滤泡辅助T细胞与HIV感染者中和抗体的相关研究进展

滤泡辅助T细胞(Tfh)是最近发现的一群具有辅助B细胞功能的辅助T细胞,在机体体液免疫中具有重要作用。最近研究发现,滤泡辅助T细胞与艾滋病病毒(HIV)感染者的中和抗体有关,Tfh细胞表达量越高,相对应的HIV-1感染者的中和抗体的活性越明显,该发现极大地推动了艾滋病疫苗的研究。对Tfh细胞进行深入研究,将为刺激机体产生如HIV-1自然感染过程中产生的广谱中和抗体的艾滋病疫苗研究提供新途径。该文即对滤泡辅助T细胞和HIV感染者的中和抗体间的相关研究进展进行综述。     

HIV-1中和抗体的作用与机制及实验室检测进展

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)中和抗体在防止病毒感染方面起到重要作用.最近的研究表明,中和抗体也能协同细胞免疫应答延缓感染者的疾病进程.HIV-1中和抗体主要通过结合HIV-1感染细胞过程中暴露的各种中间结构而干扰HIV-1进入靶细胞,从而阻断感染的发生.同时,病毒通过变异和外膜糖蛋白(Env)的高度糖基化发生免疫逃逸.目前中和抗体的检测主要依赖于体外中和试验,近年来研究者不断对该试验方案进行优化和标准化.对中和抗体作用的相关机制的逐渐阐明、相关检测技术的发展,必将推进疫苗研究的发展,并为疫苗评价提供新的可信的实验依据.     

HIV-1近膜端表位及其免疫原设计的研究进展

HIV疫苗所研究的免疫原设计主要针对HIV包膜蛋白进行,其gp41近膜端(Membrane-proximal external region,MPER)被证实是高度保守的线性表位。已报道的广谱中和抗体2F5、4E10及10E8靶向于该表位,但由于MPER自身免疫原性较差,为提高其免疫原性、更好激起机体体液免疫反应等考虑,进行MPER免疫原的设计以获得类似广谱中和抗体成为HIV-1研究的热点之一。本文对近年来MPER表位的研究及其免疫原的设计进行系统的综述,为后续在艾滋疫苗免疫原的设计上提供思路。     

HIV-1广谱中和抗体及其临床应用

随着抗原特异性B细胞分选和单细胞抗体克隆技术的应用,从2009年至今,已经获得了上百种艾滋病病毒1型(HIV-1)广谱中和抗体(bNAbs),其中大部分抗体针对不同的病毒株显示出具有更广谱更高效的中和活性。在动物实验中,HIV-1bNAbs被动免疫不仅可以抑制病毒感染,减少急性期病毒的潜伏,而且可以延迟或阻止感染者停药后血浆中病毒的反弹,维持抗反转录病毒治疗对病毒的抑制效果。最近bNAbs 3BNC117和VRC01已经应用于Ⅰ期临床人体接种试验研究。文章重点对HIV-1bNAbs的临床试验研究进行综述,这将有利于了解bNAbs在人体临床试验中的安全性和有效性,并为防治策略的制定提供新的思路。     

1例慢性HIV-1感染者体内CD4结合位点特异性记忆B细胞分选及抗体表达研究

目的通过抗原特异性记忆B细胞(Memory B)分选、抗体基因克隆表达和鉴定方法,从艾滋病病毒1型(HIV-1)感染者中获得HIV-1中和抗体,并进一步探讨获得抗体的特征。方法通过检测血浆中和抗体活性和表位筛选,挑选出1例含有CD4结合位点(CD4bs)特异性抗体的慢性HIV-1感染者。采用一对含有/缺失CD4-bs的探针RSC3/ΔRSC3进行Memory B分选,获得抗体可变区基因后进行抗体的表达纯化,并检验所得抗体的结合能力和中和能力。结果从9×106外周血单核淋巴细胞(PBMCs)中分离得6个特异性Memory B。通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别扩增出3对重链和轻链可变区基因,配对得到3个抗体,其中有一个抗体具有HIV-1CD4bs结合能力。中和实验表明,这个抗体能中和毒株SF162[50%抑制浓度(IC50=0.89μg/mL]。抗体可变区基因家系分析表明,该抗体属于IGHV1-18家系,重链可变区(VH)自体突变率为12%,低于广谱中和抗体VRC01VH的自体突变率(32%)。结论建立的单克隆特异性Memory B分选方法,可以获得有中和能力的抗体。该平台有希望获得具有我国自主知识产权的广谱中和抗体,并为开发抗体药物和设计新型免疫原提供技术支持。     

