人突变型CDK4真核荧光表达质粒的构建及对人肝细胞SMMC-7702中POLD1基因表达的调控

目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行P C R扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-C1质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析;转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-C1组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化;实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLD1及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的C D K4蛋白;S M M C-7721细胞中突变型的C D K4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变;与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08vs0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P<0.05);实验组CDK4mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11vs1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P<0.01),POLD1mRNA相应地升高(2.47±0.25vs1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P<0.01);稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03vs0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P<0.05),P125(0.54±0.04vs0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P<0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.     

Dickkopf-1克隆及其抗结肠癌作用

目的:探讨Dkk1 cDNA抗结肠癌的机制.方法:利用脂质体介导pcDNA3.1( )Dkk1进行瞬时转染结肠癌细胞CT26和表达Dkk1的肝癌细胞HEPA1-6, 转染后的细胞为实验组, 转染空载体pcDNA3.1( )的细胞和未转染的细胞分别为空载体组和未转染组, 用MTT法检测CT26增殖、免疫印迹法检测细胞Dkk1, p53, Bcl-2和Bax的表达量.结果: MTT实验显示在570 nm的吸光度均值CT26实验组明显低于其空载体组和未转染组(0.779±0.025 vs 0.968±0.016, 0.973±0.016), P<0.05); 与CT26空载体组和未转染组相比, 实验组p53, Bcl-2的表达量降低、而Dkk1、Bax表达增高.结论:外源Dkk1可反馈抑制突变型p53的生成, 下调Bcl-2, 增加Bax因子表达而抑制结肠癌的增殖.     

截断型载脂蛋白E对神经元tau蛋白和神经细丝磷酸化的影响

目的探讨截断型载脂蛋白(Apo)E对神经元中tau蛋白和神经细丝磷酸化的影响。方法构建真核表达重组体p EGFP-T-Apo E4,培养小鼠成神经瘤细胞系,并将p EGFP、p EGFP-Apo E4和p EGFP-T-Apo E4质粒转染N2a细胞,采用免疫印迹法测定转染细胞内磷酸化tau蛋白和神经细丝含量。结果不同质粒转染组N2a细胞中磷酸化tau蛋白表达明显不同,p EGFP-T-Apo E4组p EGFP-Apo E4组p EGFP-C3组(P0.05);不同质粒转染组N2a细胞中磷酸化神经细丝表达不同,p EGFP-T-Apo E4组p EGFP-Apo E4组p EGFP-C3组(P0.05)。结论截断型Apo E能够促进N2a细胞tau蛋白和神经细丝磷酸化,推测其可能是增加阿尔茨海默病(AD)患病风险及促进病程进展的原因之一。     

Prx-1基因沉默对 TGF-β1诱导肺成纤维细胞增殖、ROS 水平、p-AKT 蛋白表达的影响

目的观察硫氧还原蛋白过氧化物酶1(Prx-1)基因沉默对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肺成纤维细胞增殖、活性氧簇(ROS)水平及磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达的影响。方法体外培养肺成纤维细胞MRC-5,并分为对照组、TGF-β1组、阴性转染组和实验组。阴性转染组和实验组分别通过脂质体Lipofectamine2000转染阴性对照siRNA及设计好的3个Prx-1 siRNA(Prx-1 siRNA-209、Prx-1 siRNA-289、Prx-1 siRNA-453),培养48 h,real-time PCR法检测Prx-1 mRNA,选取转染Prx-1 siRNA-453的细胞用于后续实验。除对照组外,其余三组给予TGF-β1(5μg/L)刺激。TGF-β1刺激24 h后,MTT实验观察细胞增殖情况,2,7-二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)实验检测ROS水平;TGF-β1刺激45min后,Western blotting法检测p-AKT蛋白。结果对照组、TGF-β1组、阴性转染组、实验组OD值分别为0.56±0.07、0.81±0.10、0.88±0.18、1.16±0.18,ROS水平分别为2 922±291、4 348±484、4 660±375、5 415±436;实验组细胞增殖情况及ROS水平与其余三组相比,P均<0.01;TGF-β1组、阴性转染组与对照组相比,P均<0.01。对照组、TGF-β1组、阴性转染组、实验组细胞中p-AKT蛋白相对表达量分别为0.45±0.05、0.60±0.07、0.57±0.07、0.77±0.09;实验组与其余三组相比,P均<0.01;TGF-β1组与对照组相比,P<0.01。结论Prx-1基因沉默可增强TGF-β1对肺成纤维细胞的增殖诱导作用,上调细胞内ROS水平和p-AKT蛋白表达。     

