犬钩虫核糖体蛋白L36及S4A全长cDNA克隆与蛋白特性分析

目的克隆犬钩虫Ancylostoma caninum核糖体蛋白L36（AcaRPL36）及S4A（AcaRPS4A）全长cDNA序列,并对编码的蛋白特性进行分析,探讨它们在研究系统发育中的应用。方法运用3′RACE技术并结合RT-PCR技术先后分别从犬钩虫中克隆核糖体蛋白L36及S4A的部分序列,经拼接后获得全长cDNA序列。用BlastP搜索相似性序列及保守结构域,所获序列在GenBank中登记,并用Neighbor-Joining（NJ）法构建基于RPL36及RPS4氨基酸序列的系统发育树。结果AcaRPL36全长cDNA序列（GenBank登录号为EF490128）为390 bp,开放阅读框为315 bp,编码104个氨基酸组成的蛋白;AcaRPS4A全长cDNA序列（GenBank登录号为EF490129）为880 bp,开放阅读框为786bp,编码261个氨基酸组成的蛋白。RPL36及RPS4序列较保守,与Caenorhabditis elegans等的亲缘关系较近的生物,在系统发育树中的遗传距离也较近。结论首次获得犬钩虫RPL36及RPS4A,RPL36和RPS4可能作为分子指标应用于研究生物系统发育。     

家蝇抗真菌肽-1的cDNA克隆及其编码蛋白序列的生物信息学分析(英文)

目的克隆家蝇抗真菌肽-1(MAF-1)的cDNA序列并对其编码的蛋白序列进行生物信息学分析。方法根据MAF-1的N端30个氨基酸序列设计简并引物,采用RACE法和巢式PCR技术克隆MAF-1的3′端和5′端cDNA序列,获得MAF-1的cDNA序列和氨基酸序列。根据所得MAF-1成熟肽部分的cDNA序列设计引物进行RT-PCR,对序列进行验证并运用生物信息学软件进行分析。结果 MAF-1的3′端cDNA序列长度为568bp,开放阅读框长度为441 bp,编码蛋白序列共147个氨基酸,3′端非编码区127bp。经NCBI中Blast比对未找到同源序列,提示该基因为一全新序列,登录到GenBank,获得登录号HM178948。该基因编码的147个氨基酸加上MAF-1的N端未用来设计引物的9个氨基酸,全长共156个氨基酸。由5′RACE获得139 bp cDNA序列,分析所得MAF-1成熟肽的氨基酸序列与前述一致。RT-PCR结果证实了RACE所得MAF-1序列的正确性。根据生物信息学分析方法对所推导的MAF-1蛋白全长序列进行分析,其理论相对分子质量和等电点均与其实际检测值相近。利用ExPASy的各种分析工具对M...     

中华按蚊水通道蛋白(AsAQP)cDNA克隆与序列分析

目的克隆中华按蚊水通道蛋白(AsAQP)基因的cDNA全长序列,分析其基因序列特征,为研究AsAQP的生物学功能提供分子基础。方法根据已报道的昆虫水通道蛋白(AQP)氨基酸序列的保守区域,采用兼并引物从中华按蚊cDNA中获取AsAQP基因片段,在此基础上利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆该基因cDNA全长序列,并用生物信息学方法对获取的序列进行分析。结果利用兼并引物从中华按蚊成蚊cDNA中分离到AsAQP基因片段,利用RACE技术克隆到该基因的全长cDNA。序列分析表明,该基因cDNA全长762 bp,编码253个氨基酸,蛋白分子量约为63.2 kD。生物信息学分析表明,AsAQP具有典型的6个跨膜区结构和2个天冬酰胺酸脯氨酸丙氨酸(NPA)结构,该结构是主要内在蛋白(MIP)家族典型的结构特征。AsAQP与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)AQP及埃及伊蚊(Aedes aegypti)AQP蛋白的同源性分别为76%和78%。氨基酸序列聚类分析表明,AsAQP与其他蚊种的水通道蛋白遗传距离较近。结论利用兼并引物结合RACR技术首次获得了编码AsAQP基因的cDNA全长序列,该基因属于MIP蛋白家族成员,具有典型的功能域,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

