野生型p53基因转移对体外培养的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及其机制的研究

正确构建了的介导野生型ｐ５３基因转移的复制缺陷型重组腺病毒，将其感染体外培养的兔血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ），结果表明腺病毒能介导野生型ｐ５３基因高效地转移和表达，对ＶＳＭＣ的增殖具有明显的抑制作用；应用电镜、流式细胞计数仪、原位末端标记等方法，探讨野生型ｐ５３基因抑制ＶＳＭＣ增殖的机制。结果显示ｐ５３基因转移可有效地导致ＶＳＭＣ明显的Ｇ１期阻滞及大量凋亡，为高血压病、动脉粥样硬化、ＰＴＣＡ术后再狭窄等疾病的基因治疗提供了实验依据     

腺病毒介导的p53抑制肝癌生长的实验研究

目的探讨外源性野生型Ｐ５３（Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｐ５３, ＷＴ－ｐ５３）基因对肝癌细胞生长的影响。方法通过表达ＷＴ－ｐ５３的重组腺病毒载体（Ａｄ－ｐ５３）,将ｐ５３基因导入肝癌细胞株中,用ＭＴＴ法检测Ａｄ－ｐ５３对各细胞株生长特性的影响,流式细胞仪分析各组细胞中ＤＮＡ含量及凋亡的比例。建立裸小鼠移植瘤模型后,瘤内注射Ａｄ－ｐ５３。最后处死动物,移植瘤称重, ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ｐ５３和ｐ２１蛋白的表达情况。结果外源性ｐ５３基因的导入可导致肝癌细胞生长的明显抑制,表现为既诱导细胞凋亡,又诱导细胞周期阻滞。瘤内注射Ａｄ－ｐ５３后移植瘤生长明显受抑制,并出现瘤组织中ｐ５３和ｐ２１蛋白表达的上调。结论腺病毒介导的ｐ５３基因治疗能有效控制肝癌的生长。     

外源性野生型p53基因对人肺癌细胞生长的抑制

目的观察外源性野生型ｐ５３基因对有ｐ５３基因突变的人肺癌细胞系生长的影响。方法用多聚酶链反应单链构象多态性及ＤＮＡ测序，选择ｐ５３基因突变的人肺巨细胞癌系８０１Ｄ为受体细胞。构建野生型ｐ５３表达质粒ＰＺＩＰｎｅｏＳＶｐ５３。用基因枪介导外源基因。建立转染细胞系８０１Ｄｐ５３。用聚合酶链反应检测外源基因，观察转染细胞恶性生长的变化。结果转染细胞系８０１Ｄｐ５３体外长期传代有ｎｅｏ基因及外源ｐ５３基因存在，转染细胞生长明显受到抑制，克隆形成抑制率达９６％，裸鼠异种移植致瘤性降低，肿瘤生长明显缓慢。结论外源性野生型ｐ５３经基因枪导入有ｐ５３基因突变的人肺癌细胞后可长期存在于转染细胞中，且明显抑制转染细胞的恶性生长     

体外转染野生型p16基因对兔血管平滑肌细胞生长的抑制作用

目的 :研究体外转染外源性野生型 p16基因对兔血管平滑肌细胞生长的影响。　　方法 :构建野生型 p16基因的重组逆转录病毒载体 ,并体外转染兔血管平滑肌细胞 ,应用 Northern blot及 Westernblot检测外源 p16基因的表达 ,并用四唑盐 ( MTT)法及流式细胞仪检测其对细胞生长的抑制作用。　　结果 :逆转录病毒载体可有效地将外源性 p16基因导入平滑肌细胞 ,表达 P16蛋白 ,并显著抑制血管平滑肌细胞的生长使细胞滞留于 G1 期。　　结论 :体外转染外源性野生型 p16基因可有效抑制血管平滑肌细胞的生长。     

