乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5在酵母细胞中的表达

目的：在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5（PS1TP5）。方法：以HepG2细胞来源的mRNA为模板，经RT-PCR法扩增PS1TP5基因，克隆到pGEM-T载体中，并测序鉴定，酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中，并转化酵母AH109，色氨酸缺陷型培养基（SD／-Trp）上筛选阳性菌落，提取酵母蛋白质，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和Western免疫印迹分析，以明确PS1TP5是否可在其中表达。结果：成功扩增出PS1TP5，测序鉴定符合基因库报告序列，酶切回收的PS1TP5基因片段成功克隆人酵母表达载体pGBKT7，并转化人酵母细胞AH109中，Western免疫印迹显示该基因在酵母细胞中成功表达，表达产物相对分子质量为36950。结论：成功构建了PS1TP5酵母表达载体，并在酵母细胞中表达。     

丙型肝炎病毒NS3基因酵母表达载体构建及表达

目的　为探讨丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3的功能 ,在真核生物酵母细胞中表达HCVNS3基因。方法　用聚合酶链反应 (PCR)的方法以HCV全长质粒pBRTM/HCV 1为模板扩增HCVNS3基因 ,克隆到 pGEM T载体中 ,双酶切后回收连接到酵母表达质粒 pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质 ,进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析。结果　成功构建HCVNS3基因酵母表达载体 ,Western免疫印迹显示了HCVNS3在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在 ,相对分子质量为 70 0 0 0。结论　HCVNS3蛋白在酵母中表达成功。     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2基因在酵母细胞中的表达

目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCV FTP2基因.方法以HepG2细胞来源的mRNA作为模板,经过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV FFP2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot免疫印迹分析.结果成功构建HCV FTP2基因酵母表达载体,Western blot免疫印迹显示HCV FTP2基因在酵母细胞中表达成功.表达产物相对分子质量27kD.结论HCV FTP2在酵母中表达成功.     

HBV X基因-HCV C基因cDNA融合基因真核表达载体的构建及其表达

目的：构建HBV X-HCV C融合基因真核表达载体，并获得稳定表达该基因的HepG2细胞株。方法：双酶切质粒pXT1-X，得到完整的HBV X基因片段后，将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCVC的相应酶切位点，得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C；再将质粒RBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达。结果：质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达。结论：成功构建HBV X-HCVC融合基因真核表达载体，并获得稳定表达该基因的HepG2细胞株。     

乙型肝炎病毒preS1基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建含preS1基因真核表达质粒，探讨乙型肝炎病毒preS1基因在HBV入胞机制中的作用。方法：PCR法扩增含EcoR I与Pst I酶切点的preS1基因序列，PAS2-1载体及preS1基因PCR产物双酶切，经T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM105，对重组质粒经序列测定，命名为PAS 2—1—preS1。经乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母茵AH109，Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。结果：已构建的质粒PAS2—1-preS1经序列测定合有完整的preS1基因片段，转入酵母后经Western Blot证实酵母细胞正确表达preS1-BD融合蛋白。结论：PAS2—1—preS1的构建为通过酵母双杂交体系筛选体内与preS1蛋白相互作用的preS1相关蛋白，为进一步深入探讨preS1在HBV致病机制中的作用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒囊膜蛋白前前-S至前S2区自激活功能的初步研究

目的构建含乙型肝炎病毒（HBV）囊膜蛋白的前前-S至前S2区酵母细胞表达质粒,以重组质粒转化酵母细胞后的自激活作用来探讨靶区域表达蛋白是否具有反式激活作用。方法用多聚酶链反应法扩增含前前-S区的前-S2基因序列,定向克隆于pDEST32载体,经序列测定,重组质粒命名为pDEST32-pS2。用乙酸锂转化法将重组质粒转化酵母菌MaV203,经Western blot法验证重组质粒在酵母细胞中的表达。按酵母双杂交法将重组质粒和载体pDEST22共同转入酵母细胞MaV203,并在SC/-Leu/-Trp/-His三缺培养基及不同浓度梯度3AT培养基中生长,判断靶区域编码蛋白是否具有自激活功能。结果重组质粒pDEST32-pS2经序列测定含有HBV自前前-S至前-S2基因序列,Western blot法证实转染重组质粒的酵母细胞可表达前S1和前S2蛋白。将pDEST32-pS2与pDEST22共转染MaV203,证实被转染酵母细胞不能在浓度为28mM的3AT培养基中生长。结论构建了pDEST32-pS2表达载体,pDEST32-pS2可在酵母细胞中表达部分囊膜蛋白,前前-S区至前S2区域编码的部分表面抗原可能具有较弱的反式激活作用,可以被3AT所抑制。     

