人参皂苷增加顺铂抗肺癌A549细胞活性的机理研究

目的观察人参皂苷与顺铂联合作用肺癌A549细胞的细胞毒作用,探索相关作用机制。方法 MTT实验检测人参皂苷、顺铂对人肺癌A549细胞的细胞毒作用;提取药物处理细胞总蛋白,Western blot检测细胞survivin蛋白的表达变化;Annexin V/PI双染、流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。结果人参皂苷和顺铂对肺癌A549细胞的半数抑制浓度(IC50)值分别为(43.26±3.27)和(2.34±0.15)μmol/L;20、40μmol/L人参皂苷与顺铂联合作用A549细胞,顺铂对A549细胞的IC50值减少为(1.42±0.33)、(0.61±0.04)μmol/L,P<0.01。Western blot检测显示人参皂苷剂量依赖性的降低肺癌A549细胞survivin蛋白的表达。流式细胞仪凋亡检测显示人参皂苷使顺铂诱导的细胞凋亡增加(P<0.01)。结论人参皂苷可以显著增加顺铂对肺癌A549细胞的致凋亡作用,下调survivin蛋白表达可能是其增敏的主要机制。     

miRNA-126靶向抑制A549细胞迁移和侵袭能力的研究

目的研究microRNA-126（miR-126）对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞迁移和侵袭能力的影响。方法利用脂质体介导法将十勾建的miR126过表达质粒转染至NSCI．C细胞株A549细胞（A549／miR-126组）,并设空质粒转染组（A549／MOCK组）和空白对照组（A549组）。利用RT-PCR技术检测3组细胞中EGFI。7（miR126的靶标）的表达水平,采川细胞划痕实验观察细胞迁移能力差异,采用Transwell小室法分析3组细胞侵袭能力的差异。结果RT—PCR检测A549／miR-126组、A549／MOCK组和A549组细胞中EGFI。7mRNA分别为2．32±0．088、1．43±0．026和1．00±0．000,差异有统计学意义（P〈0．01）;细胞划痕实验显示A549／miR—126组、A549jM（）CK组和A549组细胞平均迁移距离分别为3．0μm、2．65μm和0．5μm,平均抑制率分别为0、11．25％和83．75％,差异有统计学意义（P〈O．05）;Transwell小室实验显示,A549／miR126组24hr侵袭细胞数为（28．6±2．322）个,36h侵袭细胞数为（29．2±3．7683）个,A549／M（）CK组24h为（49．8±3．7014）个,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论miR-126可上调EGFL7mRNA的表达,并可能通过表达产物EGFI。7蛋白抑制A549细胞的迁移和侵袭能力。     

藤梨根提取物抑制肺癌A549细胞增殖作用机制研究

目的观察藤梨根乙酸乙酯提取物（RAE）对肺癌A549细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法体外培养肺癌A549细胞,分别给予不同浓度的RAE进行干预,流式细胞术检测用药后A549细胞凋亡率变化,免疫组化SP法检侧细胞Bcl-2、Bax蛋白表达变化,RT—PCR法检测细胞Bcl-2、Bax mRNA表达,激光共聚焦显微技术测定细胞胞内Ca^2＋浓度变化。结果各治疗组给予RAE作用后细胞凋亡率明显增加,并存在时相性和量效依赖性;用药后A549细胞Bcl-2蛋白和mRNA表达降低,而Bax蛋白和mRNA表达上调,细胞内Ca^2＋浓度明显升高,与对照组比较均有显著统计学差异（P均〈0．01）,亦存在时相性和量效依赖性。结论RAE可明显诱导肺癌A549细胞凋亡,其机制可能与降低其Bcl-2蛋白和mRNA表达、上调Bax蛋白和mRNA表达、升高细胞内Ca^2＋浓度有关。     