编码日本血吸虫Argonaute蛋白全长cDNA克隆、表达及初步鉴定

目的获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA,并进行克隆和重组融合蛋白表达。方法利用RACE技术获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA并对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(Realtime PCR)分析该基因在日本血吸虫中的转录情况。原核表达保守功能域蛋白和全长蛋白,利用保守功能域重组融合蛋白免疫昆明系小鼠制备多克隆抗体。免疫印迹(Western blot)进行免疫学分析。结果本研究获得了一个编码日本血吸虫Argo-naute基因的全长cDNA,其完整开放阅读框为3 030 bp,编码1 009个氨基酸,预测分子量为111.7 kDa。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白序列具有Argonaute家族蛋白的典型结构域特征,且与人、鼠Argonaute蛋白具有较高的同源性。Real-time PCR分析表明该基因在7,14日龄的日本血吸虫童虫中转录较高。Western blot分析制备的多抗具有较高的特异性并能识别全长融合蛋白。结论获得了编码日本血吸虫Argonaute基因的cDNA及重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

旋毛虫成虫cDNA文库免疫筛选及序列分析

目的　为获得旋毛虫成虫抗原基因。　方法　应用免疫血清和人工感染血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行免疫筛选、克隆测序及核苷酸序列数据库 (GenBank)查寻比较 ,采用DNAstar软件进行基因序列分析。　结果　免疫筛选成虫cDNA文库 ,获得 9个阳性克隆。对其中的Ts87进行测序 ,又采用 5′ RACE ,获取全长为 1172bp的cDNA片段 ,该基因编码 3 47个氨基酸。序列分析表明 ,克隆Ts87是个尚未见报道的旋毛虫基因序列 ,存在预测的抗原表位。　结论　获得具有抗原性的旋毛虫抗原新基因。     

旋毛虫抗原基因Ts88的克隆及鉴定

目的　获取旋毛虫具有抗原性的新基因。方法　应用旋毛虫免疫血清和人工感染血清对旋毛虫成虫cDNA文库约 3× 10 5重组噬菌斑进行筛选。基因克隆、DNA测序及 5′ -RACE获cDNA全长 ;采用ESEE、DNAstar软件及核苷酸序列数据库 (GenBank)进行cDNA序列分析。结果与结论　免疫筛选成虫cDNA文库 ,获得 3个阳性克隆。其中的Ts88克隆cDNA全长为 196 6bp ,编码 4 84个氨基酸 ,含有一个PWWP功能结构域及多个抗原表位。Ts88cDNA是一个尚未见报道的旋毛虫抗原新基因。     

淡色库蚊β-肌动蛋白基因克隆与序列分析

目的 获取淡色库蚊β-肌动蛋白全长基因。方法 采用RACE法筛选淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系cDNA表达文库，获得β-肌动蛋白基因的5′和3′RACE序列，然后通过T／A克隆插入pGEM-T质粒载体，经过测序、拼接获取全长序列。用BLASTp软件将该基因推导的氨基酸序列与蛋白质公共数据库Swissprot比对、分析。结果获得淡色库蚊β-肌动蛋白基因全长序列，总长度为1290bp，开放阅读框为1132bp，编码377个氨基酸(GenBank／NCBIAYl00005)。推导的氨基酸序列与公共数据库比对，发现与冈比亚按蚊和黑腹果蝇的β-肌动蛋白的同源性均为91％。蛋白质的理论分子质量为41．7ku，等电点(PI)为5．4。结论 获得了淡色库蚊β-肌动蛋白基因全长序列，为蚊虫分子生物学的进一步研究奠定了基础。     