乙型肝炎病毒前S1结合蛋白的筛选和鉴定

目的利用酵母双杂合体系筛选HBV前S1结合蛋白,进一步探讨前S1蛋白在HBV感染中的作用。方法PCR扩增HBV前S1基因序列,根据酵母双杂合体系构建饵质粒pAS2-1- preS1,并测定序列;饵质粒转化入酵母菌AH109,Western印迹法证实前S1-BD融合蛋白在酵母细胞中的正确表达。pAS2-1-preS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞,通过选择性培养及β-半乳糖苷酶活性测定筛选阳性菌落,分离实验排除假阳性克隆,扩增阳性克隆的目的基因并测定序列,查询其同源序列,行交合实验进一步证实目的蛋白同前S1蛋白在酵母细胞中能否特异性结合。结果成功构建pAS2-1-preS1饵质粒,Western印迹法证实转化饵质粒的酵母细胞能正确表达前S1- BD融合蛋白,pAS2-1-preS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养出101个菌落,经β-半乳糖苷酶活性测定及分离实验后筛选出1个阳性克隆,其cDNA插入片段与丝裂原活化蛋白激酶-胞外信号调节蛋白激酶(MAPK-ERK)激酶1(MEK1)基因高度同源。交合实验证实MEK1同前S1蛋白在酵母细胞中可特异性结合。结论酵母双杂合体系证实MEK1可能是一个前S1结合蛋白。     

乙型肝炎病毒X基因的蛋白产物对HLA-DR表达的效应

目的 了解HBVX基因蛋白产物对HLA-DR表达的效应。方法 用野生型HBVX基因与真核载体质粒构建重组表达载体质粒pWHXⅡ转染HepG2细胞。用PCR、Southern印迹，ELISA及Western印迹等分析鉴定目的基因DNA片段与其在转染细胞中的表达产物HBVX蛋白，将带重组质粒pWHXⅡ的HepG2细胞的和带有HBV全基因组的2.2.15细胞，在相同条件下用间接免疫荧光分析和免疫酶细胞化学技术检测。结果 在转染的HepG2细胞和2.2.15细胞表面均清晰地显示有HLA-DR表达，而对照组即不带质粒或只带载体质粒的HepG2细胞则用同法不能在其表面检出HLA-DR的存在。结论 证明HBVX蛋白能在无炎症和外界因素存在下，单独诱导HLA-DR的表达，提示HBVX蛋白有参与乙肝免疫反应机制的可能性。     

乙型肝炎病毒核心抗原诱饵载体的构建及酵母表达

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原真核表达载体,并在酵母细胞中进行表达. 方法 以实验室保存质粒为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增HBcAg基因,克隆到pGEM-T载体.测序正确后酶切并连接至酵母表达载体pGBKT7中,转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp/Kana)上筛选阳性菌落后大量表达并提取重组蛋白,再进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果 成功构建酵母表达载体pGBKT7-HBcAg,Western blot结果显示重组蛋白在酵母细胞中正确表达.结论 利用真核表达载体在酵母细胞中成功表达HBcAg蛋白,为研究HBV合并代谢性疾病的机制奠定了基础.     

弓形虫SAG2基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究

目的 在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中表达弓形虫SAG2基因,探索一种新的有效活化机体抗弓形虫免疫反应的疫苗。方法 以重组质粒pET23a-SAG2为模板,亚克隆目的片段SAG2至酵母菌分泌表达载体pPICZαA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blot）分析。以整体重组酵母菌作为疫苗腹腔免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的免疫反应。结果 成功构建了pPICZαA-SAG2毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为22 ku的蛋白。Western blot显示,22 ku蛋白可被抗-His标签抗体识别。结论 在毕赤酵母菌中成功表达了SAG2基因。整体重组酵母活菌具有免疫原性。     

乙型肝炎病毒e抗原真核表达载体的构建及在酵母中的表达

为探讨乙型肝炎病毒(HBV)e抗原(HBeAg)的功能，用多聚酶链反应(PCR)的方法以HBV ayw亚型全序质粒pCP10为模板扩增HBeAg基因，克隆到pGEM—T载体中扩增并测序，鉴定符合GenBank报告序列。用EcoRI和Pstl双酶切后回收片段，连接到真核表达载体pGBK17中并转化酵母AH109，在色氨酸缺陷型培养基(SD／—Trp)上筛选阳性菌落。提取阳性酵母菌的蛋白质，进行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和Western免疫印迹分析，显示HBeAg基因在酵母细胞中表达，表达产物在胞内存在，相对分子质量(MT)为43000左右。     

