RNA干扰TAGLN2基因对TGF-β1诱导心肌细胞凋亡的影响

目的探讨RNA干扰TAGLN2基因对转化生长因子(TGF)-β1诱导心肌细胞凋亡的影响及机制。方法 H9c2心肌细胞分为空白对照组、NC组、TGF-β1组和TGF-β1+si-TAGLN2组,其中siRNA的转染参照Lipofectamine~(TM)2000说明,Western印迹检测TAGLN2、p53、裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)3、B细胞淋巴瘤因子(Bcl)-2、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、核因子(NF)-κB p65和IκB-α的蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡率及活性氧(ROS)水平。结果转染si-TAGLN2的H9c2心肌细胞TAGLN2蛋白表达显著低于空白对照组(P0.05)。与NC组比较,TGF-β1组细胞凋亡率、ROS水平及p53、 Cleaved caspase3和NF-κB p65蛋白表达均显著升高,Bcl-2、PI3K、 p-AKT、和IκB-α蛋白表达均显著降低(P0.05);与TGF-β1组比较,TGF-β1+si-TAGLN2组细胞凋亡率、ROS水平及p53、 Cleaved caspase3和NF-κB p65蛋白表达均显著降低,Bcl-2、PI3K、 p-AKT、和IκB-α的蛋白表达均显著升高(P0.05)。结论 TAGLN2基因表达抑制可降低由TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡,机制可能与降低细胞内ROS水平、激活PI3K/AKT信号和抑制NF-κB信号有关。     

RNA干扰DNMT1基因对胰腺癌细胞BxPC-3增殖的影响及相关机制

目的:探讨RNA干扰DNMT1基因对胰腺癌细胞BxPC-3增殖的影响及相关机制.方法:利用Lipofectamine TM2000转染DNMT1-siRNA至胰腺癌细胞BxPC-3.实验共分为3组:实验组(转染DNMT1-siRNA)、阴性对照组(转染negative-siRNA)和空白对照组(转染脂质体).转染48h后,应用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测细胞中DNMT1 mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测细胞体外增殖活力;FCM法检测细胞凋亡;甲基化特异性PCR法(MSP)检测抑癌基因p16、RASSF1A和ppENK的启动子甲基化状态.结果:与空白对照组和阴性对照组相比,实验组的DNMT1 mRNA及蛋白表达量均显著降低(P<0.01);实验组细胞增殖明显受到抑制(P<0.05),细胞凋亡率明显增加(44.46%±5.98%vs3.74%±1.02%vs5.07%±1.16%,P<0.01).空白对照组与阴性对照组的p16、RASSF1A和ppENK基因甲基化阳性,而实验组的p16和ppENK基因甲基化阴性,RASSF1A基因部分甲基化.结论:DNMT1基因表达下调后,能抑制胰腺...     

P21对胃癌细胞MGC-803的增殖抑制及对POLD1基因表达的调控

目的:研究P21对POLD1基因的调控通路,以探索阻断癌细胞恶性增殖的机制.方法:实验主要分3组:阴性对照组(转染空载体pXJ41-neo的803-pXJ细胞)、空白对照组(胃癌细胞MGC-803)、实验组(转染P21重组真核表达质粒pXJ41-p21的803-p21细胞).MTT实验分析细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR技术检测基因表达水平的变化,Westernblot分析蛋白表达差异.结果:MTT实验显示,与空白对照和阴性对照组相比,实验组细胞增殖受到明显抑制,凋亡率(%)增高(11.36±0.51vs7.39±0.17,7.69±0.47,F=85.338,均P<0.05).实验组P21mRNA表达水平显著提高(2.15±0.23vs1.05±0.11,1.00±0.00,F=59.054,均P<0.05),POLD1则显著下调(0.45±0.07vs1.09±0.13,1.00±0.00,F=49.907,均P<0.05);P21、P125蛋白表达变化与基因变化相一致.cyclinE、Rb1基因表达均上调,CDK2基因表达下调,c-myc基因表达则变化不大.结论:P21抑制了...     

