应用重组信号蛋白14-3-3间接ELISA诊断日本血吸虫病

目的探讨重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)间接ELISA用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法表达并利用纯化的rSj14-3-3与成虫抗原(SjAWA)间接ELISA法分别检测51份急性和49份慢性日本血吸虫病患者和50份正常人血清,以上血清标本同时用SEA致敏的间接血凝试验(SEA-IHA)检测。再以3种方法检测30份华支睾吸虫感染者、24份卫氏并殖吸虫感染者和31份钩虫感染者血清,分析其交叉反应性。结果51份急性和49份慢性血吸虫病患者血清的rSj14-3-3抗体阳性率分别为98.0%和91.8%;SjAWA的检出率分别为96.1%和90.0%;IHA的阳性率分别为98.0%和93.9%。经统计学分析,以上结果无显著性差异(P>0.05)。Sj14-3-3间接ELISA、SjAWA间接ELISA和SEA-IHA对于30份华支睾吸虫感染者的交叉反应性分别为13.3%、20.0%和16.7%,24份卫氏并殖吸虫感染者分别为8.3%、12.5%和12.5%,31份钩虫感染者分别为12.9%、16.1%和12.9%。经统计学分析结果也无显著性差异(P>0.05)。结论rSj14-3-3抗原间接ELISA法诊断日本血吸虫病,具有高度的敏感性和特异性,可用于血吸虫病的免疫诊断。     

日本血吸虫信号蛋白14-3-3在毕赤酵母菌中的分泌表达及其抗原性分析

目的 在毕赤酵母菌（Pichia pastoris）表达系统中表达日本血吸虫信号蛋白14-3-3（Sj14-3-3），并与原核表达rSj14-3-3比较其抗原性。 方法 以重组质粒pET28a-rSj14-3-3为模板，PCR扩增Sj14-3-3基因，将特异片段连接到pMD18-T载体, DNA序列分析后，亚克隆目的片段Sj14-3-3至酵母菌分泌表达载体pPICZαB。测序正确后，重组质粒经电转化转染至毕赤酵母菌X-33菌株，经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达，取诱导上清进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和蛋白质印迹法(Western blotting) 分析。 用间接ELISA法比较毕赤酵母菌表达的rSj14-3-3和原核表达rSj14-3-3检测血吸虫病患者血清抗体的特异性和敏感性。 结果 目的基因已在酵母菌基因组中得到整合, PCR扩增得到约1 300 bp的片段。 经甲醇诱导，Sj14-3-3表达并分泌到培养上清中。 表达产物经SDS-PAGE 测定为 Mr 35 000。Western blotting 结果显示，Mr 35 000 蛋白可被Sj14-3-3单克隆抗体识别，表明该真核表达产物具有免疫反应性。间接ELISA检测结果表明，该重组蛋白检测36份急性血吸虫病患者血清rSj14-3-3抗体，阳性率为81％。与12份华支睪吸虫感染者血清未见交叉反应, 32份健康人血清假阳性反应率为9.3％。以原核表达的rSj14-3-3为抗原，间接ELISA检测，36份急性血吸虫病患者血清的 rSj14-3-3 抗体阳性率为88.9％；与12份华支睪吸虫感染者的交叉反应率为16.7％, 32份健康人血清假阳性反应率为12.5％，其差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论 在毕赤酵母菌中成功表达了Sj14-3-3，培养上清中产物丰度较高，且免疫反应性良好。     

华支睾吸虫成虫14～33 ku抗原诊断价值的研究

目的探讨纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原在华支睾吸虫病免疫诊断中的应用价值。方法使用SDS-PAGE和电洗提法,从可溶性华支睾吸虫成虫抗原中分离纯化14~33 ku抗原,用此抗原经ELISA方法检测华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、日本血吸虫病、姜片虫病患者血清及健康人血清特异性IgG抗体,并与粗制可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA结果相比较。结果检测63例华支睾吸虫病患者血清,纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原ELISA阳性率为76.2%,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA阳性率均为100%;检测25例卫氏并殖吸虫病、85例日本血吸虫病、27例姜片虫病患者血清,14~33 ku抗原的ELISA交叉反应阳性率分别为8.0%、3.5%、0,而可溶性成虫抗原分别为80.0%、62.4%、14.8%,可溶性成虫脱脂抗原分别为64.0%、55.3%、7.4%;检测127例健康人血清,14~33 ku抗原的ELISA假阳性率为0,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原的假阳性率分别为5.5%、3.1%。结论纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原用于华支睾吸虫病免疫诊断的特异性优于粗抗原,但敏感性较低。     

抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体,并鉴定抗体性质。方法以重组表达纯化的日本血吸虫信号蛋白14-3-3为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用酶联免疫吸附试验及免疫印迹法对获得的单克隆抗体进行类和亚类、效价、浓度、纯度、亲和常数、特异性和检测灵敏度的测定与鉴定。结果共获得6株针对日本血吸虫信号蛋白14-3-3的单克隆抗体,分别为5G9、3F1、3F7、5C6、5D1和1G6,抗体类型分别为IgG1、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG1和IgG1。对其中的单克隆抗体5G9分析显示,制备的腹水抗体效价为1∶1.28×105,亲和层析纯化后的浓度为5.3 mg/ml,纯度95%,亲和常数为5.1×107mol/L。免疫印迹试验结果表明,该单克隆抗体可与体外重组表达纯化的日本血吸虫14-3-3蛋白特异性结合,同时也能与日本血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原和成虫抗原特异性反应,而与大肠埃希菌、健康人血清和华支睾吸虫抗原均无明显交叉反应。HRP标记的单克隆抗体5G9检测14-3-3蛋白的灵敏度为31.25 ng/ml。结论本研究获得了6株能稳定分泌抗日本血吸虫14-3-3蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为建立新的日本血吸虫活动性感染检测方法奠定了良好的基础。     

rSj26-Sj32-IgM-ELISA法用于急性日本血吸虫病的诊断价值

目的探讨rSj26-Sj32-IgM-ELISA法用于急性日本血吸虫病的诊断价值。方法用纯化的rSj26-Sj32融合蛋白和日本血吸虫成虫抗原(SjAWA)建立ELISA方法,检测急性日本血吸虫病患者血清中的特异性IgM抗体,并以华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、棘球蚴病、乙型肝炎、肺结核病患者和健康人血清作对照,比较二者的敏感性、特异性和交叉反应性。结果 rSj26-Sj32-IgM-ELISA和SjAWA-IgM-ELISA检测急性日本血吸虫病患者血清特异性IgM抗体的敏感性分别为98.0%和96.0%,特异性均为97.7%;SjAWA-IgM-ELISA检测华支睾吸虫病和卫氏并殖吸虫病患者血清时存在不同程度的交叉反应,而rSj26-Sj32-IgM-ELISA则未见交叉反应。结论纯化的rSj26-Sj32融合蛋白对急性日本血吸虫病具有较高诊断价值,可用作急性日本血吸虫病的诊断抗原。     

6株抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体的鉴定及初步应用

目的对6株抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体生物学特性进行鉴定,并探讨其在血吸虫病诊断中的应用价值。方法采用酶联免疫吸附试验及免疫印迹法对6株单克隆抗体的类和亚类、腹水效价、亲和常数、检测灵敏度和特异性进行测定与鉴定。建立检测日本血吸虫感染兔血清14-3-3蛋白的Dot-ELISA方法,对感染兔吡喹酮治疗前、后不同时间的配对血清中14-3-3蛋白含量的动态变化进行观察,并通过对一批血吸虫感染兔血清样本进行检测,以评价该方法的诊断价值。结果 6株抗日本血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体3F1、3F7、5C6、5D1、5G9、1G6的抗体亚类分别为IgG1、IgG2 a、IgG2b、IgG1、IgG1和IgG1;腹水单克隆抗体效价分别为1∶6.4×105、1∶8.0×105、1∶6.4×105、1∶3.2×105、1∶4.8×105和1∶2.0×104;亲和常数分别为8.82×108、4.93×108、1.56×108、5.12×108、1.41×108mol/L和2.30×107mol/L;Dot-ELISA方法检测14-3-3蛋白的灵敏度分别为1、10、100、10、10 ng和100 ng。免疫印迹试验结果表明,6株单克隆抗体均可与体外重组表达纯化的日本血吸虫14-3-3蛋白特异性结合,同时也能与日本血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原和成虫抗原中的天然14-3-3蛋白特异性反应,而与大肠埃希菌和华支睾吸虫抗原均无明显交叉反应。以单抗3F1和5D1为检测抗体建立的Dot-ELISA方法检测日本血吸虫感染兔治疗前、后不同时间点血清,发现随着感染时间的延长,兔血清中14-3-3蛋白含量逐渐增加,吡喹酮治疗后兔血清中14-3-3蛋白含量逐渐降低。采用此Dot-ELISA方法检测42份血吸虫感染兔血清,41份阳性,敏感性为97.6%;10份健康兔血清均为阴性,特异性为100%。结论 6株单克隆抗体均能有效识别天然的日本血吸虫信号蛋白14-3-3,初步证明以单抗3F1和5D1为检测抗体建立的Dot-ELISA方法具有一定的日本血吸虫活动性感染诊断及潜在的疗效考核价值。     

rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸虫病患者的诊断价值

目的探讨rSj 26-Sj 32-HRP-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸虫病患者的诊断价值。方法利用纯化的rSj26-Sj32融合蛋白和日本血吸虫成虫抗原(SjAWA)建立HRP-IgG-Dot-ELISA检测急性日本血吸虫病患者血清,并以华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、棘球蚴病、乙型肝炎、肺结核病患者和健康人血清作对照,观察二者的检测结果。结果 rSj 26-Sj 32和SjAWA检测急性日本血吸虫病患者阳性检出率均为100%,特异性分别为95.35%和93.02%;二者均与华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病和泡型棘球蚴病患者血清存在不同程度的交叉反应。结论纯化的rSj26-Sj32融合蛋白是一种较好的免疫诊断抗原。     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的　初步探讨重组信号蛋白 14 3 3及 14 3 3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。　方法　用rSj14 3 3和rSj14 3 3 /SjGST免疫BALB/c小鼠 ,日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染 ,收集实验组与对照组成虫和虫卵 ,计算减虫率和减卵率 ;间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化 ;显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小 ,观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。　结果　上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为 3 1.93 %和 3 4.3 9% ;每克肝组织减卵率分别为 5 3 .2 4%和 60 .0 6% ,每对成虫减卵率分别为 3 3 .3 9%和 40 .48% ;免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性 ,免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组 ;实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降3 5 .2 3 %和 46.13 %。　结论　信号蛋白 14 3 3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用 ,复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的初步探讨重组信号蛋白14-3-3及14-3-3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。方法用rSj14-3-3和rSj14-3-3／SjGST免疫BALB／c小鼠，日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染，收集实验组与对照组成虫和虫卵，计算减虫率和减卵率；间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化；显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小，观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。结果上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为31．93％和34．39％；每克肝组织减卵率分别为53．24％和60．06％，每对成虫减卵率分别为33．39％和40．48％；免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性，免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组；实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降35．23％和46．13％。结论信号蛋白14-3-3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用，复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。     

重组Sj-Ts4样蛋白在日本血吸虫病免疫诊断中的初步应用

目的 评价重组Sj-Ts4样蛋白对日本血吸虫病的诊断价值.方法 取血吸虫病患者(急性、慢性、晚期)血清74份、华支睾吸虫病患者血清24份、钩虫病患者血清8份和健康人血清30份,利用纯化、重组rSj-Ts4样蛋白和日本血吸虫成虫抗原(SjAWA),采用ELISA法分别检测血清中抗,Sj-Ts4样蛋白特异性抗体和SjAWA抗体,比较两种检测方法的敏感性和特异性.结果 rSj-Ts4-ELISA和SjAWA-ELISA法检测急性、慢性和晚期血吸虫病患者血清的阳性率分别为97.1%(33/34)、100.0%(16/16)、87.5%(21/24)和100.0%(34/34)、100.0%(16/16)、75.0%(18/24),经校正X2检验,两种检查方法比较差异无统计学意义(x2=1.23.P＞0.05);健康人血清两种检测方法的假阳性率分别为6.7%(2/30) 3.3%(1/30),经校正x2检验,差异无统计学意义(X2=0.35,P＞0.05);华支睾吸虫患者和钩虫病患者血清阳性率分别为12.5%(3/24)、20.8%(5/24)和12.5%(1/8)、37.5%(3/8),经校正x2检验,两种检查方法比较差异无统计学意义(x2值分别为0.60、1.33,P＞0.05).结论 rSj-Ts4样蛋白作为抗原,对免疫检测日本血吸虫病患者血清中的抗体具有较好的敏感性和特异性,对日本血吸虫病患者的诊断有较大的应用价值.     

RT-PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因用于慢性日本血吸虫病诊断的研究

目的探讨RT-PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因用于慢性日本血吸虫病诊断的价值。方法从慢性日本血吸虫病患者血清中提取总RNA,用RT-PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因,以1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,同时以华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、泡型包虫病、囊型包虫病、乙型肝炎、肺结核患者血清和健康人血清作为对照。结果 RT-PCR扩增出约400 bp的Sj14-3-3抗原编码基因片段,但未扩增出676 bp的Sj26和1 270bp的Sj32抗原编码基因片段。对照组呈阴性反应。结论 RT-PCR扩增Sj14-3-3抗原编码基因可用于慢性日本血吸虫病的基因诊断。     

