细粒棘球绦虫感染小鼠肝脏髓源抑制性细胞 与调节性T细胞比例动态变化

目的　分析细粒棘球蚴感染小鼠肝脏髓源抑制性细胞（MDSCs）和调节性T（Treg）细胞比例动态变化，探讨其可能的生物学意义。方法　将30只6 周龄雌性BALB/c 小鼠随机分为感染组和对照组，每组15只。感染组每只小鼠腹腔注射细粒棘球绦虫原头节约2 000个，对照组注射等体积生理盐水。感染后3、6、12个月（感染早、中、晚期）收集小鼠肝脏白细胞，采用流式细胞术检测其中MDSCs 及其亚型M?MDSCs、PMN?MDSCs 与Treg细胞比例。结果　感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中MDSCs 比例分别为（1.61 ± 0.36）%、（5.68 ± 0.69）%和（16.18 ± 0.69）%，对照组分别为（2.19 ± 0.42）%、（0.99 ± 0.07）%和（4.18 ± 0.84）%，感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均 < 0.01）；感染组小鼠感染3、6、12个月后肝脏白细胞中M?MDSCs 比例分别为（0.69 ± 0.27）%、（5.30 ± 0.72）%和（10.75 ± 0.29）%，对照组分别为（0.42 ± 0.24）%、（0.69 ± 0.02）%和（2.12 ± 0.13）%，感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P 均< 0.01）；感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中PMN?MDSCs 比例分别为（0.93 ± 0.23）%、（0.32 ± 0.02）%和（5.14 ± 1.03）%，对照组分别为（1.77 ± 0.26）%、（0.28 ± 0.05）%和（1.99 ± 0.90）%，感染后3个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均 < 0.05）。感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中Treg细胞比例分别为（3.35 ± 0.14）%、（6.24 ± 0.38）%和（3.41 ± 0.07）%，对照组分别为（3.48 ± 0.46）%、（3.65 ± 0.45）%和（3.12 ± 0.12）%，感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均＜0.01）。结论　小鼠感染细粒棘球蚴6个月和12个月后，其肝脏白细胞中MDSCs与Treg细胞比例增加，前者比例变化更加明显，以M?MDSCs为主；以上提示M?MDSCs可能在小鼠感染细粒棘球蚴中后期发挥主要免疫抑制作用。     

细粒棘球蚴感染小鼠髓源抑制性细胞与Th17细胞比例的变化

目的分析细粒棘球蚴感染小鼠体内髓源抑制性细胞(MDSCs)和Th17细胞比例的变化及意义。方法将20只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为感染组和对照组,每组10只。感染组每只小鼠腹腔注射细粒棘球绦虫原头节约2 000个,对照组注射等体积生理盐水。感染后8个月(感染晚期)收集感染组和对照组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞和腹腔细胞,采用流式细胞术检测小鼠MDSCs及其亚型(M-MDSCs、PMN-MDSCs)和Th17细胞比例,采用Pearson相关性分析MDSCs、M-MDSCs、PMN-MDSCs与Th17细胞比例的相关关系。结果感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中MDSCs比例分别为(14.72±4.27)%、(57.04±6.78)%和(15.35±5.56)%,对照组分别为(8.84±2.12)%、(30.53±1.58)%和(1.74±0.63)%,感染组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05);感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中M-MDSCs比例分别为(1.29±0.24)%、(6.27±2.11)%、(2.14±0.94)%,对照组分别为(0.72±0.25)%、(2.11±1.27)%、(0.25±0.06)%,感染组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05);感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中PMN-MDSCs比例分别为(9.31±2.65)%、(46.72±5.67)%、(7.06±2.36)%,对照组分别为(7.07±3.20)%、(25.42±2.05)%、(1.08±0.40)%,感染组与对照组间外周血白细胞和腹腔细胞的PMN-MDSCs比例差异有统计学意义(P0.05)。感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中Th17细胞比例分别为(1.31±0.38)%、(1.85±0.77)%和(2.90±0.24)%,对照组分别为(0.59±0.07)%、(0.35±0.15)%和(0.41±0.12)%,感染组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05)。Pearson相关性分析结果显示,感染组小鼠脾脏、外周血和腹腔细胞中MDSCs与Th17细胞比例之间无相关关系(r=-0.354、-0.746、0.801,P0.05),感染组小鼠脾脏M-MDSCs与Th17细胞比例呈负相关关系(r=-0.896,P0.05)。结论在细粒棘球蚴感染小鼠8个月后MDSCs与Th17细胞比例均增加,感染组小鼠脾脏M-MDSCs与Th17细胞比例呈负相关关系。     