抗病毒治疗对HBeAg阴性CHB患者TGF-β1、TIMP-1、MMP-1水平的影响

目的 探讨TGF-β1、TIMP-1、MMP-1在HBeAg阴性CHB患者肝纤维化诊断中的作用以及抗乙肝病毒治疗对其影响.方法 以正常体检健康者为对照组,HBeAg阴性CHB分轻度、中度、重度组,依据抗病毒治疗48周后HBV DNA低于检测下限分为治疗有效组和治疗无效组,ELISA法测定各组血清中TGF-β1、TIMP-1、MMP-1含量,免疫组化检测肝组织TIMP-1、MMP-1表达.结果 HBeAg阴性慢性乙型肝炎外周血TGF-β1、TIMP-1水平明显高于正常对照组(P＜0.01),而血清MMP-1则明显低于正常对照组(P＜0.01).随慢性肝炎轻度-重度逐渐发展,血清TGF-β1、TIMP-1的水平逐渐增高,且差异有统计学意义(P＜0.05).TIMP-1蛋白在肝纤维化组织的阳性表达,随肝纤维化程度的加重而增强,呈正相关(rs=0.618,P=0.002);MMP-1蛋白在肝纤维化组织的阳性表达与肝纤维化程度无相关性(rs=0.077,P=0.732).抗病毒治疗48周后有效组血清TGF-β1、TIMP-1的含量明显下降,MMP-1水平上升(P＜0.01).无效组血清TGF-β1、TIMP-1、MMP-1水平变化不明显(P＞0.05).结论 联合检测TGF-β1、TIMP-1、MMP-1是判断慢性肝病患者有无纤维组织增生敏感而可靠的指标,动态观察上述指标的变化,对临床判断肝纤维化程度和活动度有着重要价值,同时也为临床疗效的判断提供有效的实验依据.     

TGF-β1反义寡核苷酸对食管鳞癌细胞EC9706增殖及凋亡的影响

目的:探讨转染TGF-β1反义寡核苷酸(TGFβ1-ASODN) 对食管鳞癌细胞EC9706 增殖及凋亡的影响. 方法:将化学合成的TGF-β1-ASODN 转染食管鳞癌细胞EC9706,采用RT-PCR 和流式细胞术检测转染效率;观察TGF-β1-ASODN 转染后细胞形态学的改变;采用MTT 和流式细胞术检测TGF-β1-ASODN 转染后对细胞增殖及凋亡的影响. 结果:转染TGF -β1-ASODN 可有效抑制EC9706 细胞中TGF-β1的活性,其mRNA 及蛋白的表达均明显低于转染前的水平(0.25 ±0.07 vs 0.43±0.09;35.35% vs 41.38%,均P<0.05);TGF-β1-ASODN 可明显促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,转染后细胞生长拥挤失去正常形态,细胞存活率高于转染前(109.4% vs 100.0%,P <0.05),G1期、S期细胞百分比低于转染前,G2期细胞百分比则高于转染前,细胞凋亡率低于转染前(62.9% vs 66.5%;21.3% vs 23.7%;14.8% vs 9.8%;0.69% vs 0.96%,均P<0.05). 结论:TGF -β1-ASODN 可高效特异地将TGF-β1基因沉默,并解除其抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡的作用.     

CCl4诱导的肝纤维化小鼠和HSC-T6细胞miR-122水平变化及其意义探讨*

目的 研究微小RNA(miR)-122在肝星状细胞活化/增殖及肝纤维化发生过程中的水平变化及其可能的作用机制。方法 建立CCl₄诱导的C57BL/6小鼠肝纤维化模型,以10 ng/ml转化生长因子-β1(TGF-β1)处理HSC-T6细胞,分别在小鼠体内和肝星状细胞转染miR-122 激动剂和miR-122模拟物以过表达miR-122。采用RT-PCR和Western-blot法检测组织和细胞miR-122、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原、金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)和血小板衍生生长因子(PDGF)表达,采用CCK-8法检测HSC-T6细胞增殖。结果 模型组小鼠肝组织α-SMA表达水平显著高于对照组(9.92±2.12对1.12±0.54,P＜0.01),而miR-122水平显著低于对照组(0.95±0.31对2.07±0.28,P＜0.01);在CCl₄诱导的肝纤维化小鼠,miR-122激动剂转染组肝组织miR-122水平显著高于miR-122激动剂对照组(6.27±1.73对2.78±0.21,P ＜ 0.01);miR-122 激动剂转染组肝组织α-SMA、I型胶原、TIMP-1和PDGF蛋白水平显著下降;在TGF-β1处理的HST-T6细胞,随着处理时间的延长,肝星状细胞α-SMA水平逐渐升高(0h:0.61±0.02,12 h:0.69±0.05, 24 h:0.75±0.01,48 h:1.01±0.03,P＜0.05),而miR-122水平随TGF-β1处理时间的延长而逐渐下降(0 h:0.72±0.05,12 h:0.45±0.01, 24 h:0.37±0.03,48 h:0.29±0.08, P＜0.05);与miR-122 阴性对照转染组比,miR-122模拟物转染组细胞miR-122水平显著增加(178.45±30.62对12.18±2.39,P ＜0.01);Western Blot检测发现miR-122模拟物转染组细胞α-SMA蛋白表达水平显著下调;采用TGF-β1处理HST-T6细胞,与miR-122 阴性对照转染组比,miR-122 模拟物转染组细胞增殖活力显著降低(P＜0.05)。结论 肝纤维化组织细胞miR-122水平下调,而过表达miR-122可抑制肝星状细胞的活化和增殖,从而可能抑制肝纤维化的发生和发展。     

