS2二级结构特征,可与其易混品明显区分。结论 ITS2序列能够有效地区分牛膝与其易混品,为牛膝的用药安全提供技术保障。     

长白山地区药用植物龙胆DNA条形码鉴定

目的：基于内转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2）碱基序列，运用DNA条形码鉴定技术对长白山地区药用植物龙胆进行鉴别研究，为龙胆药材的基原植物鉴定和药材的真伪鉴别提供参考。方法：采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取法提取龙胆叶片及药材的DNA，对其中特定ITS2碱基序列进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，检测后测序，并从GenBank下载同属植物序列，运用SeqMan软件对碱基序列拼接后，采用MEGA 7.0软件对数据进行分析处理及对比，计算Kimura 2-parameter （K2P）遗传距离，建立邻接（NJ）法，进行对比分析。结果：根据NJ聚类树可知，不同种龙胆属植物笔龙胆、三花龙胆、高山龙胆、坚龙胆都自为一支，区分明显，龙胆和条叶龙胆聚在一支未能区分开，同时结合变异位点及K2P遗传距离发现，条叶龙胆和龙胆应用ITS2碱基序列区分时种间差异十分小。吉林省长白山10个不同地区的龙胆种内几乎无差异，经Blast比对确定碱基序列的确为所需要鉴定的品种。结论：运用ITS2碱基序列的DNA分子条形码鉴别方法对龙胆植物及药材进行鉴别有效可行且成功率较高，可以用于龙胆属种间及种内鉴别。     

不同处理条件下11种有毒药用植物的DNA条形码鉴定

目的：为了快速准确地鉴定中毒事件中毒源植物的种类，对有毒药用植物开展基于DNA条形码技术的分子鉴定研究。方法：选取11种有毒药用植物，对植物叶片组织材料进行硅胶干燥、沸水加热及胃液消化等21种不同条件的处理，采用直接聚合酶链式反应（PCR）法，选用6种引物扩增常用的5个植物DNA条形码序列，检测不同处理方法下扩增与测序的成功率。对于通过测序获得的DNA条形码序列，使用Blast法开展鉴定分析工作。结果：硅胶干燥材料的PCR成功率普遍低于未处理或短时间沸水处理的新鲜材料。短时间沸水加热处理并不会影响PCR的成功率，而沸水处理超过15 min时PCR扩增成功率急剧下降。在胃液结合短时间沸水处理条件下，PCR成功率仍然可以维持在较高的水平，而PCR扩增成功率同样在沸水处理材料15 min后显著下降。通过测序获得的DNA条码序列使用Blast方法进行鉴定，其科、属水平的准确率较高，而种水平的准确率普遍较低。内转录间隔区（ITS）片段种级鉴定准确率显著高于叶绿体区段，而叶绿体区段中psbA-trnH的种级鉴定准确率最高。结论：直接PCR扩增获取DNA条形码的方法在实际中毒案例植物的鉴定中具有一定的应用前景。     

钩吻属植物及其易混品五指毛桃的DNA条形码比较分析

目的：对钩吻属植物钩吻和北美钩吻进行2种DNA条形码的碱基序列分析，结合药食同源品种五指毛桃构建系统进化树，为五指毛桃药材的真伪鉴定提供参考。方法：对钩吻、北美钩吻和五指毛桃样品进行内部转录间隔区2（ITS2）序列和psbA-trnH序列的扩增测序，比对分析2种DNA条形码扩增产物碱基组成、GC含量、差异位点的差异；通过构建Kimura 2-parameter（K2P）双参数模型计算和分析种内、种间遗传距离；基于邻接法构建系统进化树，分析ITS2序列和psbA-trnH序列的鉴定效率。结果：ITS2区和psbA-trnH区序列均可作为钩吻属植物与五指毛桃鉴定的DNA条形码序列。其中psbA-trnH区在钩吻属种间的碱基序列长度、种间变异位点数量均具有显著差异，系统进化树的聚类结果稳定性更强，比ITS2更适用于该属植物样本的鉴别。结论：psbA-trnH序列可作为钩吻和北美钩吻鉴定首选DNA条形码，ITS2序列可作为五指毛桃与钩吻属植物鉴定的首选DNA条形码。     

DNA条形码等分子鉴定技术与动植物类中药材的鉴定

中药材鉴定是控制中药质量、确保用药安全与效果的首要环节。DNA分子鉴定是从基因层面上进行中药材鉴别的手段,准确率高。DNA分子鉴定包括电泳技术、免疫技术、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(ISSR)及DNA条形码等,以DNA条形码应用最为广泛。DNA条形码是基因组中相对较短的、可用于物种鉴定的特异性基因片段。植物类中药材的条形码多选用核基因和叶绿体基因DNA片段,如叶绿体psbA-trnH基因、内转录间隔区(ITS)、叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基(rbcL)和RNA转录体Ⅱ型内含子剪切酶基因(matK)等;动物类中药材的条形码多来自核基因和线粒体基因DNA,主要有线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(COⅠ)、核糖体RNA(rRNA)和线粒体细胞色素b基因(CytB)等。综述动植物类中药材DNA分子标记与鉴定技术应用进展,并探讨DNA条形码在药用动植物类中药材鉴定中存在的局限性及发展前景,为中药质量控制提供参考。     

川乌与草乌的ITS序列分析

 目的比较川乌、草乌及市场流通的混淆种类的内转录间隔区(ITS)序列,分析该片段在乌头类药材的DNA分子鉴别中的意义。方法利用PCR扩增和ABI377自动测序。结果川乌、草乌及其混淆种类之间在内转录间隔区(ITS)序列特征、碱基频率和遗传距离等方面都存在一定差异。结论ITS序列可准确鉴定川乌和草乌,以及草乌与其混淆种类,该方法更具简单性和实用性。     

落葵薯DNA条形码筛选及其近缘植物的分子鉴定

目的:利用DNA条形码鉴定落葵薯及其近缘植物。方法:对来自不同产地的28份落葵薯及其近缘植物的核基因ITS序列和ITS2序列、叶绿体基因matK序列、psbA-trnH序列和rbcL序列进行PCR扩增并测序,比较不同序列的PCR成功率及测序成功率,对各序列进行种内和种间变异分析,Barcoding gap检验,以及构建NJ树聚类分析,评估不同序列对落葵薯及其近缘植物的鉴别能力。结果:经PCR扩增、测序后发现落葵psbA-trnH序列出现碱基缺失事件,其他序列均扩增、测序成功;matK序列和rbcL序列的测序成功率均为100%,ITS序列和ITS2序列的测序成功率分别为78.75%和64.28%;4条序列中,ITS序列和matK序列的种内和种间距离分别在barcoding gap检验中明显分离;从NJ树来看,ITS序列、matK序列均可区分落葵薯及其近缘植物。结论:建议采用ITS序列及matK序列作为落葵薯及其近缘植物鉴定的DNA条形码。