泡球蚴持续感染对小鼠肝脏纤维化的影响

目的　评价泡球蚴持续感染对小鼠肝脏纤维化的影响,为研究泡型棘球蚴病肝纤维化进展及其治疗方法提供参考。方法　以泡球蚴感染长爪沙鼠血清（25、50、100 μL）和泡球蚴及其生发层细胞、原头节分别对肝星状HSC?T6和LX?2细胞进行体外刺激48 h,采用CCK?8法检测细胞增殖,应用酶联免疫吸附试验（enzyme?linked immunosorbent assay,ELISA）检测HSC?T6细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白（collagen 1, Col1）和α?平滑肌动蛋白（α?smooth muscle actin,α?SMA）表达量。收集泡球蚴感染1、2、4、6、8个月小鼠血清和肝脏,分别采用ELISA法检测血清中Col1和α?SMA含量,采用天狼星红染色法动态观察肝脏胶原纤维沉积情况。结果　泡球蚴感染沙鼠血清体外可诱导HSC?T6和LX?2细胞增殖,不同血清剂量组细胞增殖率差异均有统计学意义（FHSC?T6 = 126.50、FLX?2 = 201.50,P 均< 0.05）;其中100 μL血清对HSC?T6和LX?2细胞促增殖率最高,HSC?T6和LX?2细胞增殖率分别为（573.36 ± 206.34）%和（940.38 ± 61.65）%。泡球蚴感染沙鼠血清体外刺激后,HSC?T6细胞培养上清中Col1和α?SMA蛋白含量均上升;且以100 μL血清刺激后Col1和α?SMA含量最高,分别为（20.99 ± 2.01） ng/mL和（305.52 ± 16.67） pg/mL。泡球蚴及其生发层细胞、原头节均可体外诱导HSC?T6和LX?2细胞增殖,增殖率分别为（142.65 ± 9.17）%和（189.99 ± 7.75）%、（118.55 ± 8.96）%和（122.54 ± 0.21）%、（156.34 ± 17.45）%和（160.59 ± 31.41）%,不同刺激组细胞增殖率差异均有统计学意义（FHSC?T6 = 11.24、FLX?2 = 47.72,P均 < 0.05）;泡球蚴及其生发层细胞、原头节刺激后,HSC?T6细胞培养上清中Col1和α?SMA含量均增高;且以泡球蚴作用最为明显,Col1和α?SMA含量分别为（4.43 ± 2.23） ng/mL和（285.20 ± 90.67） pg/mL。泡球蚴感染后1～8个月,小鼠肝脏中胶原纤维沉积持续增加;小鼠血清中Col1水平在感染后6个月达最高,为（280.26 ± 23.04） ng/mL;α?SMA水平在感染后8个月达最高,为（33.68 ± 4.45） ng/mL。结论　泡球蚴持续感染可促进肝星状细胞体外增殖及小鼠血清中Col1和α?SMA蛋白含量升高,引起小鼠肝脏中胶原纤维沉积增多。泡球蚴感染阶段是引起泡型棘球蚴病肝纤维化的关键期。     

细粒棘球蚴慢性感染阶段小鼠血清中炎症因子的变化及意义

目的研究细粒棘球蚴慢性感染阶段小鼠血清中细胞因子水平的变化,探索机体对抗寄生虫感染的免疫应答 机制。方法从病羊内脏分离细粒棘球绦虫原头节,注射入BALB/c小鼠腹腔（2 000个原头节/只）,建立细粒棘球蚴感染 小鼠模型,对照组小鼠腹腔注射等体积PBS。于感染5个月后,采集对照及感染组小鼠血清,采用流式液相多重蛋白定量 技术检测血清中多种细胞因子水平并分析。结果感染组小鼠腹腔、肝脏、肺脏等部位均出现多个单一性包囊;其血清 中IL?17A、IL?6、IFN?γ、MCP?1、IL?12P70、TNF?α等炎症因子水平均显著高于对照组（t = 2.713～9.255,P 均< 0.05）;而抑 炎因子IL?10水平亦显著升高（t = 3.936,P < 0.001）。结论细粒棘球蚴慢性感染阶段小鼠体内炎症因子水平较高,有助 于抑制虫体生长。     

BALB/c小鼠感染细粒棘球蚴致敏模型的建立和相关免疫细胞变化的研究

目的构建BALB/c小鼠感染细粒棘球蚴致敏模型,探讨小鼠相关免疫细胞的变化。方法 18只BALB/c小鼠随机均分为3组,每组6只,分别为致敏组、未致敏组和对照组。将培养的羊源细粒棘球蚴微囊腹腔注射接种感染致敏组和未致敏组小鼠(50个/鼠),建立细粒棘球蚴感染模型,对照组注射等量生理盐水。感染后6个月,致敏组经腹腔注射细粒棘球蚴粗制囊液致敏,未致敏组和对照组注射等量生理盐水。致敏后,采用症状评分表,每隔5 min对小鼠进行症状评分和肛温测定。致敏后1 h,取各组小鼠内眦静脉血和脾脏,制备脾单细胞悬液。流式细胞术检测小鼠体内树突状细胞(DC)、调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞17 (Th17)、白细胞介素-10 (IL-10)、转化生长因子-β1 (TGF-β1)、 IL-17A的变化。采用Graphad Prism 7.0软件进行作图和统计学分析。结果流式细胞术检测结果显示,小鼠DC细胞比例在对照组、未致敏组、致敏组中分别为(3.2±0.5)%、(0.2±0.1)%、(1.5±0.2)%,致敏组DC细胞比例低于对照组(P 0.01),高于未致敏组(P 0.01)。小鼠Treg细胞比例在对照组、未致敏组、致敏组中分别为(5.7±2.1)%、(15.9±3.4)%、(7.4±2.6)%,致敏组低于未致敏组(P 0.05)。小鼠Th17细胞比例在对照组、未致敏组、致敏组中分别为(4.5±0.6)%、(2.8±0.1)%、(8.6±1.6)%,致敏组高于对照组和未致敏组(P 0.01)。小鼠IL-10含量在对照组、未致敏组、致敏组中分别为(116.88±15.60)、(1 261.2±208.3)、(386.7±126.5) pg/ml,致敏组高于对照组而低于未致敏组(P 0.05)。小鼠TGF-β1含量在对照组、未致敏组、致敏组中分别为(36.0±10.2)、(225.9±64.3)、(91.7±15.7) pg/ml,致敏组高于对照组而低于未致敏组(P 0.05)。小鼠IL-17A含量在对照组、未致敏组、致敏组中分别为(57.3±14.1)、(15.1±1.6)、(168.6±50.6) pg/ml,致敏组高于对照组和未致敏组(P 0.01)。结论 BALB/c小鼠感染细粒棘球蚴致敏后,Treg细胞数量增多,促进IL-10和TGF-β1的分泌;而DC、 Th17细胞数量减少,抑制了IL-17A的产生,从而导致过敏反应。     