酵母双杂交筛选肝细胞中乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白基因

目的筛选并克隆人肝细胞中与HBsAg中蛋白(MHBs)相互作用肝细胞蛋白的基因,探讨MHBs的生物学功能。方法应用PCR法以HBV adr亚型全序质粒A7为模板扩增MHBs基因,克隆到pGEM-T载体中扩增并测序鉴定,EcoR I和BamH I双酶切后回收连接到酵母表达载体pGBWT- 7中并应用酵母双杂交系统3,构建MHBs诱饵质粒并转化酵母AH109,与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖苷酸上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌氨苄青霉素-LB平板上,选择并测序结果在GenBank中进行生物信息学分析。结果构建MHBs酵母细胞表达载体,配合后筛选出既能在四缺培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)上培养也能在铺有X-α-半乳糖苷酸的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落2个,其中一个克隆为人醛缩酶B、另一个克隆为未知功能基因,新基因命名为MBP1。结论扩增出MHBs基因,用酵母双杂交技术筛选出2个与MHBs相互作用的肝细胞结合蛋白编码基因,为阐明MHBs的生物学功能及HBV损害肝细胞、致癌等方面的作用提供了新线索。     

乙肝病毒PreS2基因在大肠埃希菌中的表达

目的在大肠埃希菌(Escherichiacoli)中表达乙肝病毒前S2(HBVPreS2)蛋白,并对其进行鉴定和纯化。方法利用DNA重组技术,将全长的HBVPreS2基因克隆至pMAL-C2x[融合表达载体含麦芽糖结合蛋白(maltosebindingprotein,MBP)标签蛋白]质粒中,构建pMAL-C2/S2表达载体,转化至E.coli,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式,依据其不同的表达形式采取适当的纯化方案,纯化产物经Westernblot和ELISA法检测反应原性,经Xa因子切割去除MBP标签蛋白。结果成功构建了表达载体pMAL-C2/S2,目的蛋白为PreS2-MBP,以包涵体和可溶性2种形式表达。纯化产物能与anti-HepatitisBvirusPreS2Antigen发生特异性反应。融合蛋白经Xa因子切割去除了MBP标签蛋白。结论在E.coli中成功表达了HBVPreS2蛋白,为进一步研制新型HBV预防及免疫治疗制剂打下了基础。     

乙型肝炎病毒前S2蛋白结合蛋白基因的筛选

目的 筛选并克隆人肝细胞中与乙型肝炎病毒前S2蛋白（HBVPreS2)相互作用的蛋白质基因。方法 用聚合酶链反应（PCR）技术扩增HBVPreS2基因，连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落，PCR从中扩增出目的片段并测序，进行生物信息学分析。结果 成功克隆出HBVPreS2基因并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在4缺（SD/-Trp-Leu-SAde-His)培养基又能在铺有X-α-半乳糖（X-α-gal)的4缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落26个，其中含金属硫蛋白A2基因的菌落有12个，细胞色素C氧化酶Ⅱ有1个，细胞色素P450IVF亚基2个，细胞色素C氧化酶Ⅳ亚基同功酶1有2个，人血白蛋白3个，Na^ -K^ ATP的β1亚基1个，前清蛋白2个，植物血凝素半乳糖苷结合亚基1个，未知基因2个，结论 成功克隆出HBVPreS2蛋白的结合蛋白，为进一步研究HBVPreS2的作用提供了新线索。     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因克隆、表达与鉴定

目的 对刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶基因（NTPase）进行克隆、表达和鉴定。 方法 采用PCR扩增刚地弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM?-T Easy载体，经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB，并转入大肠埃希菌(E.coli)BL21（DE3）中进行诱导表达。用镍-次氮基三乙酸亲和层析柱纯化重组质粒pBAD-HisB-NTPase表达产生的含组氨酸的重组蛋白，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析蛋白表达产物。 结果 PCR扩增得到特异的刚地弓形虫NTPase-Ⅱ基因序列，经测序鉴定无基因突变。SDS-PAGE结果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coli BL21（DE3）中获得高效表达，其融合蛋白相对分子质量（Mr）约70 000，与理论值相近。Western blotting分析结果显示，纯化的重组蛋白可被弓形虫感染的鼠血清及鼠抗重组蛋白血清识别。 结论 所克隆表达的弓形虫NTPase-Ⅱ重组蛋白具有良好的抗原性。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

目的构建含弓形虫主要表面抗原P30与致密颗粒蛋白ROP2复合基因重组质粒,并在毕赤酵母中表达、纯化与鉴定。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入表达载体,构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-ROP2;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌大量摇瓶表达,纯化产物,免疫活性鉴定。结果获得pGAPZαA-P30-ROP2重组表达载体,SDS-PAGE和Western Blot结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kD,具有一定的免疫活性。结论弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中成功分泌表达,表达产物具有免疫活性,为弓形虫病诊断抗原及疫苗研制奠定基础。     

粪肠球菌溶血素cylL基因的原核表达

目的克隆表达粪肠球菌溶血素cylL基因,为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增溶血素cylL基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET42a中,构建pET-cylL重组质粒。将pET-cylL质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经KpnI、XhoI酶切及测序鉴定,以IPTG诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE、Western blot进行分析。结果PCR体外扩增cylL基因产物约206bp,成功构建了重组表达质粒pET-cylL;SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为39.6kD。结论成功构建粪肠球菌溶血素cylL基因的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。