RT-PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因诊断急性日本血吸虫病的初步研究

目的探讨RT PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14 3 3抗原编码基因用于急性日本血吸虫病患者的诊断价值。方法从急性日本血吸虫病患者血清中提取总RNA,利用RT PCR方法扩增Sj26、Sj32和Sj14 3 3抗原编码基因,用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,同时以华支睾吸虫病患者血清、卫氏并殖吸虫病患者血清和正常人血清总RNA作为对照。结果50份急性日本血吸虫病血清均通过RT PCR扩增出了400bp的Sj14 3 3抗原编码基因片段,但未扩增出676bp的Sj26和1 270bp的Sj32抗原编码基因片段;对照组呈阴性反应。RT PCR扩增Sj14 3 3抗原编码基因片段敏感性和特异性均为100%,与华支睾吸虫病和卫氏并殖吸虫病患者血清未见交叉反应。结论RT PCR扩增Sj14 3 3抗原编码基因可用于急性日本血吸虫病的基因诊断。     

重组Sj26(rSj26)抗原免疫酶测定新方法诊断日本血吸虫病的研究

将日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)和重组Sj26(rSj26)抗原致敏的硝酸纤维素膜片(NCD)用于膜片免疫酶测定(D-IEA),分别检测同批日本血吸虫病人、卫氏并殖吸虫病人、华支睾吸虫病人和健康人血清104例的特异性抗体,同时用目测及光密度(OD)值测定两种方法判断反应结果。结果显示,分别采用上述两种抗原检测所获的阳性率或假阳性率间无显著性差异。此结果首次提示rSj26抗原的血清诊断效果与目前血吸虫病血清学方法常用抗原SEA相似。本文报告的免疫酶测定新方法,可同时采用两种方法判断结果,迄今尚未见到类似报道。试验结果均表明用D-IEA检测时显示高度的敏感性(92.1％—94.7％)和特异性(0.0％—2.9％),具有实用价值。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的纯化及抗体制备

目的制备日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白Sj14-3-3的多克隆抗体与单克隆抗体。方法将合Sj14-3-3重组蛋白的凝胶条带冻干磨粉,免疫家兔,制备抗Sj14-3-3多克隆抗血请;用电洗脱纯化的Sj14-3-3免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗Sj14-3-3单克隆抗体。测定所得抗体效价及特异性鉴定。结果获得大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64。获得1株能稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞株4D9,单抗亚类为IgG1。此株单抗能与重组Sj14-3-3蛋白发生特异性反应。结论获得了高度敏感、特异的抗Sj14-3-3多克隆抗血清及稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞。     

rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响

目的　探讨日本血吸虫信号蛋白 14 - 3- 3基因重组蛋白 (rSj14 - 3- 3)及其与谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(rSj14 - 3- 3/SjGST)对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。 方法　用rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST免疫雌性BALB/c小鼠 ,末次免疫后 5d ,各组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 4 0± 1条 /鼠 ,6周后 ,剖杀 ,取肝组织计数肝表面虫卵结节密度和肝切片上单个虫卵肉芽肿直径大小。结果　免疫组 (14 - 3- 3组和 14 - 3- 3/GST组 )和对照组肝表面虫卵结节数分别为 6 72±1 14、5 89± 1 0 3和 2 1 0 5± 1 2 6 ,前两者比后者分别减少了 6 8 0 8%和 72 0 2 % ;肝肉芽肿平均直径免疫组为 178 12±32 18μm和 14 8 13± 2 9 6 5 μm ,与对照组 2 75 0 0± 38 2 1μm相比分别减少了 35 2 3%和 4 6 13%。结论　重组抗原rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST对日本血吸虫具有较好的抗病效果。     

日本血吸虫病患者尿液中循环抗原和抗体联合检测的诊断价值

[目的 ]探讨尿液中血吸虫循环抗原和抗体检测对日本血吸虫病的诊断价值。 [方法 ]用单克隆抗体夹心 ELISA法检测日本血吸虫病患者尿液中循环抗原 ,间接ELISA检测尿液中特异性抗体。 [结果 ]10例急性血吸虫病和 6 1例慢性血吸虫病患者尿液中循环抗原的阳性率分别为 6 0 %和 40 % ,特异性抗体的阳性率分别为 80 %和 6 1 7%。两者联合检测的总阳性率分别为 10 0 %和 71 7%。 10 0例健康对照者尿液中仅 3%出现假阳性。 [结论 ]检测尿液中日本血吸虫循环抗原和特异性抗体简便、实用 ,为一种非损伤性的血吸虫病诊断方法。