泡球蚴感染对小鼠脾脏CD8+ T细胞免疫功能耗竭的影响

目的　观察不同时间、不同剂量泡球蚴感染对小鼠脾脏CD8+ T细胞免疫功能耗竭的影响。方法　采集泡球蚴原头蚴虫体,经肝门静脉建立低（50个原头蚴）、中（500个原头蚴）和高剂量（2 000个原头蚴）泡球蚴感染小鼠模型,并设生理盐水对照组。于感染后早（2周）、中（12周）、晚期（24周）分别取小鼠脾脏,研磨分离淋巴细胞。流式细胞术检测不同实验组小鼠脾脏中记忆性CD8+ T细胞表型、免疫抑制性分子2B4表达水平,及其分泌γ?干扰素（IFN?γ）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）、白细胞介素?17A（IL?17A）和IL?10的能力。结果　在感染早期,高剂量泡球蚴感染诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞以中心记忆性表型为主,其比例为（35.50 ± 2.00）%,显著高于对照组（25.90% ± 2.46%）（P < 0.01）;在感染晚期,中、高剂量泡球蚴感染均诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞以效应记忆性表型为主,其比例分别为（25.70 ± 4.12）%和（28.40 ± 4.12）%,均显著高于对照组（10.50% ± 6.45%）（P均 < 0.05）。高剂量泡球蚴感染中期和晚期,中心记忆性CD8+ T细胞比例显著低于感染早期（P均 < 0.01）;高剂量泡球蚴感染晚期,效应记忆性CD8+ T细胞比例显著高于感染早期和中期（P均< 0.05）。低、中剂量泡球蚴感染早期,脾脏CD8+ T细胞分泌IFN?γ和IL?17A能力显著增强,而高剂量泡球蚴感染虽然促进小鼠脾脏CD8+ T细胞分泌IFN?γ和TNF?α能力,但感染晚期其分泌IFN?γ和TNF?α能力显著低于早期和中期（P均< 0.05）。此外,中、高剂量泡球蚴感染晚期小鼠脾脏CD8+ T细胞表面免疫抑制性分子2B4呈高表达,其比例分别为（4.73 ± 1.56）%和（4.94 ± 1.90）%,均显著高于低剂量组（2.49% ± 0.58%）和对照组（2.92% ± 0.60%）（P 均< 0.05）。结论　在低、中剂量泡球蚴感染中期和晚期,机体利用自身免疫应答能力对虫体起到杀伤和清除;而高剂量泡球蚴感染晚期可诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞上调2B4分子表达,导致免疫耗竭,造成慢性寄生。     

日本血吸虫感染过程中糖酵解途径对调节性T细胞产生的影响

目的 探索日本血吸虫感染过程中糖酵解途径对小鼠调节性T（Treg）细胞数量和功能的影响。方法 建立日本血吸虫感染小鼠模型,用糖酵解抑制剂2?Deoxy?D?glucose（2DG）或PBS对日本血吸虫感染小鼠进行6次腹腔注射后,分离脾脏细胞和肠系膜淋巴结,采用流式细胞术（FCM）检测分离得到的细胞中Glut1+CD4+ T细胞以及Treg细胞比例。结果 未感染组小鼠脾脏（43.58%±2.50% vs. 21.15%±0.96%;t = 8.834,P < 0.01）和肠系膜淋巴结中Glut1+CD4+ T细胞比例（38.97%±1.97% vs. 28.40%±2.11%;t = 3.662,P < 0.05）均显著高于感染日本血吸虫8周小鼠,但未感染组小鼠脾脏（6.83%±0.21% vs. 13.30%±0.35%;t = 15.65,P < 0.01）和肠系膜淋巴结中Treg细胞比例（8.26%±0.15% vs. 14.37%±0.44%;t = 13.14,P < 0.01）均显著低于感染组小鼠。感染小鼠给与2DG腹腔注射后,脾脏（15.50%± 0.76% vs. 13.07%±0.15%;t = 3.130,P < 0.05）和肠系膜淋巴结中Treg细胞比例（17.00%±0.41% vs. 13.83%±0.18%;t = 6.947,P < 0.01）显著高于给与PBS注射小鼠。结论 糖酵解途径抑制了日本血吸虫感染小鼠Treg细胞分化。     