HIV-1CN54合成gp120基因(syngp120)的DNA疫苗鼻内免疫小鼠诱导全身的和粘膜的免疫应答

目的 初步探讨HIV-1CN54合成gp120基因的DNA疫苗（pcDNA3.1-syngp120）鼻内接种小鼠是否诱发免疫应答。方法　DNA疫苗免疫后,制备脾和肠系膜淋巴结（MLN）淋巴细胞,在体外测其增殖应答和CD8+CTL应答。间接ELISA法测血清和粘膜洗液抗原-特异的IgG和IgA抗体滴度。中和实验测免疫血清和阴道洗液是否中和 HIV-1SF33。结果 在 DNA疫苗未次免疫后,小鼠第 1周检测到脾和 MLN CD8+CTL应答较弱,而第 5周未检测到。另外,在末次免疫后的第1、5周检测到MLN而未检测到脾淋巴细胞发生增殖应答。并且检测到特异的血清IgG抗体和粘膜的（包括粪便和阴道洗液）IgA抗体,但未检测到血清的IgA抗体和粘膜的（包括粪便和阴道洗液）IgG抗体。中和实验发现末次免疫后第5周的血清能中和实验室毒株HIV-1SF33（B亚型）,而阴道洗液则没有。结论 该DNA疫苗鼻内免疫小鼠可诱导粘膜免疫应答,包括 MLN淋巴细胞增殖应答和 CD8+CTL应答,同时诱导较弱的粘膜IgA抗体应答。此外,能诱导脾CD8+CTL应答和血清IgG抗体应答。免疫血清中和HIV-1S F33,而阴道洗液不能。     

HIV-1膜蛋白gp140三聚体疫苗的构建和免疫原性研究

目的构建表达中国流行株HIV-1CRF_07B/C亚型(HIV-1CN54)膜蛋白gp140和gp140FdFc三聚体疫苗,比较其免疫原性。方法构建gp140和gp140FdFc重组质粒,将质粒分别瞬时转染293F细胞,120小时后收获上清液,经纯化、浓缩、PBS置换、BCA试剂盒检测蛋白质浓度后,利用SDS-PAGE电泳检测蛋白分子量大小及纯度,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其与阳性病人血清的反应性。通过肌肉注射的方式分别免疫兔子,取兔子血清,ELISA检测血清抗体,并通过假病毒系统检测血清中和抗体滴度,比较gp140和gp140FdFc的免疫原性。结果成功获得基因重组gp140和gp140FdFc蛋白。免疫兔子后,gp140和gp140FdFc蛋白质均有很强的体液免疫应答,抗gp160抗体滴度分别为2.24×105和4.48×105,但gp140组未诱导出中和抗体,gp140FdFc组对4种假病毒具有一定的中和活性。结论 Gp140FdFc三聚体能诱导兔子产生较强的结合抗体和一定的中和抗体反应,可作为潜在的HIV-1免疫原进行疫苗研究。     

HIV中和抗体的多反应性/自身反应性研究进展

广谱高效中和抗体在对抗艾滋病病毒(HIV)感染的免疫中起关键作用。HIV感染后CD4+T淋巴细胞的缺失,使依赖于T细胞的B细胞体液免疫功能受抑制,多数HIV感染者无法通过自然途径产生广谱高效中和抗体,通过设计疫苗进行人工诱导仍是主要目标。近年研究表明,部分广谱高效中和抗体具有多反应性/自身反应性,且从HIV感染者体内HIV抗原特异性B细胞克隆表达的单克隆抗体也多是多反应性/自身反应性抗体,使得多反应性抗体在对抗HIV感染领域的研究成为热点。关于这些多反应性抗体是否可提供高效的免疫保护,因此可以作为人工疫苗的诱导靶点是现阶段需要解答的重要课题。文章介绍了目前HIV高效广谱中和抗体的种类和识别位点,针对多反应性/自身反应性的HIV抗体,对其产生机制和临床意义进行全面探讨,并展望其在疫苗设计中作为诱导靶点的潜在价值。     