TAX1结合蛋白1加重苯肾上腺素诱导的心肌细胞凋亡

目的探究TAX1结合蛋白1(TAX1BP1)对苯肾上腺素(PE)诱导的原代新生大鼠心肌细胞(NRCM)凋亡的影响。方法将培养的NRCM分为正常组、模型组(PE 50μmol/L)、阴性组、转染组(转染TAX1BP1过表达腺病毒)、对照组、刺激组(转染TAX1BP1过表达腺病毒后,用PE 50μmol/L)。采用α肌动蛋白免疫荧光染色观察NRCM面积,TUNEL染色检测NRCM凋亡程度,免疫印迹法检测TAX1BP1及促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达。结果模型组NRCM中TAX1BP1表达较正常组明显升高(0.97±0.16 vs 0.69±0.06,P<0.05)。与阴性组相比,转染组NRCM中的TAX1BP1表达上调(0.98±0.08 vs 0.65±0.07,P<0.05);与转染组相比,刺激组NRCM中的TAX1BP1表达上调(1.24±0.06 vs 0.98±0.08,P<0.05)。与阴性组比较,对照组NRCM面积增大、NRCM凋亡数量增加、Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少(P<0.05);与对照组比较,刺激组NRCM面积增大、NRCM凋亡数量增加,Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调(P<0.05)。结论TAX1BP1可促进PE诱导的心肌细胞肥大,通过增加Bax表达以及抑制Bcl-2来加重PE诱导的心肌细胞凋亡。     

过表达HSF1及ASK1基因对H2O2刺激后心肌细胞内ROS水平的影响

目的研究热休克因子1(HSF1)及凋亡信号调节激酶1(ASK1)对过氧化氢(H_2O_2)刺激后心肌细胞内活性氧簇水平(ROS)变化的影响。方法对不同组培养心肌细胞分别单独转染质粒HSF1,ASK1,及共转染HSF1 ASK1,48h待其充分表达后用1 mmol/LH_2O_2刺激心肌细胞30min,检测细胞内ROS水平,并与相应转染后未刺激组及未转染的对照组比较,观察ROS水平的变化。结果(1)所有H_2O_2刺激组心肌细胞内ROS水平均高于相同转染条件下的非刺激组(P<0.05);(2)相同H_2O_2刺激条件下,各组ROS水平:HSF1组低于对照组(P<0.05),ASK1组与对照组无显著差异,HSF1 ASK1组与单转HSF1组相比有升高的趋势;(3)相同H_2O_2刺激条件下,各组刺激后比刺激前ROS水平增高的幅度:HSF1组低于对照组(P<0.05),ASK1组与对照组无显著差别,HSF1 ASK1组与单转HSF1组相比有升高的趋势。结论在H_2O_2刺激条件下,HSF1可通过降低心肌细胞内的ROS水平来发挥细胞保护作用,而ASK1对细胞内ROS水平无影响,但其可干扰HSF1对ROS的抑制作用。     