细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞免疫功能的影响北大核心CSCD

目的探讨不同剂量细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞(natural killer T cells)免疫功能的影响。方法经肝门静脉注射细粒棘球蚴建立C57BL/6小鼠感染模型,对照组注射生理盐水。感染组分为低剂量组(50个原头蚴,LD)、中剂量组(500个原头蚴,MD)和高剂量组(2 000个原头蚴,HD)。于造模后12周采集小鼠肝脏和脾脏标本,采用HE及Masson染色检查肝脏病灶和纤维化程度;采用流式细胞术检测小鼠脾脏NKT细胞表型、不同NKT亚群比例,以及相关细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10及IL-17A)的表达情况。结果不同剂量细粒棘球蚴感染组小鼠肝脏均可见囊泡结构样病灶,病灶周围出现胶原沉积,对照组肝脏仅汇管区可见少量胶原沉积。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT细胞比例分别为(1.34±0.27)%和(1.33±0.21)%,与对照组(2.54±0.43)%和低剂量组(2.41±0.53)%比较差异有统计学意义(F=16.451,P<0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69^(+)CD4^(+) NKT细胞比例分别为(15.6±2.00)%和(17.5±3.98)%,与对照组(11.1±2.82)%和低剂量组(11.1±1.31)%比较差异有统计学意义(F=8.130,P<0.05)。高剂量感染组小鼠脾脏CD69^(+)CD8^(+) NKT细胞比例为(70.1±7.52)%,与对照组(85.3±2.68)%和低剂量组(83.1±3.90)%比较差异有统计学意义(F=12.42,P<0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69^(+)DN NKT细胞比例分别为(29.3±2.02)%和(27.2±5.20)%,与对照组(35.6±4.26)%比较差异有统计学意义(F=3.277,P<0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT1型细胞分泌IFN-γ比例低于对照组和低剂量组(F=40.00,P<0.01)。高剂量感染组小鼠脾脏NKT2型细胞分泌IL-4比例高于对照组、低剂量组和高剂量组(F=10.54,P<0.001)。中、高剂量感染组脾脏NKT17型细胞分泌IL-17A比例低于对照组和低剂量组(F=13.00,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏NKT10型细胞分泌IL-10比例高于对照组(F=45.59,P<0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT1型细胞分泌IFN-γ比例分别为(14.55±2.12)%和(10.43±0.85)%,与对照组(25.88±6.82)%和低剂量组(22.13±4.36)%比较差异有统计学意义(F=16.73,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT2型细胞分泌IL-4比例分别为(10.14±1.00)%、(10.64±0.73)%和(12.97±1.66)%,与对照组(7.07±0.72)%比较差异有统计学意义(F=19.99,P<0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT17型细胞分泌IL-17A比例分别为(2.46±0.72)%和(2.26±0.57)%,与对照组(4.11±1.07)%和低剂量组(4.56±0.91)%比较差异有统计学意义(F=10.54,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT10型细胞分泌IL-10比例分别为(8.42±1.38)%、(12.65±4.19)%和(15.7±3.72)%,与对照组(4.66±0.87)%比较差异有统计学意义(F=15.78,P<0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD8^(+)NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=20.08,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD8^(+)NKT型细胞分泌IL-10与高于对照组比较差异有统计学意义(F=24.41,P<0.01或P<0.001)。中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=26.82,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IL-10比例与对照组比较差异有统计学意义(F=22.96,P<0.05)。结论细粒棘球蚴感染中期,不同剂量感染诱导小鼠机体产生的细胞免疫反应由NKT1型和NKT17型模式转向NKT2型和NKT10型亚群优势,导致NKT细胞亚群之间的偏移失衡,造成细粒棘球蚴在宿主体内慢性寄生。     

PD-1/PD-L1及相关炎症因子在细粒棘球蚴感染致肝损伤中的免疫调节作用北大核心CSCD

目的探讨程序性死亡受体-1(programmed cell death receptor 1,PD-1)、程序性死亡受体配体1(programmed cell death-Ligand-1,PD-L1)及相关炎症因子在棘球蚴感染免疫损伤中的免疫调控机制。方法将BALB/c小鼠分为2个组:对照组(40只)、模型组(40只)。采用原头蚴腹腔注射制备细粒棘球蚴感染模型,腹腔接种后2 d、8 d、1个月、3个月、6个月时每组取8只小鼠行内眦静脉取血,采用流式细胞术微球阵列法试剂盒(Cytometric Bead Array,CBA)检测小鼠外周血中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的含量。取肝脏进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,采用免疫组织化学染色法检测小鼠肝组织中PD-1、PD-L1的表达。结果对照组腹部未见异常。模型组小鼠腹部出现明显膨隆,腹腔中有包囊。对照组小鼠肝组织结构正常,模型组小鼠6个月时肝脏有大片肝细胞坏死变性,可见大量炎性细胞浸润。对照组小鼠肝组织PD-1、PD-L1表达均呈阴性,模型组小鼠3个月时肝脏开始出现明显PD-1表达的阳性细胞,主要位于肝损伤区域,6个月时小鼠PD-1的表达主要集中于肝坏死区域周围,可见明显增多的阳性细胞存在。模型组2 d和8 d时均可见PD-L1表达的大量阳性细胞,1个月肝脏PD-L1呈低表达,3个月开始表达又升高。模型组小鼠TNF-α在感染2 d时高于对照组(t=15.587,P<0.05),后开始下降,从3个月开始时TNF-α升高,至6个月时达高峰,模型组小鼠血清中IL-17A在感染8 d时高于对照组(t=0.067,P<0.05),后一直呈上升趋势,至6个月时达高峰,IL-6在感染2 d开始即高于对照组,6个月时达高峰。结论IL-6、TNF-α、IL-17A参与了细粒棘球蚴感染导致的炎症反应。细粒棘球感染模型小鼠肝脏出现高表达的PD-1/PD-L1,随着时间延长,PD-1表达逐渐增强,尤其是细粒棘球蚴感染早期,PD-L1高表达,PD-1、PD-L1在感染前期、中期就开始发挥负调节作用,可进一步促进棘球蚴组织在体内迅速生长,参与肝脏的损伤作用。在细粒棘球蚴感染早、中期,阻断PD-1/PD-L1信号通路,将有助于抗棘球蚴感染。     