非诺贝特联用顺铂对人肺癌A549细胞抑制和凋亡的实验研究

目的探讨过氧化物酶体增殖因子激活受体仪激动剂非诺贝特联用顺铂对体外培养的人肺癌A549细胞增殖和凋广的影响及可能机制。方法采用MTF法分别检测单用非诺贝特、顺铂和非诺贝特联用顺铂对肺癌A549细胞的生长抑制情况。采用Hoechest染色观察非诺贝特联用顺铂对肺癌A549细胞的生长抑制作用。流式细胞术检测联合用药对A549细胞的凋亡诱导作用。RT—PCR法检测联合用药对A549细胞中caspase－3、survivinmRNA的表达变化情况。结果非诺贝特对肺癌A549细胞有抑制作用,呈现时间剂量关系。联合用药组作用肺癌A549细胞48h后比单用药组的细胞抑制作用强（P〈0．05）。形态学观察及流式细胞术结果显示联合用药组A549凋亡细胞数目多于单药组,RT—PCR结果提示联合用药组较单用药组上调caspase－3mRNA的表达,下调stirvivin mRNA的表达。结论非诺贝特与顺铂联用可以增强顺铂杀伤肺癌A549细胞作用,其机制可能与上调caspase－3的表达和下调survivin的表达有关。     

结肠癌组织中Ku70、转录因子Sp1的表达变化及意义

目的：观察Ku70和特异性蛋白1（Sp1）在结肠癌组织中的表达变化,并探讨其意义。方法分别采用免疫组化SP法、RT-PCR法对结肠癌及对应癌旁正常组织中的Ku70和Sp1蛋白及mRNA进行检测,并分析二者间的相关性及与结肠癌临床病理参数的关系。结果结肠癌癌组织与癌旁正常组织中Ku70阳性表达率分别为68．9％（42/61）、36．1％（22/61）,二者比较,P＜0．05;Sp1阳性表达率分别为78．7％（48/61）、26．2％（16/61）,二者比较,P＜0．05。结肠癌和癌旁正常组织中Ku70 mRNA相对表达量分别为1．184±0．410、0．845±0．424,二者比较,P＜0．05;Sp1 mRNA相对表达量分别为1．280±0．311、0．912±0．362,二者比较,P＜0．05。 Ku70 mRNA和Sp1 mRNA在结肠癌组织中表达呈正相关（r＝0．398,P＝0．029）。 Ku70和Sp1蛋白表达水平与结肠癌肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关（P均＜0．05）。结论 Ku70和Sp1在结肠癌中高表达,与结肠癌的侵袭、转移有关,二者可作为结肠癌发生、发展的预测指标。     

吉西他滨对人胰腺癌细胞系BXPC-3的放射增敏作用及其机制探讨

目的探讨吉西他滨对人胰腺癌细胞系BXPC-3的细胞毒性作用和放射增敏作用及其相关机制。方法用不同浓度吉西他滨处理BXPC-3细胞（加药组）、0.04μg/ml吉西他滨作用24 h后用不同剂量X线照射（药物＋照射组）,另设单纯照射组。采用MTT法测定吉西他滨对BXPC-3细胞生长的药物敏感性,采用MTT法检测吉西他滨10%细胞抑制浓度（IC10）,以IC10作为研究放射增敏效应的浓度进行放射增敏试验;集落形成法观察吉西他滨的放射增敏作用;流式细胞术分析细胞周期及凋亡变化;免疫细胞化学染色观察Bcl-2,Bax蛋白表达变化。结果随吉西他滨浓度增加,细胞毒性更显著,吉西他滨对人胰腺癌细胞系BXPC-3的IC10为0.04μg/ml。单纯照射组平均致死剂量、外推数均高于药物＋照射组。流式细胞仪检测结果提示,与空白组比较,加药组细胞S期比例增高,细胞Bax表达增加,Bcl-2表达下降。结论吉西他滨对人胰腺癌细胞系BXPC-3有明显的细胞毒性作用和一定的放射增敏作用,其机制可能与吉西他滨引起S期阻滞和调节凋亡相关基因的表达有关。     