HIV-1感染对麻疹疫苗接种效果有影响

据约翰霍普金斯大学报道,在HIV感染高发地区,人群大规模接种麻疹疫苗后免疫力将受到影响。研究人员通过卫星图像随机选择赞比亚家族中9个月至5岁的儿童1015人,通过口腔液体样本检测麻疹病毒和HIV-1的抗体。853例（84％）有接种麻疹疫苗史。具有HIV-1抗体的儿童54人中33例（61％）有麻疹抗体,而无HIV-1抗体的儿童796人中568例（71％）有麻疹抗体。研究人员表示,在赞比亚HIV-1感染的高发地区,虽然强化接种了麻疹疫苗,但是人群的免疫力仍然令人堪忧。     

不同病期HIV-1感染者的血浆中和抗体研究

目的了解HIV-1感染者体内中和抗体状况,探讨HIV-1感染的病理机制.方法病毒的分离和培养采用共培养(co-culture)方法,从29例HIV-1感染者的外周血淋巴细胞(PBMC)分离了29株HIV-1原代病毒,中和实验采用病例血浆中和分离的相应病毒株,再感染经PHA刺激活化后的正常人PBMC,培养5天检测其HIV-1 p24抗原含量以判断中和效果.结果29例研究时象中,24例是无症状感染者,5例为AIDS患者.我们发现17例无症状感染者的ID50≥8,其中10例ID90≥8,4例产生高滴度中和抗体ID90≥64,交叉中和实验结果表明这4例感染者的血浆对异体病毒均有不同程度的中和效应,其中尤以s7,s28作用最强.而AIDS患者中仅2例ID50≥8,其中1例ID90≥8,无1例产生高滴度中和抗体.结论通过对HIV-1感染者血浆中和效应的观察,表明多数感染者对自身同血源病毒的中和抗体滴度较低,但也有少数感染者能产生较高滴度的中和抗体,有必要深入研究其广泛的中和病毒效应;此外,早期无症状的感染者似比晚期有症状者对自体病毒的中和效应强,提示抗病毒治疗应于感染早期进行,以免机体体液免疫反应的进一步恶化.     

小分子多肽与人类免疫缺陷病毒感染的关系

目的 探讨人类免疫缺陷病毒（HIV-1）感染者体内可能存在的保护性中和抗体。方法 方法 应用ELISA等方法检测正常对照人群，HIV-1感染无症状组，长期生存组和艾滋病患者体内小分子多肽抗体（抗-R7V）分布状况。结果 抗R7V在无症状组和长期存活组中检出率较高，而在进展者和艾滋病患者中存在较低，并发现抗-R7V能中和HIVRNA。结论 抗-R7V的存在与病情进展有密切关系。能够使HIV感染者长期处于无进展状态，延缓或者阻止感染者发展为艾滋病。     

抗人CCR5多克隆抗体体外阻断HIV-1假病毒感染的研究

目的制备鼠抗人CC型趋化因子受体5(CCR5)特异性Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)中和抗体。方法用稳定表达人CCR5的CHO-R5细胞腹腔免疫BALB/c小鼠;流式细胞术的方法分析免疫血清对GHOST-R5细胞的结合;纯化免疫血清总IgG抗体,HIV-1假病毒中和试验分析血清总IgG的中和活性。结果流式细胞术的结果显示,CHO-R5细胞免疫组小鼠血清,对GHOST-R5结合的平均荧光强度显著高于对照组(P0.001);HIV-1假病毒中和试验的结果发现,纯化的CHO-R5细胞组小鼠免疫血清总IgG,可抑制HIV-1假病毒在体外感染GHOST-R5细胞,抑制作用具有剂量依赖性,最高抑制率达到92%。结论成功诱导出具有中和HIV-1活性的鼠抗人CCR5的多克隆抗体。     