细粒棘球蚴囊液对体外培养小鼠脾细胞Foxp3及Smad4基因表达的影响

目的观察细粒棘球蚴囊液对体外培养BABL/c小鼠脾脏细胞中调节性T细胞(Treg细胞)相对特异分子Foxp3(叉头蛋白3)及TGF-β1(转化生长因子-β1)下游信号通路Smad4表达的影响。方法以BABL/c小鼠作为脾细胞供者,用研磨法分离脾脏细胞,随机分为实验组(与细粒棘球蚴囊液共同培养)和对照组,取1×105个细胞接种于96孔板上,分别在1、3、6和12 h提取RNA,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Foxp3以及Smad4的基因表达。结果 qRT-PCR显示,细粒棘球蚴囊液处理1、3和12 h,实验组Foxp3表达量分别为4.577±0.317、8.517±0.978和7.406±0.822,对照组分别为9.274±0.451、3.297±0.408和2.464±0.328,差异均有统计学意义(P<0.05);细粒棘球蚴囊液处理1 h和12 h,实验组Smad4表达量分别为3.862±1.417和1.690±0.248,对照组分别为1.689±0.221和3.600±1.081,差异有统计学意义(P<0.05),且Foxp3与Smad4二者之间存在负相关(r=-0.991,P<0.05)。结论...     

可诱导共刺激分子及相关细胞因子在细粒棘球蚴感染小鼠免疫调控中的作用

目的　探讨可诱导共刺激分子（inducible costimulatory molecule, ICOS）及相关细胞因子在细粒棘球蚴感染小鼠免疫调控中的作用。方法　80只BALB/c小鼠（体质量18 ~ 22 g）随机分为对照组和感染组，每组40只。按10 000个原头节/只腹腔注射制备细粒棘球蚴感染小鼠模型，腹腔接种2、8、30、60、180 d后，测定小鼠血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）含量，检测小鼠外周血细胞因子白细胞介素10（IL⁃10）和IL⁃4含量。取小鼠肝脏进行HE染色和免疫组织化学染色，应用实时定量PCR（qPCR）技术检测小鼠肝组织中ICOS表达水平。结果　细粒棘球蚴感染后2、8、30、60、180 d，小鼠血清ALT、AST和ALP水平差异均有统计学意义（F = 12.082、6.347、52.186，P均< 0.05）。感染后2 [（61.72 ± 9.89） vs. （50.65 ± 4.67） U/L]、30 d [（80.61 ± 23.71） vs. （67.75 ± 9.79） U/L]，感染组小鼠血清ALT水平显著高于对照组（P均< 0.05）；感染后2 [（181.06 ± 60.61） vs. （115.58 ± 17.66） U/L]、180 d [（137.84 ± 29.01） vs. （108.05 ± 10.33） U/L]，感染组小鼠血清AST水平显著高于对照组（P均< 0.05）；感染后2 [（162.90 ± 21.04） vs. （64.54 ± 5.99） U/L]、8 [（176.36 ± 24.56） vs. （62.70 ± 9.21） U/L]、30 d[（138.86 ± 13.59） vs. （58.60 ± 5.28） U/L]，感染组小鼠血清ALP水平显著高于对照组（P均< 0.05）。感染后30 d，感染组小鼠肝脏可见少量炎性细胞；感染后60 d，小鼠肝脏结构未见明显改变；感染后180 d，小鼠包囊浸润区肝脏可见大量上皮样细胞呈纤维化生长，生成角质层，在病灶区及肝细胞间隙有大量红细胞存在。感染组小鼠肝脏中ICOS呈阳性表达，阳性细胞主要位于肝细胞胞质中，ICOS表达水平随着感染时间延长而逐渐增强；ICOS mRNA在感染180 d后相对表达量为2.732 ± 0.094，明显高于感染后2 d（0.746 ± 0.049）。对照组小鼠血清IL⁃4、IL⁃10水平在细粒棘球蚴感染后不同时间点无显著变化；感染组小鼠血清IL⁃4、IL⁃10水平分别于感染后180 d和60 d达高峰。感染后8 [（22.50 ± 3.24） vs. （5.82 ± 0.49） pg/mL]、30 [（15.49 ± 4.73） vs. （5.10 ± 1.38） pg/mL]、60 [（36.93 ± 6.14） vs. （4.13 ± 1.19） pg/mL]、180 d [（198.35 ± 0.70） vs. （4.19 ± 0.98） pg/mL]，感染组小鼠血清IL⁃4水平均显著高于对照组（P均< 0.05）；感染后2 [（4.84 ± 1.91）vs.（2.11 ± 1.03） pg/mL]、8 [（44.72 ± 14.63）vs.（3.16 ± 0.60） pg/mL]、30 [（25.47 ± 8.00） vs. （3.83 ± 1.87） pg/mL]、60 [（187.16 ± 60.44） vs. （3.69 ± 1.05） pg/mL]、180 d [（85.40 ± 7.15） vs. （3.25 ± 0.93） pg/mL]，感染组小鼠血清IL⁃10水平均显著高于对照组（P均< 0.05）。结论　细粒棘球蚴感染小鼠肝脏出现ICOS高表达；随感染时间的延长，ICOS阳性表达逐渐增强，免疫活化水平逐渐升高，导致免疫炎症引起的肝细胞损伤逐渐加重。     