熊果酸对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1和α-SMA表达的

织TGF-β1基因与蛋白及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响, 并探讨其抗肝纤维化作用机制.方法: SD大鼠96只随机分为正常对照组(N组)、模型组(M组)、UA低剂量组(U1组)、UA中剂量组(U2组)、UA高剂量组(U3组)及秋水仙碱组(C组), 每组16只. 除N组外, 均用二甲基亚硝胺(Dimethylnitrosamine, DMN)诱导肝纤维化4 wk, 分别给予安慰剂、不同剂量的UA、秋水仙碱腹腔注射, 治疗4 wk处死大鼠,取肝组织行病理HE染色及VG染色判断炎症和肝纤维化程度; 分别采用免疫组织化学和Western blot检测TGF-β1蛋白和α-SMA蛋白的表达; 采用RT-PCR检测TGF-β1 mRNA的表达.结果: U2和U3组肝细胞坏死和纤维组织增生明显减轻; M组TGF-β1蛋白、TGF-β1 mRNA及α-SMA蛋白较N组的表达明显增加(8.76±1.47 vs 1.48±0.24; 0.60±0.11 vs 0.05±0.02;0.51±0.10 vs 0.09±0.02, 均P<0.01). U1组和C组TGF-β1蛋白的表达较M组降低( P<0.05),U2和U3组TGF-β1蛋白的表达较M组明显降低(5.32±1.63, 3.98±0.67 vs 8.76±1.47,均P<0.01), 且低于C组的表达(7.14±1.29,P<0.05或0.01). U2和U3组的TGF-β1 mRNA的表达也明显低于M组(0.36±0.07, 0.25±0.06 vs 0.60±0.11, 均P<0.01)和C组(0.47±0.10, P<0.05或0.01). U1-U3组较M组α-SMA蛋白的表达明显降低(0.36±0.08, 0.23±0.02,0.15±0.03 vs 0.51±0.10, 均P<0.01); U2和U3组α-SMA蛋白的表达也显著低于C组(0.43±0.05, 均P<0.01).结论: UA能明显改善肝纤维化大鼠的肝脏组织结构, 减轻肝纤维化; 其抗肝纤维化的机制可能与降低TGF-β1表达, 抑制HSC的激活有关.     

肝癌组织中TGF-β1、TGF-β1RⅡ和NF-κB的表达

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β1Ⅱ型受体(TGF-β1RⅡ)、核转录因子-κB(NF-κB)在肝细胞癌(HCC)中表达.方法:在30例肝癌组织和癌旁肝组织中,用免疫组化技术,分别检测TGF-β1 TGF-β1RⅡ及NF-κB蛋白的表达;用原位杂交方法检测TGF-β1mRNA的表达,以CD34标记血管内皮细胞,观察TGF-β1及TGF-β1RⅡ蛋白与微血管密度(MVD)、TGF-β1蛋白与TGF-β1mRNA、NF-κB与TGF-β1的关系.结果:肝癌组织TGF-β1mRNA平均光密度明显高于癌旁组织(0.1 043±0.035 vs 0.0 620±0.0 225,P＜0.01)、TGF-β1蛋白平均光密度表达明显高于癌旁组织(0.0 72 5±0.0 102 vs 0.0 442±0.0 103,P＜0.01);肝癌组织TGF-β1RⅡ蛋白平均光密度表达明显低于癌旁组织(0.0 402±0.0 113 vs 0.0 669±0.0 157,P＜0.01);肝癌组织NF-KB蛋白表达均明显高于癌旁组织(0.0 723±0.0 210 vs 0.0 305±0.0116,P＜0.01),肝癌组织MVD明显高于癌旁组织(31.23±9.25 vs 4.24±2.10,P＜0.01),肝癌组织TGF-β1蛋白阳性表达与MVD呈正相关(t=3.25,P＜0.01);TGF-β1 mRNA与TGF-β1蛋白呈正相关(χ2=8.21,P＜0.01);NF-κB蛋白阳性表达与TGF-β1蛋白阳性表达呈正相关(χ2=9.075,P＜0.01);而TGF-βRⅡ蛋白与MVD呈负相关.结论:肝癌组织中TGF-β1基因的变化发生在多个水平,肝癌细胞中TGF-β1RⅡ、NF-KB蛋白表达异常,并与MVD相关,提示他们在肝细胞癌血管形成中发挥重要作用,NF-κB可能在介导TGF-β1的活化或产生中发挥一定的作用.     