严重急性呼吸综合征病毒N蛋白致人Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)的炎症反应

目的研究SARS冠状病毒N蛋白致人Ⅱ型肺泡上皮细胞（A549）的炎症反应。方法采用噻唑蓝（MTT）法检测第24、48、72和96小时SARS冠状病毒N蛋白对人Ⅱ型肺泡上皮细胞（A549）生长活性的影响。采用ELISA检测SARS冠状病毒N蛋白作用后A549细胞培养上清液中IL-6、IL-10、转化生长因子-β1（TGF-β1）的浓度变化。用RNA提取试剂盒提取总RNA，RT-PCR半定量法检测A549细胞IL-6、IL-10、TGF-β1 mRNA及基质金属蛋白酶（MMP）-9 mRNA的表达。结果不同浓度N蛋白对A549细胞生长均有抑制作用（表现在作用48h后），其中以20μg／mL浓度抑制性最强，其72h、96h的A值分别为0．672±0．027、0．799±0．092，与同一时间点空白对照组A值0．737±0．024、0．968±0．007相比，差异有统计学意义（P〈0．01）。加入N蛋白后，4、6和12hA549细胞培养上清液中IL-6、IL-10、TGF-β1浓度上升，其中IL-6的6h和12h浓度分别为（119．35±5．60）ng／L和（116．29±10．49）ng／L，II，10的4、6和12h浓度分别为（56．75±6．28）、（64．99±7．45）和（61．28±3．56）ng／L，TGF-β1 4、6和12h的浓度分别为（159．47±5．38）、（178．83±9．13）和（173．40±14．71）ng／L，与同一时间点对照组相比，差异有统计学意义。加入N蛋白后，A549细胞IL-6、IL-10、TGF-β1 mRNA的表达迅速上升，2h即有明显升高，6h进一步升高；MMP-9 mRNA的表达在2h时无明显上升，6h时有明显升高。结论Ⅱ型肺泡上皮细胞是SARS冠状病毒的重要靶细胞，同时也是效应细胞；SARS冠状病毒结构蛋白导致A549细胞各种炎性介质的分泌增加，表现在炎性因子的浓度提高和相应的mRNA表达水平增加，可能是机体异常免疫反应的发病机制。     

雾化吸入顺铂对晚期非小细胞肺癌放疗增敏的疗效观察

目的 观察雾化吸入放疗增敏药物与放疗同步治疗晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的疗效.方法 56例晚期非小细胞肺癌患者随机分成雾化吸入放疗增敏药物放疗同步组（增敏组）和单纯放疗组（单放组）.增敏组在放疗的同时给予每日1次顺铂10mg雾化吸入,并于雾化吸入后60分钟内完成放疗,连续15天为一周期.结果 增敏组有效率78.6%（22/28）,其中完全缓解（CR）10例,部分缓解（PK）12例.单放组有效率为39.3%（11/28）.均为PR.增敏组的有效率明显高于单放组（P=0.003）.增敏组和单放组的中位生存时间分别为16和13个月（P=0.0003）增敏组的远处转移率（57.1%）明显低于单放组（85.7%）（P=0.018）.增敏组Ⅲ～Ⅳ度放射性食管炎、中性粒细胞减少发生率分别为39.3%（11/28）、17.9%（5/28）,高于单放组的17.9%（5/28）和3.6%（1/28）,但均无统计学差异（P=0.076和0.084）.结论 雾化吸入放疗增敏药物顺铂是晚期非小细胞肺癌安全有效、操作简便的一种新治疗手段,值得进一步临床研究.     

As2O3对TRAIL抑制人肺癌A549细胞增殖及调节DR4 mRNA、DR5 mRNA表达作用的影响

目的观察三氧化二砷（As2O3）对人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）抑制人肺癌A549细胞增殖作用的影响及机制。方法体外培养A549细胞至对数生长期后随机分为As2O3组、TRAIL组、联合组及对照组,As2O3组分别加入1、10μmol／LAs2O3,TRAIL组加入100μg／LTRAIL,联合组分别加入1μmol／LAs2O3＋100μg/LTRAIL、10μmol／LAs2O3＋100μg／LTRAIL,对照组加入DMEM培养液。四组均继续培养24、48、72h,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞生长情况,计算细胞增殖抑制率（IR）;用RT-PCR法检测死亡受体4（DR4）mRNA、死亡受体5（DR5）mRNA表达变化。结果 联合组IR显著高于As2O3,组及TRAIL组,尤以作用48h和72h为著（P均〈0．05）;联合组DR4 mRNA和DR5 mRNA表达均明显强于As2O3组及TRAIL组（P均〈0.05）。结论 As2O3,可增强TRAIL对A549细胞增殖的抑制作用,机制可能为上调DR4m RNA和DR5 mRNA表达;此为肺癌的临床靶向治疗根供了依据．     

藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞凋亡的诱导作用

目的观察藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞凋亡的诱导作用。方法体外培养肺癌A549细胞,分别给予40、80、160μg/ml的藤梨根乙酸乙酯提取物（实验组）,同时设对照组（0.04%DMSO＋肺癌A549细胞）。采用DNA琼脂糖凝胶电泳检测用药后DNA梯状条带、TUNEL检测用药后肺癌A549细胞凋亡率的变化、免疫组化SP法检测用药后肺癌A549细胞Survivin蛋白表达变化、RT-PCR法检测用药后A549细胞Survivin mRNA的表达。结果实验组细胞DNA凝胶电泳均出现凋亡细胞所特有的DNA梯状条带图谱,而对照组细胞未出现。各实验组细胞随着藤梨根乙酸乙酯提取物浓度的增加,细胞凋亡率明显增加,并存在时相性和量—效依赖性;其Survivin蛋白和mRNA表达均低于对照组（P均〈0.05）,亦存在时相性和量—效依赖性。结论藤梨根乙酸乙酯提取物可明显诱导肺癌A549细胞凋亡,其机制可能与降低Survivin蛋白和mRNA表达有关。     

RNA 干扰沉默 IGF1R 表达对 A549细胞放射增敏作用的研究

目的：构建靶向胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)-siRNA 重组慢病毒表达载体,观察其对人肺腺癌 A549细胞放疗增敏作用并探讨其机制。方法构建 IGF1R-siRNA 重组慢病毒,感染 A549细胞,蛋白免疫印迹法检测 IGF1R 沉默效率;荧光实时定量 PCR 法及 ELISA 法分别检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和 Bad 基因及蛋白表达情况。克隆形成实验检测放射增敏作用。结果 IGF1R-siRNA 重组慢病毒使 A549细 胞 IGFlR 蛋白沉默效率达70.53%;HIF-1α、VEGF和 Bad 基因及蛋白表达量均显著降低;A549细胞对放射治疗的敏感性增加,平均致死剂量由1.20 Gy 下降至0.94 Gy,放射增敏比达1.28。结论沉默 IGF1R 对人肺腺癌 A549细胞具有放疗增敏效应,其机制可能与 HIF-1α、VEGF 和 Bad 表达下调相关。     

YAP调控肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的机制分析

目的探讨Yse相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)对A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响及其机制。 方法采用MTS检测顺铂对肺腺癌A549细胞以及肺腺癌耐顺铂A549/DDP细胞的50%抑制浓度(IC₅₀)。使用qPCR以及Western blot检测A549和A549/DDP细胞中YAP mRNA以及蛋白的表达。Western blot检测维替泊芬(Verteporfin, VP)处理A549/DDP后YAP蛋白表达变化。将A549/DDP细胞设置为DMSO对照组、顺铂组(DDP组)、维替泊芬组(VP组)、顺铂联合维替泊芬组(DDP+VP组),采用MTS检测0、24和48 h各处理组细胞活力的变化。采用qPCR检测VP处理A549/DDP后干细胞标志物ALDHA1、CD133、OCT4、NANOG、SOX2的mRNA表达变化。 结果顺铂对A549和A549/DDP细胞的IC50分别为(4.07±0.03)μg/ml、(23.44±0.98)μg/ml,耐药指数为5.76。A549/DDP细胞中YAP显著高于A549细胞(P<0.05)。VP处理A549/DDP细胞后YAP蛋白表达水平较DMSO组明显降低。DDP+VP组较单独DDP组,其细胞活力在24 h和48 h均明显降低(P<0.05)。qPCR检测发现A549/DDP细胞经VP处理后,干细胞标志物ALDHA1、CD133、OCT4、NANOG、SOX2的mRNA均较DMSO组明显降低(P<0.05)。 结论YAP可能参与了肺癌细胞的顺铂耐药。抑制YAP可通过抑制肿瘤干细胞特性,进而发挥逆转耐药的作用。     