四氧嘧啶对人神经瘤SK-N-SH细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

目的 观察四氧嘧啶对人神经瘤SK-N-SH细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制.方法 将人神经瘤SK-N-SH细胞分为两组,对照组常规培养12h,观察组分别加不同浓度的四氧嘧啶培养12 h.用MTT法测细胞吸光度值观察细胞增殖情况,用PI/Hoechst染色法观察细胞凋亡,用蛋白免疫印迹法检测细胞中糖基化和磷酸化的神经丝蛋白.结果 对照组细胞吸光度值为0.43 ±0.01,观察组加入2、4、6、8、10 mM四氧嘧啶作用12 h,细胞吸光度值分别为0.39 ±0.01、0.35 ±0.02、0.30±0.01、0.26±0.03、0.21 ±0.02;观察组与对照组比较,P均＜0.05;观察组不同浓度间比较,P均＜0.05.对照组细胞凋亡率为5％±1％,观察组加入2、4、6 mM四氧嘧啶作用12 h,细胞凋亡率分别为10％±1％、18％±2％、29％±1％;观察组与对照组比较,P均＜0.05;观察组不同浓度间比较,P均＜0.05.对照组细胞中磷酸化、糖基化神经丝蛋白OD值为1.00 ±0.20、1.00±0.20,观察组加入2、4、6 mM四氧嘧啶作用12 h,细胞中磷酸化、糖基化神经丝蛋白OD值分别为1.21±0.42和0.95±0.21、1.32±0.51和0.78±0.32、1.51±0.30和0.75±0.24;观察组与对照组比较,P均＜0.05;观察组不同浓度间比较,P均＜0.05.结论 四氧嘧啶可抑制SK-N-SH细胞增殖,并诱导其凋亡;可能与神经丝蛋白的糖基化降低、磷酸化增加有关.     

帕金森病患者血清tau蛋白磷酸化水平与预后转归的关系

目的分析帕金森病(PD)患者血清tau蛋白磷酸化水平与预后转归的关系。方法选取接受治疗的PD患者100例作为观察组,另取同期健康体检者100例为对照组。分别采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测所有研究对象的血清磷酸化tau蛋白水平。同时,根据PD患者认知障碍程度的不同分为轻度认知障碍(MCI组)44例及PD痴呆(PDD组)56例,对比两组血清磷酸化tau蛋白水平,此外,将观察组患者根据治疗后PD统一评分量表(UPDRS)评分的不同分为UPDRS<35分组以及UPDRS≥35分组,对比两组血清磷酸化tau蛋白水平,并作Spearman相关性分析。结果观察组患者血清磷酸化tau水平为(115.5±56.2)pg/ml,显著高于对照组[(79.7±40.3)pg/ml,P<0.05]。MCI组患者血清磷酸化tau水平显著低于PDD组(P<0.05)。UPDRS<35分组血清磷酸化tau水平显著低于UPDRS≥35分组(P<0.05)。经Spearman相关性分析可得,血清磷酸化tau水平与PD患者UPDRS评分呈显著正相关(r=0.563,P=0.011)。结论 PD患者血清tau蛋白磷酸化水平越高,预后越差。     

真核起始因子2α的磷酸化抑制顺铂介导的肝癌细胞凋亡

目的 探讨真核起始因子2α (eIF2α)的磷酸化对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响. 方法 将肝癌细胞随机分为对照组和实验组,在用突变载体eIF2αS51A转染和小分子抑制剂salubrinal 改变实验组细胞在顺铂作用条件下eIF2α磷酸化的基础上,用流式细胞和Western blot分别检测细胞凋亡的百分率和细胞凋亡的分子标志物.多组间比较采用方差分析,两组间比较采用t检验. 结果 顺铂诱导肝癌细胞eIF2 α发生51位丝氨酸磷酸化.在突变载体转染条件下,顺铂(10μg/m1)诱导对照组和实验组SMMC-7721细胞在24 h凋亡的平均百分率分别为21.7％±1.5％和50.7％±2.1％(t=19.454,P＜0.05);顺铂诱导对照组和实验组HepG2细胞在24h凋亡的百分率分别为21.0％±1.0％和57.3％±2.1％ (t=27.250,P＜0.05).在抑制剂作用条件下,顺铂(15 μ g/ml)诱导对照组和实验组SMMC-7721细胞在36 h凋亡的百分率分别为50.3％±2.5％和16.3％±2.1％ (t=18.031,P＜0.05);顺铂诱导对照组和实验组HepG2细胞在36 h凋亡的百分率分别为42.0％±2.6％和12.0％±2.0％ (t=15.667,P＜0.05).同时,Western blot检测显示eIF2α的磷酸化抑制顺铂诱导的凋亡蛋白抗多聚ADP-核糖聚合酶的剪切. 结论 eIF2α的磷酸化在肝癌细胞抵抗顺铂介导的凋亡中起重要作用.     