PTEN对急性T淋巴细胞白血病细胞增殖凋亡的影响

目的探讨第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)对急性T淋巴细胞白血病细胞增殖凋亡的影响。方法急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat分为对照组(不做处理)、p EGFP组(细胞转染空载体)、p EGFP-PTEN组(细胞转染PTEN过表达载体),RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中PTEN表达水平,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法检测活性氧(ROS)水平,Western印迹检测β-连环蛋白(β-catenin)、Wnt信号通路下游靶基因c-myc、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3蛋白表达水平。结果对照组、p EGFP组、p EGFP-PTEN组PTEN mRNA水平分别为:1.00±0.06、0.98±0.09、2.14±0.15,PTEN蛋白水平分别为:0.36±0.07、0.37±0.05、1.06±0.11,细胞存活率分别为:(100.00±10.36)%、(100.15±11.97)%、(65.84±7.59)%,细胞凋亡率分别为:(7.69±0.98)%、(7.84±1.32)%、(26.93±2.45)%,ROS水平分别为:1.00±0.13、1.03±0.08、2.95±0.24,β-catenin水平分别为:0.58±0.09、0.56±0.12、0.21±0.05,c-myc水平分别为:0.63±0.08、0.62±0.06、0.29±0.02,酶切Caspase-3水平分别为:0.32±0.07、0.34±0.03、0.97±0.11。结论 PTEN抑制急性T淋巴细胞白血病细胞增殖,促进急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡,Wnt信号通路及ROS水平可能是其作用机制之一。     

转换生长因子-β_1对肺成纤维细胞窖蛋白-1与细胞外基质表达的影响

目的 研究转换生长因子-β_1(TGF-β_1)对人胚肺成纤维细胞(HFLF)的窖蛋白-1、Ⅰ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响.方法 体外培养HFLF,以未加TGF-β_1的HFLF为对照组.分别以不同终浓度(2、5和10 μg/L)TGF-β_1处理的HFLF为实验组,每组5×10~8细胞,实验重复3次,逆转录-PCR和Western blot法分别检测TGF-β_1刺激3、6、12和24 h后各组窖蛋白-1及其mRNA、Ⅰ型胶原和α-SMA蛋白表达.组间均值比较采用单因素方差分析,采用直线回归模型进行相关性分析.结果 TGF-β_1作用后,HFLF窖蛋白-1的mRNA和蛋白表达逐渐减少,呈时间-浓度依赖关系;TGF-β_1作用12 h,中剂量组(5 μg/L)窖蛋白-1的mRNA和蛋白表达的积分吸光度值(0.59±0.06和0.53±0.04)明显低于对照组(1.22±0.12和1.45±0.06),差异均有统计学意义(F值分别为29.279和95.786,均P＜0.01);TGF-β_1作用24 h,中剂量组(5 μg//L)Ⅰ型胶原和α-SMA蛋白表达的积分吸光度值(1.35±0.09和0.75±0.06)明显高于对照组(0.28±0.04和0.18±0.04),差异均有统计学意义(F值分别为81.221和65.477,均P＜0.01);相关分析结果显示,HFLF窖蛋白-1的蛋白表达下调与Ⅰ型胶原和α-SMA蛋白表达上调旱显著负相关(r值分别为-0.923和-0.793,均P＜0.05).结论 TGF-β_1可下调HFLF窖蛋白-1的mRNA和蛋门表达,并与Ⅰ型胶原和α-SMA蛋白表达上调呈负相关,提示HFLF窖蛋白-1下调可能与肺间质纤维化的发生和发展有关.     