野生型P53基因导入诱导血管平滑肌细胞凋亡

为观察野生型P53基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的现象，探讨对生型P53基因导入抑制平滑肌细胞增殖的作用机理，构建了野生型P53基因的重组腺病毒载体，体外转染兔主动脉血管平滑肌细胞。应用流式细胞议分析细胞周期，氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入试验检测DNA合成，琼脂糖凝胶电泳观察DNA区带图谱，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术原位检测细胞凋亡。结果发现，野生型P53基因重组腺病毒载体转梁平滑肌细胞后，细胞内DNA合成减少。流式细胞仪分析显示77％的平滑肌细胞生长停滞在G0／Gl期，约45％的细胞发生细胞凋亡。dUTP切口末端标记阳性细胞百分率为40％～50％。DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈现阶梯状区带图谱。以上结果提示，野生型P53基因通过诱导细胞凋亡对血管平滑肌细胞增殖起抑制作用。     

腺病毒介导的野生型p53基因转移致血管平滑肌细胞凋亡

曾报告腺病毒介导的野生型ｐ５３基因转移能明显抑制体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）的增殖，为探讨ｐ５３基因抑制ＶＳＭＣ增殖的机制，应用电镜、流式细胞计数仪、原位末端标记等方法，观察ｐ５３基因转移对ＶＳＭＣ凋亡的影响。结果证明ｐ５３基因转移可有效地导致ＶＳＭＣ发生凋亡，从而进一步为心血管疾病基因治疗的研究提供可靠的实验依据     

外源野生型p53基因表达对人肺癌细胞药物敏感性影响及其机制研究

目的 了解外源野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）基因表达对人大细胞肺癌８０１－Ｄ细胞对化疗药物敏感性的影响。方法 脂质体地构建的含ｗｔｐ５３基因载体转染８０１－Ｄ细胞，经ＰＣＲ检测外源ｗｔｐ５３在宿主细胞存在情况，流式细胞术（ＦＡＣＳ）确认其功能活性。＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定８０１－Ｄ细胞转染ｗｔｐ５３后药物敏感性变化；ＤＮＡ断裂和形态学方法分析药物作用后细胞死亡方式。结果 脂质体介异转染ｗｔｐ５３的８０     

野生型p53基因转移对血管内膜损伤后再狭窄的防治作用

为防止血管成形术后管腔再狭窄，我们构建了介导野生型ｐ５３基因转移的复制缺陷型重组腺病毒（Ａｄ－ｐ５３），将Ａｄ－ｐ５３感染日本大耳兔球囊损伤后的髂动脉，并通过携带ＬａｃＺ基因重组腺病毒感染观察基因转染效率。结果可见Ａｄ－ｌａｃＺ感染损伤后的动脉３天后血管内膜、中膜、外膜均有ＬａｃＺ基因的阳性表达；Ａｄ－ｐ５３感染损伤后的髂动脉２周后可见血管内膜增厚程度、内膜与中膜的比例明显减小，管腔狭窄程度明显减轻，ｐ５３蛋白大量表达，与对照组相比具有显著差异。证明野生型ｐ５３基因转移能明显抑制血管损伤后的内膜增殖，为野生型ｐ５３基因转移防治血管内膜损伤后再狭窄奠定了实验基础。     

重组腺病毒载体介导HOSM 基因对胰腺癌细胞PC3体外增殖的抑制作用

目的构建了含人抑瘤素M（HOSM）基因的复制缺陷型重组腺病毒载体AD-HOSM,观察其对人胰腺癌细胞株PC3在体外生长抑制情况。方法通过同源重组方法构建含HOSM基因的缺陷型腺病毒载体AD-HOSM,报告基因AD-GFP检测腺病毒的对胰腺癌细胞系的转染效率;人胰腺癌细胞株PC3转染含HOSM基因的缺陷型腺病毒载体AD-HOSM后,用RT-PCR法检测外源HOSM基因在其中的表达;台盼兰染色、细胞计数法检测AD-HOSM对PC3的体外增殖抑制情况。结果成功构建了重组腺病毒载体AD-HOSM,AD-HOSM对胰腺癌细胞PC3有较高的转染效率,HOSM基因在转染细胞能有效的表达。体外试验示AD-HOSM明显抑制PC3的的生长。结论重组腺病毒介导HOSM表达能有效抑制PC3在体外的增殖,提示重组腺病毒介导的HOSM基因治疗可能成为胰腺癌治疗的候选方案。     