SHP-2酪氨酸磷酸酶对肝癌细胞增殖的影响

目的 建立SHP-2野生过表达型(WT)及激活突变型(MT)稳定转染的肝癌HepG2细胞系,研究SHP-2激活突变及野生过表达对肝癌细胞增殖能力的影响.方法 将已经构建成功的WT SHP-2(WT组)和MT SHP-2(MT组)及空载体pcDNA3.1(空载组)分别转染到人肝癌HepG2细胞中,同时设未转染细胞作对照组;Westernblot法检测细胞中SHP-2蛋白的表达水平;MTT法检测细胞增殖情况;平板克隆和软琼脂集落形成实验检测细胞集落、克隆形成能力.结果 成功的将SHP-2突变型和野生型真核表达载体转染到人肝癌HepG2细胞中;MTT结果显示,对照组和空载组细胞增殖速度接近且增殖慢,而MT组和WT组细胞增殖速度明显加快,WT、MT组与空载组、对照组比较,P均＜0.01;细胞克隆形成的数量多于空载组和对照组,P均＜0.01.结论 成功构建了WT及MT稳定表达SHP-2的HepG2细胞株;SHP-2激活突变及野生过表达促进肝癌细胞增殖能力.     

胰岛素样生长因子1降低tau蛋白磷酸化作用机制的研究

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)对6样淀粉蛋白(A6)导致大鼠PC1 2细胞tau蛋白磷酸化的保护作用及其机制。方法实验分为预处理1组、2组、3组、模型组、对照组、保护组和氯化锂组。MTT法观察不同浓度IGF-1对PC12细胞存活率的影响。Western blot法检测Aβ_(1-40)处理后PC12细胞tau蛋白磷酸化、总tau蛋白和糖原合成激酶3β(GSK-36)及GSK-3β Ser~9的表达情况。结果 tau蛋白Ser~(396)、Ser~(199/202)位点磷酸化水平在Aβ_(1-40)诱导3 h开始增高,1 2 h达高峰。与对照组比较,模型组GSK-3β明显升高,GSK-3β Ser~9明显降低(P0.05);与模型组比较,氯化锂组及保护组tau蛋白Ser~(396)、Ser~(199/202)位点磷酸化水平和总tau蛋白明显降低(P0.05);GSK 36明显降低,GSK-3β Ser~9明显升高(P0.05,P0.01)。结论 Aβ_(1-40)主要通过激活GSK-3β使tau蛋白的磷酸化水平增高。IGF-1有抑制GSK-3β的活性,降低Aβ_(1-40)所诱导的PC12细胞tau蛋白过度磷酸化的作用。     

IGF-1对Aβ25-35致PC12细胞损伤的保护作用及其机制的探讨

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)对β样淀粉蛋白(Aβ25-35)引起的PC12细胞凋亡及tau蛋白磷酸化的保护作用及其机制。方法采用MTT,TUNEL等检测磷酸化Akt、Akt水平及Tau蛋白磷酸化水平,观察IGF-1对Aβ25-35致PC12细胞的损伤保护作用。结果MTT分析法表明IGF-1保护组的细胞活性显著高于Aβ损伤组(P<0.01),TUNEL法检测结果显示IGF-1保护组凋亡指数低于Aβ损伤组(P<0.01),IGF-1保护组能使被Aβ下调的磷酸化Akt水平恢复至与对照组相近的水平,总Akt水平基本维持不变。IGF-1保护组tau蛋白在Ser396,Ser202位点的磷酸化水平和总tau蛋白水平均明显低于Aβ损伤组。结论IGF-1能降低Aβ的细胞毒性,抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞的凋亡和tau蛋白磷酸化,这一作用机制是通过PI3K/Akt信号传导途径来实现的。     

潜克病人血清及尿中17种游离氨基酸含量初测

对潜在型克山病(潜克)病人血清及尿中17种氨基酸含量测定结果表明,除病人尿中丝氨酸含量明显低于正常人外,病人血清中17种氨基酸和尿中16种氨基酸含量与正常人相比无明显差异。     

地方性氟中毒防制对策新思考

阅读李广生教授的《营养因素对地氟病的影响》一文受到启发,联系到三次流行病学调查中的矛盾现象进行分析。认为,在地氟病流行因素中,除日摄氟量外,还与营养因素有关,尤其是膳食中的钙。据此,对地氟病防制对策进行了讨论。     

青蒿琥酯抗弓形虫病的疗效观察

弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,由其引发的弓形虫病在全世界范围内广泛流行,给人类健康和畜牧业造成了不可估量的损失。目前,弓形虫病治疗仍以传统的乙胺嘧啶和磺胺嘧啶联合用药为主,但由于它们在长期使用中表现出的毒副作用使其应用受到限制。另外,已发现的其它抗弓形虫药的疗效都低于上述两种药。因此,寻找新的、高效低毒的     