细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞免疫功能的影响

目的探讨不同剂量细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞(natural killer T cells)免疫功能的影响。方法经肝门静脉注射细粒棘球蚴建立C57BL/6小鼠感染模型,对照组注射生理盐水。感染组分为低剂量组(50个原头蚴,LD)、中剂量组(500个原头蚴,MD)和高剂量组(2 000个原头蚴,HD)。于造模后12周采集小鼠肝脏和脾脏标本,采用HE及Masson染色检查肝脏病灶和纤维化程度;采用流式细胞术检测小鼠脾脏NKT细胞表型、不同NKT亚群比例,以及相关细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10及IL-17A)的表达情况。结果不同剂量细粒棘球蚴感染组小鼠肝脏均可见囊泡结构样病灶,病灶周围出现胶原沉积,对照组肝脏仅汇管区可见少量胶原沉积。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT细胞比例分别为(1.34±0.27)%和(1.33±0.21)%,与对照组(2.54±0.43)%和低剂量组(2.41±0.53)%比较差异有统计学意义(F=16.451,P0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69~+CD4~+ NKT细胞比例分别为(15.6±2.00)%和(17.5±3.98)%,与对照组(11.1±2.82)%和低剂量组(11.1±1.31)%比较差异有统计学意义(F=8.130,P0.05)。高剂量感染组小鼠脾脏CD69~+CD8~+ NKT细胞比例为(70.1±7.52)%,与对照组(85.3±2.68)%和低剂量组(83.1±3.90)%比较差异有统计学意义(F=12.42,P0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69~+DN NKT细胞比例分别为(29.3±2.02)%和(27.2±5.20)%,与对照组(35.6±4.26)%比较差异有统计学意义(F=3.277,P0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT1型细胞分泌IFN-γ比例低于对照组和低剂量组(F=40.00,P0.01)。高剂量感染组小鼠脾脏NKT2型细胞分泌IL-4比例高于对照组、低剂量组和高剂量组(F=10.54,P0.001)。中、高剂量感染组脾脏NKT17型细胞分泌IL-17A比例低于对照组和低剂量组(F=13.00,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏NKT10型细胞分泌IL-10比例高于对照组(F=45.59,P0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT1型细胞分泌IFN-γ比例分别为(14.55±2.12)%和(10.43±0.85)%,与对照组(25.88±6.82)%和低剂量组(22.13±4.36)%比较差异有统计学意义(F=16.73,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT2型细胞分泌IL-4比例分别为(10.14±1.00)%、(10.64±0.73)%和(12.97±1.66)%,与对照组(7.07±0.72)%比较差异有统计学意义(F=19.99,P0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT17型细胞分泌IL-17A比例分别为(2.46±0.72)%和(2.26±0.57)%,与对照组(4.11±1.07)%和低剂量组(4.56±0.91)%比较差异有统计学意义(F=10.54,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT10型细胞分泌IL-10比例分别为(8.42±1.38)%、(12.65±4.19)%和(15.7±3.72)%,与对照组(4.66±0.87)%比较差异有统计学意义(F=15.78,P0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD8~+NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=20.08,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD8~+NKT型细胞分泌IL-10与高于对照组比较差异有统计学意义(F=24.41,P0.01或P0.001)。中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=26.82,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IL-10比例与对照组比较差异有统计学意义(F=22.96,P0.05)。结论细粒棘球蚴感染中期,不同剂量感染诱导小鼠机体产生的细胞免疫反应由NKT1型和NKT17型模式转向NKT2型和NKT10型亚群优势,导致NKT细胞亚群之间的偏移失衡,造成细粒棘球蚴在宿主体内慢性寄生。     

细粒棘球蚴重组抗原rEgferritin诱导宿主抗感染免疫应答的初步研究

目的 初步探讨细粒棘球蚴重组铁蛋白rEgferritin免疫小鼠产生的抗细粒棘球蚴感染的免疫机制.方法 rEgferritin免疫ICR小鼠3次、同时设立佐剂组和对照组,第12w用细粒棘球蚴原头蚴对3组小鼠进行攻击感染,5个月后剖杀小鼠,检查各组小鼠腹腔内包囊个数,根据公式计算保护力.分别于0w,12w,32w取血,制...     

泡球蚴持续感染对小鼠肝脏纤维化的影响

目的评价泡球蚴持续感染对小鼠肝脏纤维化的影响,为研究泡型棘球蚴病肝纤维化进展及其治疗方法提供参考。方法以泡球蚴感染长爪沙鼠血清(25、50、100μL)和泡球蚴及其生发层细胞、原头节分别对肝星状HSC-T6和LX-2细胞进行体外刺激48 h,采用CCK-8法检测细胞增殖,应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测HSC-T6细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白(collagen 1, Col1)和α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达量。收集泡球蚴感染1、2、4、6、8个月小鼠血清和肝脏,分别采用ELISA法检测血清中Col1和α-SMA含量,采用天狼猩红染色法动态观察肝脏胶原纤维沉积情况。结果泡球蚴感染沙鼠血清体外可诱导HSC-T6和LX-2细胞增殖,不同血清剂量组细胞增殖率差异均有统计学意义(FHSC-T6=126.50、FLX-2=201.50,P均0.05);其中100μL血清对HSC-T6和LX-2细胞促增殖率最高,HSC-T6和LX-2细胞增殖率分别为(573.36±206.34)%和(940.38±61.65)%。泡球蚴感染沙鼠血清体外刺激后,HSC-T6细胞培养上清中Col1和α-SMA蛋白含量均上升;且以100μL血清刺激后Col1和α-SMA含量最高,分别为(20.99±2.01)ng/m L和(305.52±16.67)pg/mL。泡球蚴及其生发层细胞、原头节均可体外诱导HSC-T6和LX-2细胞增殖,增殖率分别为(142.65±9.17)%和(189.99±7.75)%、(118.55±8.96)%和(122.54±0.21)%、(156.34±17.45)%和(160.59±31.41)%,不同刺激组细胞增殖率差异均有统计学意义(FHSC-T6=11.24、FLX-2=47.72,P均0.05);泡球蚴及其生发层细胞、原头节刺激后,HSC-T6细胞培养上清中Col1和α-SMA含量均增高;且以泡球蚴作用最为明显,Col1和α-SMA含量分别为(4.43±2.23)ng/mL和(285.20±90.67)pg/mL。泡球蚴感染后1～8个月,小鼠肝脏中胶原纤维沉积持续增加;小鼠血清中Col1水平在感染后6个月达最高,为(280.26±23.04)ng/mL;α-SMA水平在感染后8个月达最高,为(33.68±4.45)ng/mL。结论泡球蚴持续感染可促进肝星状细胞体外增殖及小鼠血清中Col1和α-SMA蛋白含量升高,引起小鼠肝脏中胶原纤维沉积增多。泡球蚴感染阶段是引起泡型棘球蚴病肝纤维化的关键期。     