小干扰RNA靶向突变K-Ras基因对人胰腺癌细胞TGFβ1表达的影响

背景与目的研究显示ras基因活化可促使肿瘤细胞分泌多种细胞因子,而ras基因与TGFβ1基因表达之间的关系还未可知。本研究利用小干扰RNA敲除突变k-ras基因,探讨突变k-ras基因对TGFβ1表达及分泌的影响。方法小干扰RNA瞬时转染靶向突变k-ras后,应用real-time PCR和Western blot方法检测胰腺癌细胞株CFPAC-1、Aspc-1中ras mRNA和蛋白的表达;应用real-time PCR和流式细胞仪检测对胰腺癌细胞TGFβ1表达的影响;应用ELISA方法检测转染前后胰腺癌细胞上清液中TGFβ1浓度。结果①以人已知基因无影响的序列阴性对照组为基准计算k-ras mRNA的相对表达量,实验组胰腺癌细胞CFPAC-1和ASPC-1转染后k-ras mRNA表达明显减低,k-ras mRNA表达在转染后48h为最低,抑制率达(75.33±5.50)%。Western blot检测各组质粒转染的细胞ras蛋白表达,结果显示实验组ras蛋白量较转染试剂对照组、已知基因无影响的序列阴性对照组明显降低。②Real-timePCR结果显示实验组CFPAC-1和ASPC-1细胞转染后,TGFβ1mRNA表达量(CFPAC-10.68±0.08;Aspc-10.59±0.09)明显降低(P0.05)。而流式细胞仪结果显示TGFβ1蛋白表达降低(CFPAC-1组0.30±0.08,ASPC-1组0.33±0.10,P0.05)。③ELISA法检测实验组CFPAC-1上清液TGFβ1浓度为(1906.87±50.75)ng/ml,较阴性对照组(2072.79±96.98)ng/ml有所降低(P=0.036);实验组Aspc-1细胞上清液TGFβ1浓度(851.47±41.08)ng/ml,较阴性对照组(950.93±31.34)ng/ml有所降低(P0.05)。结论人胰腺癌细胞CFPAC-1、Aspc-1中TGFβ1mRNA和蛋白的表达与ras基因相关。TGFβ1可能是ras基因活化后驱动胰腺癌发生及演变的重要物质。本研究为k-ras突变的胰腺癌治疗提供有益的信息。     

KIM-1在TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞纤维化因子表达中的作用

目的探讨肾脏损伤因子(KIM)-1在转化生长因子(TGF)-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化因子表达中的作用。方法用TGF-β1刺激处理大鼠肾小管上皮细胞NRK52E,qRT-PCR和Western印迹法分别测定细胞中KIM-1 mRNA和蛋白水平。在NRK52E中转染KIM-1 siRNA,给予TGF-β1刺激后,qRT-PCR和Western印迹法分别测定细胞中KIM-1 mR-NA和蛋白水平。Western印迹法检测细胞中上皮间质转化(EMT)标志蛋白上皮钙黏附素(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)和纤维化因子结缔组织生长因子(CTGF)、1型胶原酶(Col1)、3型胶原酶(Col3)的表达。结果对照组+TGF-β1细胞中KIM-1 mRNA和蛋白水平明显高于对照组(P<0. 05)。干扰组+TGF-β1细胞中KIM-1表达水平显著低于对照组+TGF-β1,差异具有统计学意义(P<0. 05)。干扰组+TGF-β1细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高,α-SMA表达水平降低,纤维化因子CTGF、Col1、Col3的表达也降低,与对照组+TGF-β1比较差异具有统计学意义(P<0. 05)。结论敲低KIM-1可以减少TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化因子表达,抑制肾小管上皮细胞EMT。     

人突变型CDK4真核荧光表达质粒的构建及对人肝细胞SMMC-7702中POLD1基因表达的调控

目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行P C R扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-C1质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析;转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-C1组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化;实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLD1及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的C D K4蛋白;S M M C-7721细胞中突变型的C D K4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变;与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08vs0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P<0.05);实验组CDK4mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11vs1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P<0.01),POLD1mRNA相应地升高(2.47±0.25vs1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P<0.01);稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03vs0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P<0.05),P125(0.54±0.04vs0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P<0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.     