吸烟与胰岛素抵抗关系的实验研究

目的探讨吸烟与胰岛素抵抗(IR)的关系。方法正常6周龄Wistar大鼠49只,随机分为三组:普通饲养组(16只)、高脂饲养组(17只)、糖尿病组(16只),每组再随机分为吸烟组与对照组(各8只,高脂饲养吸烟组9只),吸烟组进行12周熏烟实验,应用高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术进行IR的评价,并进行有关生化指标及体重的检测。结果高脂饲养吸烟组、糖尿病吸烟组大鼠体重低于各自对照组(P<0·05);普通饲养吸烟组、高脂饲养吸烟组、糖尿病吸烟组TC高于各自对照组(P<0·05或P<0·01);普通饲养吸烟组、糖尿病吸烟组TG高于各自对照组(P<0·01,P<0·05);高脂饲养吸烟组LDL-C高于对照组(P<0·05);普通饲养吸烟组、高脂饲养吸烟组、糖尿病吸烟组FFA高于各自对照组(P均<0·01);普通饲养吸烟组FIns水平高于对照组(P<0·05);普通饲养吸烟组、高脂饲养吸烟组、糖尿病吸烟组葡萄糖输注率(GIR)低于各自对照组(P<0·01)。吸烟与TC、TG、FFA呈正相关(r=0·33,0·31,0·30,P<0·05),与体重、GIR呈负相关(r=-0·62,-0·43,P<0·01)。结论吸烟明显抑制体重增加,导致血脂紊乱及IR。吸烟与IR密切相关。     

疟疾监测方法研究进展

疟疾是一种严重危害人类健康的蚊媒病.对疟疾进行有效监测和预警具有重要意义.该文介绍了近年来疟疾病例监测、蚊媒监测、蚊媒感染疟原虫检测的方法及地理信息系统与遥感技术在疟疾监测中的应用.     

SUMO化反应在肾脏疾病中的作用探索

小泛素相关修饰物(SUMO)与靶蛋白的共价结合是一种真核基因表达的翻译后加工形式。SU-MO化能够使蛋白质更加稳定,进而调节许多关键的细胞活动,如核运输、信号传递、凋亡、细胞周期调控以及基因表达的调控等。此外SUMO化还可通过过氧化物酶体增殖物激活受体-γ、核转录因子-κB及转化生长因子-β依赖的途径参与抗炎和致纤维化过程,本文就这一机制可能在肾脏疾病中发挥的作用作一综述。     

地方性氟中毒防制对策新思考——读李广生《营养因素对地方性氟中毒的影响》一文有感

阅读李广生教授的《营养因素对地氟病的影响》一文受到启发,联系到三次流行病学调查中的矛盾现象进行分析。认为,在地氟病流行因素中,除日摄氟量外,还与营养因素有关,尤其是膳食中的钙。据此,对地氟病防制对策进行了讨论。     

肥胖对心房颤动影响的争议

心房颤动(房颤)为临床上最常见的持续性快速心律失常,在美国Miyasaka等[1]报道经年龄和性别校正后房颤的发病率在1980年为3.03％,2000年为3.68％,21年来房颤发病率上升了12.6％.房颤发病率的增加与多种因素有关,已被认知的房颤危险因素包括年龄、男性、高血压、瓣膜性心脏病、慢性心力衰竭、甲状腺疾病等[2],其中一个重要原因在于肥胖的患病率逐年增加.但是肥胖对房颤的影响仍存争议,故本文就肥胖与房颤的相关性作一综述.     

糖尿病对肾移植预后影响的研究

目的探讨肾移植患者合并糖尿病对预后的影响。方法回顾性分析1988年4月至2008年3月中国人民解放军总医院第二附属医院收治的507例肾移植患者手术前后相关临床资料和随访资料。结果507例共行539例次肾移植术(多次手术29例),其中52例合并糖尿病[其中男30例,年龄(51.4±7.1)岁;女22例,年龄(51.6±4.9)岁],移植前糖尿病16例,移植后糖尿病36例;因糖尿病肾病致肾衰竭性肾移植治疗占糖尿病的30.8%。未合并糖尿病肾移植455例[其中男293例,年龄(38.7±12.3)岁;女126例,年龄(43.5±10.1)岁]。合并糖尿病组的各种并发症患病率均显著高于非糖尿病组。合并糖尿病组病死率17.3%(9/52),同期非糖尿病肾移植组病死率7.7%(35/455),尤以移植前糖尿病病死率最高。结论肾移植合并糖尿病者病死率高、合并症多,需加强对肾移植前后糖尿病的控制。