腺病毒介导的CIAPIN1基因对肺癌细胞生长和细胞周期的影响

目的 以重组腺病毒载体介导细胞因子诱导的凋亡抑制分子1(cytokine induced apoptosis inhibitor 1,CIAPIN1)基因转染人肺腺癌细胞系A549,观察并鉴定该基因在腺癌细胞中的表达及其对细胞生长和细胞周期的影响.方法 构建腺病毒载体介导CIAPIN1基因(Ad-CIAPIN1),转染到低水平表达CIAPIN1的人肺腺癌细胞系A549,采用Western blot检测目的蛋白的表达;台盼蓝染色计数活细胞数,绘制细胞生长曲线;流式细胞术(FCM)分析细胞周期及细胞凋亡的变化.结果 外源性CIAPIN1基因在A549肺癌细胞获得高水平的表达;CIAPIN1能显著抑制A549的生长(P＜0.01);流式细胞仪检测显示肺癌细胞发生凋亡,并出现明显的G1/S期阻滞现象.结论 以腺病毒为载体介导CIAPIN1基因在A549细胞内表达,可发挥抑制细胞生长、诱发细胞凋亡及参与细胞周期调控的作用.提示Ad-CIAPIN1基因可能在人肺癌基因治疗中发挥重要作用.     

重组人p53腺病毒感染对携带不同p53状态胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究重组人p53腺病毒感染不同p53状态胃癌细胞对其p53蛋白表达、生长抑制率、细胞周期与凋亡率的影响。方法不同浓度重组人p53腺病毒感染3种不同p53状态胃癌细胞,即含野生型p53基因的细胞(wild-type)、含突变型p53基因的细胞(mutant-type)、含空载质粒即p53基因缺失的细胞(vector-cell)。48 h后,用Western blotting法检测p53蛋白在3种胃癌细胞中的表达;用MTT法测定重组人p53腺病毒感染3种胃癌细胞的生长抑制率,用流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率。结果rAd-p53感染3种胃癌细胞48 h后p53蛋白表达阳性,对照组p53基因缺失的胃癌细胞无表达,对照组含野生型p53基因的细胞和含突变型p53基因的细胞弱表达。rAd-p53对3种胃癌细胞的生长抑制效应在一定的浓度范围内呈剂量依赖性,而与细胞内在的p53状态无关。含野生型p53基因的细胞、含突变型p53基因的细胞和p53基因缺失的细胞感染rAd-p53后诱导G2/M期阻滞与细胞凋亡率分别增加2.5、3.6、3.2倍。结论腺病毒介导p53基因感染3种不同p53状态胃癌细胞改变细胞内在的p53状态,p53蛋白表达、生长抑制率、细胞周期分布、凋亡率均与细胞内在的p53状态无关。     

野生型P53基因诱导血管平滑肌细胞P21基因表达

为研究野生型P53基因导入诱导血管平滑肌细胞P21基因的表达，探讨P53基因调节细胞周期进程的作用机理，体外培养了人脐动脉平滑肌细胞。将野生型P53基因导入细胞后，应用逆转录－聚合酶链反应半定量测定P21mRNA水平，以免疫组织化学法观察P21蛋白表达的变化，并用流式细胞术分析细胞周期。结果发现，正常生长的血管平滑肌细胞中P21mRNA水平较低，用免疫组织化学法检测不到P21蛋白。野生型P53基因导入并在平滑肌细胞中表达后，显著增加了P21mRNA水平，在免疫组织化学检测中呈现很强的阳性显色反应、引起平滑肌细胞停滞在G0／G1期。以上结果提示，野生型P53基因通过诱导P21基因表达调控血管平滑肌细胞周期。     

转染p53基因对培养的人动脉平滑肌细胞的影响

目的:探讨转染野生型p53(wtp53)基因对培养的人动脉平滑肌细胞(HASMCs)的影响,为冠状动脉支架内再狭窄的治疗提供新的思路。方法:以Lipofectamine 2000脂质体介导wtp53基因转染HASMCs株后,用免疫组化染色法检测转染wtp53基因后,其编码蛋白在HASMCs中的表达。绘制wtp53基因转染后HASMCs的增殖曲线。用WST-1法测定A值,并计算细胞生长的抑制率。用流式细胞仪检测wtp53基因转染对HASMCs凋亡的影响。结果:免疫组化染色法显示,wtp53基因转染后,在HASMCs的细胞核内高表达;wtp53基因的表达可抑制HASMCs的体外生长。HASMC/wtp53细胞的生长曲线较对照组明显降低;WST-1法显示,HASMC/wtp53的细胞活力与对照组相比有显著性差异(P0.05)。流式细胞仪检测显示,转染wtp53基因的HASMCs的凋亡率达40%以上,显著高于对照组。结论:转染wtp53基因对HASMCs具有明显的抑制和凋亡作用,提示wtp53基因转染HASMCs技术有可能为人冠状动脉支架内再狭窄的治疗提供一种新的防治策略与手段。     