左旋咪唑对细粒棘球蚴感染小鼠不同时期T细胞亚群的影响

目的探讨左旋咪唑（LMS）对细粒棘球蚴感染鼠的免疫调节作用和对病程转归的影响。方法昆明种小鼠腹腔接种细粒棘球蚴，建立感染动物模型。在感染后2、4、8、12、16、20周，未治疗组和实验组分别给予生理盐水和左旋咪唑（25mg／kg），连续7d，测定各组小鼠脾指数、胸腺指数及囊重，运用流式细胞术（FCM）测定小鼠脾CD4^＋和CD8^＋T细胞百分率及CD4^＋／CD8^＋比值的动态变化。另设8只未接种小鼠为健康对照。结果生理盐水组小鼠感染2周时CD4^＋、CD8^＋T细胞百分率显著高于健康对照组（P〈0．01）），随后CD4^＋T细胞的百分率逐渐降低，CD8^＋T细胞的百分率逐渐增高，至感染后16周和20周，CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞的百分率及CD4^＋／CD8^＋比值与健康对照组比较差异仍具有显著性（P〈0．01）。与生理盐水组小鼠相比，左旋咪唑组小鼠在感染2周时CD4^＋、CD8^＋T细胞的百分率明显增高，与健康组小鼠相比有统计学意义（P〈0．01）；在感染16周和20周时脾指数升高，CD4^＋T细胞百分率上升，CD8^＋T细胞的百分率下降，CD4^＋／CD8^＋比值升高，平均囊重下降，与生理盐水组比较差异均有显著性（P〈0．01）。结论左旋咪唑对细粒棘球蚴感染小鼠有免疫调节作用，在感染后期可升高小鼠脾指数，使CD4^＋T细胞及CD8^＋T细胞比例恢复正常，机体的细胞免疫功能增强，从而减缓细粒棘球蚴的增殖。     

多房棘球蚴感染小鼠脾CD4~+T细胞亚群及其功能耗竭的变化

目的研究不同数量多房棘球蚴感染对小鼠脾CD4~+T细胞亚群及其免疫功能的影响。方法60只C57BL/6小鼠随机分为4组,每组15只,分别为假手术组、低数量感染组(50个原头节)、中数量感染组(500个原头节)和高数量感染组(2 000个原头节)。小鼠麻醉后经肝门静脉部位穿刺,注射不同数量原头节,假手术组注射等量生理盐水。于感染后2、 12和24周各组分别取5只小鼠,取脾组织研磨分离淋巴细胞。流式细胞术检测各组小鼠脾CD4~+T细胞记忆表型、不同亚群比例、免疫抑制性分子淋巴细胞活化蛋白3 (LAG3)表达。采用GraphPad Prism 6.0软件进行作图和统计学分析。结果感染后2周,低数量和中数量感染组小鼠脾CD4~+IFN-γ~+T细胞比例分别为(7.54±1.44)%、(7.58±3.17)%,高于假手术组的(3.52±1.03)%(P 0.05);CD4~+TNF-α~+T细胞比例分别为(39.34±4.19)%、(39.53±10.74)%,高于假手术组(22.62±1.50)%(P 0.01)。感染后12周,低数量和中数量感染组小鼠脾CD4~+IFN-γ~+T细胞比例分别为(16.52±0.77)%、(22.98±4.32)%,高于假手术组(16.88±2.49)%(P 0.05); CD4~+TNF-α~+T细胞比例分别为(27.26±2.12)%、(28.36±5.24)%,高于假手术组(19.72±3.87)%(P 0.05); CD4~+IL17A~+T细胞比例分别为(10.70±1.81)%、(11.52±2.68)%,高于假手术组(5.40±1.32)%(P 0.01);同时,低数量和中数量感染组小鼠脾CD4~+IL-4~+T细胞比例分别为(2.87±0.84)%、(3.50±0.77)%,高于假手术组(1.75±0.83)%(P 0.01); CD4~+IL-10~+T细胞比例分别为(4.63±0.78)、(7.09±2.42)%,高于假手术组(3.03±0.79)%(P 0.01)。感染后24周,中数量、高数量感染组小鼠脾CD4~+IFN-γ~+T、 CD4~+TNF-α~+T、 CD4~+IL-4~+T、 CD4~+IL-10~+T和CD4~+IL17A~+T细胞的比例均高于假手术组(P 0.05),且高数量组小鼠脾Treg细胞的比例高于假手术组(P 0.01),各感染组小鼠脾效应记忆性CD4~+T细胞比例高于假手术组;各感染组小鼠脾CD4~+LAG3~+T细胞比例分别为(16.45±4.89)%、(14.54±4.96)%、(14.62±2.43)%,高于假手术组(8.43±3.46)%(P 0.05)。感染后24周,高数量组小鼠脾CD4~+T细胞中分泌IFN-γ和TNF-α的LAG3阳性群细胞比例分别为(1.67±0.66)%、(0.69±0.27)%,低于阴性群的(5.11±1.81)%、(31.7±12.1)%(P 0.01)。结论低、中数量多房棘球蚴感染后,小鼠可能利用T1型和T17型免疫应答优势对虫体起到杀伤和清除;而高数量感染诱导脾T1/T2型和T17/Treg型免疫应答失衡,以及CD4~+T细胞上调LAG3分子表达,导致功能耗竭,造成棘球蚴慢性寄生。     