细胞信号转导抑制因子-1表达下调对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的大量研究表明,内皮细胞的凋亡参与了动脉粥样硬化的发生与发展。另外有研究表明,细胞信号转导抑制因子-1(SOCS1)的表达下调可促进某些细胞的凋亡。然而,SOCS1表达下调是否与内皮细胞的凋亡有关,目前未见相关报道。为此,本研究利用RNA干扰沉默SOCS1的表达,然后观察内皮细胞凋亡的变化,探讨SOCS1与动脉粥样硬化之间的关系。方法 (1)培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cel,HUVEC),利用RT-PCR和Western Blotting检测SOCS1在HUVEC中的表达。(2)设计并化学合成4对靶向SOCS1的siRNA:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4。(3)将带有荧光标记的阴性对照siRNA配制成25、50、75、100 nmol/L的4组,利用脂质体转染细胞,并在荧光显微镜下观察转染效率,得出有最佳转染效率的浓度。(4)HUVEC根据不同的处理因素分成8组:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4和阳性对照组、阴性对照组、转染试剂组、空白对照组。将均为有最佳转染效率浓度的各组siRNA转染细胞,48小时后收获细胞。利用RT-PCR和Western Blotting,筛选出1对对SOCS1沉默效率最高的siRNA。(5)将筛选出来的沉默效率最高的siRNA和阴性对照siRNA以有最佳转染效率的浓度转染细胞,转染24小时后分为4组:①阴性对照siRNA;②阴性对照siRNA+缺氧20小时/复氧4小时;③SOCS1 siRNA;④SOCS1 siRNA+缺氧20小时/复氧4小时。最后,利用Western Blot检测Caspase3和Bax的表达,利用流式细胞仪检测凋亡。结果 (1)siRNA在50 nmol/L时有较高的转染效率。(2)4对siRNA干扰后,SOCS1的表达水平与四个对照组相比明显下调(P<0.05),其中siRNA-3的沉默效率最高(P<0.05)。(3)对HUVEC进行RNA干扰和缺氧复氧处理后,SOCS1 siRNA+缺氧复氧组的Caspase3、Bax蛋白表达水平与其它3组相比明显升高(P<0.05),阴性对照siRNA+缺氧复氧组的Caspase3、Bax蛋白表达水平与阴性对照siRNA组相比明显升高(P<0.05),阴性对照siR     

原发性干燥综合征相关间质性肺疾病患者血清活性氧、转录因子κB及转化生长因子β_1水平变化及其临床意义研究

目的观察原发性干燥综合征相关间质性肺疾病(pSS-ILD)患者血清活性氧(ROS)、转录因子κB(NF-κB)及转化生长因子β_1(TGF-β_1)水平变化,并探讨其临床意义。方法选取2015年7月—2017年6月宁夏回族自治区人民医院呼吸科和风湿科收治的女性原发性干燥综合征(pSS)患者94例,其中单纯pSS患者46例作为pSS组,pSS-ILD患者48例作为pSS-ILD组;另选取同期体检健康女性50例作为对照组。采用免疫印迹法检测抗干燥综合征A(SSA)抗体、抗干燥综合征B(SSB)抗体、抗Robert52(Ro52)抗体,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清ROS、NF-κB及TGF-β_1水平;血清NF-κB水平与pSS-ILD患者血清ROS及TGF-β_1水平的相关性分析采用Pearson相关性分析。结果 pSS组和pSS-ILD组患者抗SSA抗体、抗SSB抗体及抗Ro52抗体阳性率高于对照组(P<0.05);pSS组和pSS-ILD组患者抗SSA抗体、抗SSB抗体及抗Ro52抗体阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。pSS组和pSS-ILD组患者血清ROS、NF-κB及TGF-β_1水平高于对照组,pSS-ILD组患者血清ROS、NF-κB及TGF-β_1水平高于pSS组(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,血清NF-κB水平与pSS-ILD患者血清ROS(r=0.95)及TGF-β_1(r=0.98)水平呈正相关(P<0.05)。结论 pSS-ILD患者血清ROS、NF-κB及TGF-β_1水平明显升高,且血清NF-κB水平与血清ROS、TGF-β_1水平有关,推测ROS-NF-κB-TGF-β_1信号通路可能与pSS-ILD的发生有关。     