甜菜碱联合藻蓝蛋白对肺癌细胞A549体内外增殖的影响

目的探讨甜菜碱和藻蓝蛋白二者单独以及联合使用对肺癌细胞A549和肺癌荷瘤鼠肿瘤增殖的影响。方法选取40只裸鼠制成肺癌细胞A549荷瘤鼠模型,成模后随机分为甜菜碱组、藻蓝蛋白组、甜菜碱+藻蓝蛋白组和对照组,每组各10只,分别喂食甜菜碱和藻蓝蛋白以及二者联合喂食,对照组给予生理盐水注射。MTT检测A549细胞活性,流式细胞仪A549细胞周期,Western印迹检测A549细胞内丝裂原活化蛋白激酶蛋白(MAPK)的表达。建立肺癌细胞A549荷瘤鼠模型,分别喂食甜菜碱和藻蓝蛋白以及二者联合喂食后游标卡尺检测肿瘤体积的变化。结果 4%浓度的甜菜碱单独作用A549细胞48 h时,细胞活性明显降低(P0.05),而藻蓝蛋白(0～40μg/L)单独作用A549细胞48 h时,细胞的活性变化相对较小。与对照组相比,二者联合使用时细胞活性显著降低(P0.05)。与对照组相比,甜菜碱和藻蓝蛋白单独及联合使用时A549细胞周期G1期均下降,而G2/M期细胞比值明显升高。甜菜碱和藻蓝蛋白分别和联合作用A549细胞48 h与对照组相比,MAPK蛋白水平表达显著升高(P0.05)。结论甜菜碱和藻蓝蛋白二者联合使用可更好地抑制肺癌细胞株A549增殖和减小肺癌荷瘤鼠肿瘤体积。     

siRNA-Med19对人肺癌A549细胞Med19转录、表达的影响

目的 研究siRNA-Med19对人肺癌A549细胞Med19的影响.方法 利用前期已合成的siRNA-Med19慢病毒载体,感染A549细胞,并以无病毒感染组作为空白对照组,以慢病毒载体感染组作为阴性对照组.采用荧光图片和白光图片对比方法判断细胞的感染率;RT-PCR法检测细胞Med19mRNA的转录水平; Western 印迹法检测细胞Med19蛋白表达水平.结果 慢病毒载体对人肺癌A549细胞的感染率在80%以上,siRNA-Med19慢病毒感染组Med19mRNA转录水平明显降低,敲减效率大于70%,Med19蛋白表达量也明显降低.结论 siRNA-Med19慢病毒载体可以高效感染人肺癌A549细胞,siRNA-Med19对A549细胞Med19的转录和表达具有明显的抑制和消减作用.     

甲基莲心碱对人卵巢癌顺铂耐药逆转的体外研究

目的研究甲基莲心碱（Nef）在人卵巢癌耐药细胞SKOV3／顺铂（DDP）对DDP敏感性中的作用,初步探讨其化疗增敏的作用机制。方法采用MTT比色法筛选Nef对细胞株的无毒剂量,并测定Nef干预后SKOV3／DDP对DDP耐药性的变化;免疫细胞化学法检测Nef对SKOV3／DDP细胞GST-π竹蛋白表达的影响;RT—PCR法分析Nef作用SKOV3／DDP细胞株不同时间GST-π mRNA水平表达的差异。结果不同浓度DDP与Nef联合应用使DDP对SKOV3／DDP细胞IC50明显下降,且逆转倍数随药物作用时间延长而增大,24h、48h、72h分别为1．15、1．91、2．28倍（P〈0．01）;镜下SKOV3／DDP细胞较SKOV3细胞高表达GST-π,经Nef作用72h后其GST-IT表达明显下降（P〈0．01）;无毒剂量Nef作用1、3、5d后SKOV3／DDP细胞内GST-π mRNA转录水平随作用时间延长而降低（P〈0．01）。结论Nef能有效逆转SKOV3／DDP细胞的耐药性,其逆转机制可能与下调GST-π基因高表达有关。     