细粒棘球蚴感染小鼠单核髓源抑制性细胞精氨酸酶的表达和活性研究

目的分析细粒棘球蚴感染小鼠单核髓源抑制性细胞(M-MDSC)精氨酸酶的表达和活性变化。方法 12只BALB/c雌性小鼠随机分为对照组和感染组。感染组小鼠腹腔注射活原头节2 000个/只,对照组小鼠注射等体积生理盐水。于感染后120 d采集小鼠眼眶静脉丛外周血,解剖并观察小鼠腹腔和各脏器的病变。无菌取小鼠脾组织,制备单细胞悬液后,利用免疫磁珠分离M-MDSC。提取并纯化M-MDSC RNA,合成c DNA,芯片检测筛选感染组和对照组的M-MDSC差异基因,荧光定量PCR验证差异基因的表达。精氨酸酶检测试剂盒检测小鼠外周血中的精氨酸酶活性。结果BALB/c小鼠感染细粒棘球蚴原头节后120 d,腹腔和内脏器官中形成单性包囊。免疫磁珠分离获得M-MDSC。芯片杂交和荧光定量PCR检测结果显示,感染组小鼠M-MDSC源精氨酸酶相对表达量分别为7.92±0.85和11.97±5.39,均高于对照组小鼠(1.65±0.19和1.00±0.57)(P0.05)。检测结果表明,感染组小鼠外周血中的精氨酸酶活性为(3.83±0.44)U/L,高于对照组小鼠[(1.57±0.57)U/L](P0.05)。结论细粒棘球蚴感染小鼠M-MDSC精氨酸酶的表达量和活性显著升高。     

羊棘球蚴囊液抗原B诊断早期实验棘球蚴病鼠的研究

采用两种抗原（抗原Ｂ和粗抗原）通过ＥＬＩＳＡ法检测感染细粒棘球蚴和多房棘球蚴２－３月的小鼠,正常鼠以及棘球蚴病人,非棘球蚴病人和健康人血清抗体。结果表明,抗原Ｂ和粗抗原检测２月细粒棘球蚴鼠血清抗体阳性率分别为９５％和１００％。检测３月细粒球蚴病鼠血清抗体均为１００％,检测正常血清的假阳性率分别为０和５％。     

细粒棘球蚴感染对小鼠炎症性肠病的保护机制研究

目的 观察细粒棘球蚴感染对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠炎症性肠病(IBD)症状的保护作用及可能机制。方法 建立继发性细粒棘球蚴感染小鼠模型,再给予DSS诱导IBD症状,解剖后ELISA法检测小鼠血清中囊液抗原水平,并观察腹腔内的包囊;根据每日体重监测、解剖后结肠长度测量及结肠组织病理学评分指标评估细粒棘球蚴感染对炎症性肠病的保护作用;采用流式细胞术CBA法检测模型鼠血清中Thl/Th2/Thl7水平,评价细胞因子对炎症性肠病的保护作用。结果 小鼠感染细粒棘球蚴后血清HCF抗体阳性率与成囊率均为100%。细粒棘球蚴感染减轻了DSS引起的小鼠体重下降程度;结肠变短程度减小,HE染色检查小鼠结肠组织炎性症状显著改善。CBA检测显示细粒棘球蚴感染小鼠血清IL-4、IL-10、IL-17A、IL-6、IFNγ含量均较正常小鼠显著增加,表现为Th2为主的免疫反应;细粒棘球蚴感染合并IBD模型组小鼠Th2/Th1型细胞因子比率同IBD组相比显著升高。结论 细粒棘球蚴感染IBD模型小鼠血清IL-4、IL-10水平升高,Th2高水平状态削弱了DSS引发的Th1反应,表明细粒棘球蚴感染可改善IBD小鼠...     

腹腔感染棘球蚴微囊对小鼠肝脏多房棘球蚴感染及致病的影响

目的探讨腹腔感染细粒棘球蚴（Eg）或多房棘球蚴（Em）微囊对小鼠肝脏Em感染及致病的影响。方法收集Eg和Em原头节，分别体外成囊培养6周和8周。将60只C57雌性小鼠随机分为Em/Em感染组、 Eg/Em感染组、单纯Em肝脏感染组和假手术组等4组，每组15只。Em/Em感染组、 Eg/Em感染组、单纯Em肝脏感染组小鼠分别腹腔注射感染Em微囊50个（1×PBS缓冲液稀释至1 ml）、 Eg微囊50个（1×PBS缓冲液稀释至1 ml）、生理盐水1 ml,1个月后小鼠开腹，经肝门静脉注射感染2 000个（200μl）Em原头节；假手术组小鼠腹腔和肝门静脉注射等量生理盐水。小鼠腹腔感染前及感染后第1、 3和6个月尾静脉采血，ELISA检测血清中抗包囊囊液蛋白抗体情况。肝门静脉感染后1、3和6个月，每组各剖检5只小鼠，肉眼观察肝脏病灶感染情况，并进行量化计分。取各组小鼠大叶肝脏，进行石蜡切片和HE染色，观察肝脏病灶组织情况。采用SPSS 21.0进行统计学分析，数据采用独立样本t检验。结果 体外培养6周的Eg微囊直径为300～500μm，培养8周的Em微囊直径为150～300μm。ELISA结...