血小板衍生生长因子-BB通过转化生长因子-β信号系统调节大鼠血管平滑肌细胞内p21~(WAF1)表达

目的 探讨血小板衍生生长因子(PDGF)-BB是否通过诱导转化生长因子(TGF)-β_1,表达及其信号系统调节p21~(WAF1)表达.方法 采取8～9周龄雄性Sprague-Dawley大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)进行体外培养,分为对照组、中和性抗TGF-β_1抗体组(20μg/ml,抗体组)、PDGF-BB组(40 ng/ml)、PDGF-BB+中和性抗TGF-β_1抗体组(PDGF-BB+抗体组),实验时间为48 h.逆转录酶-聚合酶链式反应检测TGF-β_1mRNA的表达,ELISA方法检测TGF-β_1蛋白的表达.Western blot检测p21~(WAF1)及TGF-β信号系统下游蛋白表达,后者包括TGF-β_1I类受体(在VSMC内表现为ALK-5)、Smurf2、pSmad2/3、Smad4、Smad7.结果 PDGF-BB组的TGF-β_1 mRNA(24 h)和TGF-β_1(48 h)蛋白分子表达水平分别为(447.716±23.911)和(0.309±0.034)ng/ml,明显高于对照组(250.435±17.869)和(0.104±0.013)ng/ml(P均＜0.01).p21WAF1蛋白表达在对照组0.621±0.046和抗体组0.657±0.058之间差异无统计学意义,PDGF-BB组表达仅为0.204±0.033,与对照组和抗体组比较差异均有统计学意义(P均＜0.01),PDGF-BB+抗体组表达为0.530±0.043,与对照组和抗体组相比差异均有统计学意义(P均＜0.05),与PDGF-BB组比较差异亦有统计学意义(P＜0.01).PDGF-BB组ALK-5 0.634±0.060、pSmad2/31.894±0.184、Smad4 1.129±0.136及Smurf2 0.559±0.047的表达水平分别高于对照组和抗体组0.288±0.049和0.300±0.047、0.972±0.096和0.887±0.059、0.665±0.055和0.709±0.058、0.158±0.040和0.224±0.064(P均＜0.01),对照组与抗体组之间差异无统计学意义,以上蛋白PDGF-BB+抗体组的表达分别比PDGF-BB组低了(85±9.5)%、(79±12)%、(91±17)%和(84±5)%.Smad7蛋白表达在对照组0.461±0.035与抗体组0.458±0.031之间差异无统计学意义,PDGF-BB组0.160±0.028与对照组和抗体组比较差异均有统计学意义(P均＜0.01),PDGF-BB+抗体组0.375±0.039与PDGF-BB组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 PDGF-BB调节p21~(WAF1)的表达部分通过TGF-β_1及其信号系统.     

胃癌组织TGF-β1和TGF-βR1及其前体mRNA的表达意义

目的:探讨TGF-β1和TGF-β R1蛋白及其前体mRNA的表达与胃癌发生发展的关系.方法:采用免疫组化和实时PCR(real-time PCR)方法,对胃癌50例、萎缩性胃炎19例和正常胃黏膜18例的TGF-β1和TGF-βR1蛋白及其前体mRNA的表达进行检测.结果:胃癌组织中TGF-β1和TGF-βR1蛋白表达明显增强,其阳性率(80.0%和75.0%)明显高于正常胃黏膜组(33.3%和27.8%)及萎缩性胃炎组(36.8%和36.8%),差异有显著性(P＜0.01).胃癌组织的分化程度越低,TGF-β1、TGF-βR1蛋白表达的阳性率越高(r=35.58,P＜0.01).同样,胃癌组织中TGF-β1和TGF-βR1前体mRNA的表达明显高于萎缩性胃炎组(TGF-β1:4.20±0.51 vs 9.15±2.12.8.22±1.81;TGF-β R1:1.28±0.48 vs 5.55±1.48,4.19±0.95).结论:TGF-β1和TGF-βR1的高表达与胃癌的发生发展、生物学行为和预后可能有关.     

ET-1、TGF-β_1对大鼠肺成纤维细胞CTGF表达及细胞增殖的影响

目的探讨ET-1、TGF-β1对大鼠肺成纤维细胞结缔组织生长因子（CTGF）表达及细胞增殖的影响。方法体外培养大鼠肺成纤维细胞株,分为ET-1干预组、TGF-β1干预组、对照组,ET-1干预组加入含ET-1 10ng/mL的肺成纤维细胞专用培养基（FM培养基）1mL,TGF-β1干预组加入含TGF-β110 ng/mL的FM培养基1mL,对照组加入1mL FM培养基。各组设8 h及1、2、3、4、5 d六个时间点,ELISA法观察各组各时间点细胞上清中CTGF表达水平,用台盼蓝染色计数活细胞数,绘制细胞生长曲线,计算细胞增殖数。结果各时间点ET-1干预组、TGF-β1干预组CTGF水平均高于对照组（P均〈0.01）,且随着时间的增加表达水平呈逐步上升趋势。各组细胞数随着时间的增加呈上升趋势,ET-1干预组、TGF-β1干预组细胞数较对照组增加（P均〈0.01）。结论 ET-1、TGF-β1能够促进大鼠肺成纤维细胞CTGF的表达及肺成纤维细胞增殖。