吉非替尼对肺腺癌细胞增殖和表皮生长因子受体表达的影响

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂吉非替尼对肺腺癌A549细胞株增殖和EGFR表达的影响.方法 不同浓度吉非替尼干预肺癌A549细胞24、48、72 h后,倒置相差显微镜观察药物干预后细胞形态学变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞抑制率;钙依赖性磷脂结合蛋白(AnnexinⅤ)/碘化丙啶(PI)法和HoechsT_33258染色法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测药物作用周期;免疫荧光检测EGFR蛋白表达情况;实时荧光定量PCR检测EGFR mRNA的表达情况.结果 各干预组细胞出现空泡和颗粒,细胞碎片增多,且随吉非替尼剂量增加和干预时间的延长日益明显.吉非替尼明显抑制了A549细胞的生长,呈时间、剂量依赖性.吉非替尼组细胞凋亡率明显高于正常对照组(P<0.01),S期细胞比例明显减少(P<0.01),G0/G1期细胞比例明显增加(P<0.01),EGFR mRNA和蛋白表达明显减弱(P<0.01).结论 吉非替尼显著抑制A549细胞生长,可能机制是促进凋亡、增强G0~G1期阻滞和进一步下调活化的EGFR mRNA和蛋白的表达.     

甘氨双唑钠放射增敏作用临床研究

目的观察甘氨双唑钠（CMNa）放射增敏作用。方法对55例经病理学和（或）细胞学证实的肺癌、食管瘾采用随机双盲对照法分为A组（放疗＋CMNa组）和B组（放疗＋安慰剂组）进行了，CMNa放射增敏的临床研究。A组CMNa按800mg／m^2于放疗前1h内静脉滴注，3次／周滴注至放疗结束。B组用同样剂量的安慰剂。静脉滴注后30～60min内进行放疗，直至疗程结束。放疗总剂量60～70Gy．时间剂量2Gy/次，5次／周．共6～7周。结果治疗组2例肺癌患者因过敏反应（皮疹）退组未参与疗效评价。肺癌A组和B组的有效率分别为42％和53％（P=0.516），食管癌中A组和B组有效率分别为100％和43％（P=0．015），A组和B组总有效半分别为62％和50％（P=0.378），中位生存期A组为11个月，B组为10个月。1、3、5年总生存率A组分别为31％、13％、10％．B组分别为25％、15％、6％（P=0．475）。1、3、5年局部控制率控制率A组分别为32％、18％、16％，B组分别为28％、19％、13％（P=0．518）。除偶见皮疹，两组毒副反应相似。结论CMNa对食管癌有放射增敏作用，而对肺癌疗效不明显，其毒副作用轻微。CMNa配合放疗远期疗效不明显，仍需追踪观察和扩大病例试验。     

Six1基因在肺癌组织表达水平及RNA干扰抑制其表达后对肺癌细胞生物学特性的影响

目的探讨Six1基因在肺癌组织表达及抑制其表达后对肺癌细胞增殖凋亡的影响。方法提取肺癌及癌旁组织蛋白,Western印迹检测Six1的表达; Six1-siRNA转染人肺癌A549细胞,分为空白组和阴性对照组(NC组)、Six1-siRNA组,转染48 h后通过Western印迹检测各组细胞Six1的表达; CCK8检测Six1-siRNA转染A549细胞24～72 h的细胞增殖;流式细胞术检测转染48 h的细胞凋亡率; Western印迹检测增殖相关蛋白细胞增殖核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)家族Bcl-2相关X蛋白(Bax)及Notch1信号通路Notch1和Hes1的蛋白表达。结果 Six1在肺癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0. 05); Six1-siRNA转染能明显降低A549细胞Six1的表达;与空白组比较,Six1-siRNA组细胞24～72 h的细胞增殖均显著降低,在48 h的细胞凋亡率显著升高,PCNA、Notch1和Hes1蛋白表达均显著降低,Bax蛋白表达显著升高(P<0. 05)。结论 Six1在肺癌组织中高表达,通过RNA干扰抑制其表达可通过下调Notch1信号通路降低肺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡,对细胞增殖凋亡的影响方式是下调PCNA和上调Bax蛋白表达。     