HIV-1 B′亚型毒株感染者广谱中和活性样本不同时间点env基因变异研究

目的探讨具有广谱中和活性的艾滋病病毒-1型(HIV-1)B′亚型毒株感染者,连续五个时间点样本的膜蛋白基因(env)序列的特征。方法采用单基因组扩增法扩增env基因。分析不同时间点env基因序列的特征及代表性广谱中和抗体(bNAbs)表位的变异。结果 env基因系统进化分析发现,感染者体内包含优势和劣势两个不同株系的病毒,优势株系毒株可变区多样性随时间增大,尤以V1V2环序列长度和糖基化位点变异程度最高;优势和劣势株系病毒的顶端四肽分别为GQGR和GPGK,辅助受体均为CCR5。代表性广谱中和抗体表位分析显示,2G12和PG9/PG16识别的关键位点存在变异。结论 B′亚型毒株感染者体内包含优势和劣势两个不同株系的病毒,优势株系病毒在中和选择压力下不断进化;单抗表位变异分析表明,感染者体内可能存在2G12和PG9/PG16样抗体。     

人TGF融合疫苗诱导抗体在貂肺上皮细胞的活性检测

目的TGF-β1疫苗诱导Balb/c小鼠产生抗体及对TGF-β1体外中和活性.方法通过已构建成功的TGF-β1疫苗免疫小鼠,诱导产生高效价中和抗体,抗TGF-β1抗体及合成的抗原肽ELISA法检测免疫血清抗体滴度,经貂肺上皮细胞生长抑制法,检测抗体血清对TGF-β1体外中和活性.结果抗TGF-β1疫苗可以诱导高滴度的抗体产生,可与抗TGF抗体及抗原肽结合,可以阻断TGF-β1对貂肺上皮细胞的抑制活性.结论构建的抗TGF-β1疫苗可以诱导高滴度的中和抗体产生,在体外阻断TGF-β1活性,可以作为抗纤维化疫苗用于抗纤维化动物模型研究.     

一种Asia Ⅰ型口蹄疫重组表位蛋白的表达及免疫活性

目的 构建一种能预防Asia Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)的感染表位重组蛋白疫苗,并对其免疫学活性进行研究.方法 以Asia Ⅰ型FMDV VP1上的B细胞表位和T细胞表位氨基酸序列为抗原位点,设计了包含上述位点的、具有最佳空间构象的重组蛋白,命名为"CZ-1".通过PCR及基因克隆等方法 构建了其表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.通过镍亲和层析和G-25凝胶过滤层析纯化及复性,获得具有免疫学活性的重组蛋白CZ-1.免疫豚鼠获得含针对AsiaⅠ型FMDV中和抗体的血清,通过细胞中和试验及乳鼠中和试验,检测豚鼠血清中抗FMDV的保护性中和抗体滴度.结果 该基因工程重组蛋白能够在动物体内诱导产生抗AsiaⅠ型FDMV具有保护性的中和性抗体.结论 该基因工程重组蛋白有望开发成预防AsiaⅠ型FDMV感染的新型疫苗.     

重组转化生长因子β1疫苗诱导产生抗体的活性检测及抗纤维化作用

目的探讨重组转化生长因子（TGF）β1疫苗诱导Balb／c小鼠产生的抗体对TGFβ1体外中和活性检测及抗肝纤维化作用。方法TGFDl抗原表位插入乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的免疫优势区c／e1区，原核表达蛋白作为重组TGFβ1疫苗免疫小鼠，诱导产生高效价中和抗体，酶联免疫吸附法检测免疫血清抗体滴度，貂肺上皮细胞生长抑制法检测抗体血清对TGFβ1体外中和活性，将疫苗用于四氯化碳造模的小鼠预防肝纤维化。结果重组TGFβ1疫苗可以诱导小鼠产生高滴度的抗-TGFβ1并与表达的融合蛋白及抗原肽结合，可以阻断TGFβ1对貂肺上皮细胞的抑制活性，减轻小鼠肝纤维化。结论HBCAg作为载体蛋白构建的重组TGFβ1疫苗可以诱导高滴度的中和抗体产生，在体外阻断TGFβ1活性，可作为抗纤维化疫苗用于抗纤维化动物模型。     