组织因子途径抑制物基因转移对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的研究组织因子途径抑制物基因转移对兔血管平滑肌细胞迁移的影响,探讨其抑制再狭窄的机制。方法将含有人组织因子途径抑制物基因的重组腺病毒和含β-半乳糖苷酶基因的重组腺病毒在体外分别转染兔血管平滑肌细胞,用X-gal染色法检测腺病毒的转染率,用逆转录聚合酶链反应方法检测转染后平滑肌细胞中组织因子途径抑制物mRNA的表达,于第13、、5及7天用玻片法检测血管平滑肌细胞迁移距离。结果感染指数为100,腺病毒的转染率可达到95%;基因转移后3天在血管平滑肌细胞中检测到组织因子途径抑制物mRNA的表达;同一浓度下转染组织因子途径抑制物基因重组腺病毒组和对照组相比迁移距离显著减少(P<0.001),并具有浓度依赖性。结论腺病毒具有较高的转染培养的血管平滑肌细胞的能力,组织因子途径抑制物基因转移能够显著抑制体外培养的兔血管平滑肌细胞迁移,并且这种抑制作用具有浓度依赖性。     

外源性P~(53)和Rb基因对血管平滑肌细胞迁移的影响

为研究外源性Ｐ５３和Ｒｂ基因对血管平滑肌细胞迁移的影响,体外培养人脐动脉平滑肌细胞,将Ｐ５３基因和Ｒｂ基因重组腺病毒载体转染平滑肌细胞７２ｈ后,检测平滑肌细胞的迁移。结果显示,对照组平滑肌细胞的迁移距离为０．８４±０．３６ｃｍ（Ｘ±Ｓ）,而Ｐ５３基因转染组和Ｒｂ基因转染组的细胞迁移距离分别为０．５３±０．４５ｃｍ和０．３７±０．２９ｃｍ,显著低于对照组（Ｐ＜０．０５,Ｐ＜０．００１）。提示外源性Ｐ５３基因和Ｒｂ基因导入可显著抑制血管平滑肌细胞迁移     

p16-INK4alpha重表达对人食管癌细胞系EC109生长的抑制作用

目的探讨用腺病毒介导野生型的p16基因在食管癌细胞系表达,研究重表达野生型p16基因对食管癌细胞系EC109生长的抑制作用,为寻找食管癌致癌机制的研究及其基因治疗提供理论基础.方法用基因重组技术,将pcDNA3-p16中的野生型p16基因用Kpn I/BamH I进行双酶切,克隆入腺病毒表达载体pAdCMV中,将重组质粒pad-CMV-p16与腺病毒质粒JM17用Lipofectamime 2000共转染293细胞,产生重组腺病毒.用重组腺病毒感染人食管癌细胞系EC109,在感染后的不同时段,用免疫荧光、打点杂交方法检测p16基因在细胞中的表达用MTT法及流式细胞仪观察p16基因的表达对食管癌细胞株生长的影响.结果经酶切鉴定野生型p16基因克隆入腺病毒表达载体中,与JM17共转染293细胞后,可产生具有感染活性的重组腺病毒,用重组腺病毒感染食管癌细胞株EC109细胞后,可抑制食管癌细胞的生长,同对照组相比其最大抑制率可达52.7%.Multipcycle分析软件分析对细胞周期影响表明,处于G0～G1期的细胞为41%～63%感染后的细胞经Dot blot和Westernblot杂交证实,有外源的p16mRNA及蛋白的表达.结论重组腺病毒可将野生型p16基因导入人食管癌细胞系EC109中,野生型p16基因在p16基因功能缺失的细胞中重表达能抑制癌细胞恶性生长.p16基因功能缺失是食管癌致癌因素之一