顺铂联合雷帕霉素或3-甲基腺嘌呤对肺腺癌A549细胞抑制作用的研究

目的观察非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)中肺腺癌A549细胞在顺铂(cisplatin,CP)联合雷帕霉素(rapamycin,RAPA)或3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)作用下的结果,为提高顺铂的化疗效果提供理论依据。方法 2013年3月至2014年6月期间,通过对人肺腺癌细胞株A549(由河北医科大学第四医院科研中心提供)经四甲基偶氮唑盐3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)实验检测顺铂、雷帕霉素和3-MA对A549细胞的增殖抑制率,计算出各药物的50%细胞抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50),并以此作为实验浓度。实验分为4组:对照组(无药物干预)、顺铂组(加15μmol/L的顺铂)、顺铂+雷帕霉素组(加10nmol/L的雷帕霉素1h后再加15μmol/L的顺铂)、顺铂+3-MA组(加3μmol/L的3-MA 1h后再加15μmol/L的顺铂),将对数生长期的肺癌A549细胞以每孔1.0×10^6/ml密度接种于6孔培养板中,待细胞长至孔底面积约70%~80%后分别加入稀释好的药物,分别培养24、48、72h。肺癌A549细胞的生长迁移情况用细胞划痕实验检测,mTOR、LC3-Ⅱ及Bax mRNA和蛋白的表达情况用RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)、Western blot(蛋白质印迹)法检测。数据处理采用SPSS 17.0统计软件进行分析。结果顺铂IC50:15μmol/L;雷帕霉素IC50:10nmol/L;3-MA IC50:3μmol/L。划痕实验显示24h顺铂+雷帕霉素组细胞迁移能力最弱,48h和72h顺铂+3-MA组细胞迁移能力最弱。RT-PCR显示顺铂+雷帕霉素组LC3-ⅡmRNA的2-△△Ct值(24h:1.686±0.069;48h:1.803±0.083;72h:1.836±0.056)与顺铂组(24h:1.489±0.031;48h:1.325±0.007;72h:1.428±0.080)相比表达量均明显上升(24hF=149.780,P<0.01;48hF=111.599,P<0.01;72hF=167.855,P<0.01);而顺铂+3-MA组的Bax mRNA的2-△△Ct值(48h:1.864±0.104;72h:1.935±0.068),与顺铂组(48h:1.346±0.080,72h:1.462±0.029)相比,表达量均明显上升(48hF=52.853,72hF=202.118;P值均<0.01)。Western blot显示顺铂+雷帕霉素组LC3-Ⅱ蛋白(48h:0.556±0.010;72h:0.571±0.009)与顺铂组(48h:0.426±0.0107;72h:0.492±0.009)相比表达量均显著上升(48hF=372.056,72hF=930.500;P值均<0.01);而顺铂+3-MA组的Bax蛋白(48h:0.897±0.022;72h:0.916±0.005),与顺铂组(48h:0.463±0.011;72h:0.581±0.007)相比,表达量均显著上升(48hF=1100.412,72hF=5715.778;P值均<0.01)。结论顺铂联合雷帕霉素或3-MA较单独使用顺铂能更好的抑制A549细胞的生长,长时间用药时顺铂联合3-MA作用最强。     

miR-21抑制物对A549细胞球增殖的影响及机制

目的研究miR-21抑制物在A549细胞球增殖的作用及其相关机制。方法在无血清培养基中培养A549细胞球,形成细胞球后进行CD133+CD44+表达检测。实验分为A549细胞球组:未经处理;IHN组:miR-21抑制物转染A549细胞球组;IHN-NC组:miR-21抑制物阴性对照物转染A549细胞球组。Western印迹检测A549细胞和A549细胞球中DKK2、β-catenin蛋白以及QPCR检测miR-21在两种细胞中的表达;合成miR-21抑制物和阴性对照,分别转染A549细胞球48 h后,应用QPCR检测转染前后miR-21的表达变化,以及使用Western印迹分析DKK2、β-catenin蛋白的表达变化,利用噻唑蓝(MTT)检测12、24、48 h细胞的增殖能力。结果流式细胞术检测A549细胞球中CD133+CD44+阳性率为65.800%;IHN组miR-21的表达以及β-catenin蛋白的表达较A549细胞球组和IHN-NC组显著下调(P<0.05),而DKK2蛋白表达显著升高(P<0.05);MTT结果示IHN组和IHN-NC组在12、24、48 h时抑制率显著高于A549 sphere组(P<0.05),IHN组在24、48 h时相点抑制率明显高于IHN-NC组(P<0.05)。结论miR-21抑制物可有效抑制A549 sphere的增殖,其可能成为治疗肺癌的潜在靶点。