日本脑炎病毒DNA疫苗和基因工程亚单位颗粒疫苗的动物保护实验研究

目的　评价 3种日本脑炎病毒 (JEV)新型疫苗 ,即E蛋白病毒样颗粒 (VLPs)、DNA疫苗 (pV/JE)以及E蛋白颗粒 (Eps)的动物免疫效果。方法　BALB/c小鼠经 2次接种疫苗后 ,测定其病毒特异性的CTL活性、结合抗体、中和抗体 ,并以10LD5 0JEV攻击免疫小鼠 ,观察其保护效果。结果　各新型疫苗组的CTL活性为 33%～ 5 6 % ,灭活疫苗组为 2 2 % ,而载体和PBS对照组的CTL活性分别为 17%和 18%。一次免疫后 ,实验组小鼠血清结合抗体阳转率为 90 %。除DNA疫苗组外 ,各组小鼠的二次免疫血清抗体效价高于一次免疫的抗体效价 (P <0 0 5 ) ,且以VLPs加佐剂组小鼠血清抗体效价最高 ,Eps加佐剂组次之 ,均高于 pV/JE组和灭活疫苗组 (P <0 0 5 )。三种疫苗可诱发小鼠产生中和抗体。各实验组小鼠能够抵抗JEV的攻击 ,而对照组小鼠的死亡率为 37 5 %。结论　三种新型疫苗可以正确表达JEV的E蛋白表位 ,可诱发免疫小鼠产生抗JEV的中和抗体并有保护性作用 ,免疫效果优于灭活疫苗 ,有可能成为候选的JEV新型疫苗。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的初步免疫学研究

目的利用构建成功的重组真核表达质粒pgB免疫小鼠,探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-I）gB基因作为基因疫苗的可能性。方法用重组真核表达质粒pgB免疫小鼠,通过中和试验、ELISA方法检测pgB接种小鼠的免疫效果,并对免疫的小鼠进行病毒攻击。结果实验小鼠产生了对HSV-1特异性的抗体（抗体滴度：ELISA法1：273,中和试验法：1：49）,实验组中和效价显著高于载体对照组和阴性对照组（P〈0．01）;对病毒的攻击并有免疫保护作用,实验组和空白对照组比较（P〈0．01）。结论证明pgB真核表达质粒,具有DNA疫苗作用,可在小鼠体内诱发保护性免疫反应,pgB有可能作为基因疫苗用于单纯疱疹病毒性角膜炎预防和治疗,为进一步构建单纯疱疹病毒糖蛋白联合疫苗并最终用于单疱病毒角膜炎奠定了理论基础。     

针对我国HIV-1流行株的AIDS疫苗研究策略与进展——国家传染病重大专项进展介绍

虽然RV144 AIDS疫苗临床试验观察到了部分保护效果,但远未达到临床应用的要求,其保护水平有待进一步提高.鉴于抗体反应和T细胞反应在抵抗和控制HIV-1感染过程中的重要作用,我们认为可以通过同时活化有效的抗体反应和T细胞反应来提升AIDS疫苗的保护效果.在国家传染病重大专项课题的资助下,本实验室设计了一套针对我国HIV-1流行株的AIDS疫苗策略,本文简要介绍我们的设计方案及主要研究进展.     

单纯疱疹病毒I型糖蛋白B基因疫苗的初步免疫学研究

目的 利用构建成功的重组真核表达质粒pgB免疫小鼠,探讨单纯疱疹病毒I型(HSV-Ⅰ)gB基因作为基因疫苗的可能性.方法 用重组真核表达质粒pgB免疫小鼠,通过中和试验、ELISA方法检测pgB接种小鼠的免疫效果,并对免疫的小鼠进行病毒攻击.结果 实验小鼠产生了对HSV-1特异性的抗体(抗体滴度:ELISA法1∶273,中和试验法:1∶49),实验组中和效价显著高于载体对照组和阴性对照组(P＜0.01);对病毒的攻击并有免疫保护作用,实验组和空白对照组比较(P＜0.01).结论 证明pgB真核表达质粒,具有DNA疫苗作用,可在小鼠体内诱发保护性免疫反应,pgB有可能作为基因疫苗用于单纯疱疹病毒性角膜炎预防和治疗,为进一步构建单纯疱疹病毒糖蛋白联合疫苗并最终用于单疱病毒角膜炎奠定了理论基础.