刚地弓形虫ROP11基因的克隆及生物信息学分析北大核心CSCD

提取刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）RH株速殖子总RNA,根据棒状体蛋白11（ROP11全长编码序列（登录号为DQ077905）的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR（RT-PCR）扩增,PCR产物经EcoRI和NotI酶切后与原核表达载体pGEX-6P-2连接,重组质粒转化大肠埃希菌（E．coli）XL-Blue,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。对所得序列进行生物信息学分析。结果显示,RT-PCR扩增产物约为1500bp。菌落PCR及双酶切结果正确。测序结果显示,获得的ROP11基因片段为1548bp（登录号为KC456639）,与GenBank上已有的弓形虫ROP11序列相比,序列一致性为99％。生物信息学分析发现,ROP11编码蛋白质的预期相对分子质量为M57020,包括有12个保守结构区域,其前26个氨基酸残基构成信号肽,丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶催化区域位于170～511氨基酸,且有2个潜在的N-糖基化位点。     

中华按蚊热激蛋白40(HSP40)cDNA序列的全长扩增

目的 为获取中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的高表达基因热激蛋白40(HSP40)cDNA的全长序列. 方法 运用抑制性消减杂交技术(suppression substractive hybridization,SSH)构建中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的差异表达基因文库,从高表达文库中获得长度为363 bp的HSP40基因的cDNA片段,运用RACE技术对其cDNA序列进行全长扩增. 结果 获得中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列,总长度为1 159 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸. 结论 获得了中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列.     

我国旋毛虫地理株遗传变异与系统发生关系的研究

目的通过分析旋毛虫线粒体基因分子标记,研究我国旋毛虫地理株间的遗传变异与系统发生关系。方法应用旋毛虫线粒体核糖体小亚基DNA（mitochondrial small subunit ribosomal DNA,mtSSU）和线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因（mitochondria cytochrome coxidase,COΙ）为分子标记,分别对我国7个旋毛虫地理株扩增后进行双向测序,利用DNAMAN软件将测序结果和GenBank中相应序列进行比对研究,并使用MEGA4.0程序包构建系统进化树。结果 PCR对7个旋毛虫地理株分别扩增出了649bp（mtSSU）和419bp（COΙ）的DNA片段,7个地理株的DNA片段与GenBank中T.spiralis的相应片段相比存在一定差异,其中mtSSU基因有4个变异位点（248、293、537和539位）,而COI基因仅存在2个变异（273和382位）,所有变异均为T-C或C-T的转换;进化树显示南阳株和云南株位于比较近的分枝,而西安株、广西株及西藏株亲缘关系较近。结论我国7个旋毛虫地理株的遗传变异较小,亲缘关系较近。     

十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶基因的克隆与表达

目的克隆十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶（AdMn-SOD）基因,并在大肠埃希菌中表达。方法用3′RACE及RT-PCR技术扩增获得AdMn-SOD全长cDNA编码序列;设计引物,克隆AdMn-SOD成熟肽编码序列,连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21（DE3）并用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,诱导表达的重组蛋白用Ni亲和层析进行纯化。结果成功克隆获得AdMn-SOD全长cDNA序列,推导编码的氨基酸序列具有Mn-SOD的保守结构特征;构建了pET32a/AdMn-SOD原核表达重组质粒,AdMn-SOD在大肠埃希菌中得到高效表达,表达的融合蛋白的分子质量单位约为40ku。结论成功克隆并表达了十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶基因,为进一步了解十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶的特性与功能奠定了基础。     

宁夏地区布鲁氏菌临床分离株OMP25基因序列特征分析

目的采用PCR法扩增宁夏地区布鲁氏菌临床分离株OMP25基因并测序,分析OMP25基因序列特征,为布鲁氏菌鉴定以及基因克降与表达研究提供参考。方法参考GenBank公布的布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因序列设计1对引物,采用PCR法从宁夏地区分离株布鲁氏菌基因组中扩增OMP25基因并进行双向测序,测序结果用Contig Express软件拼接,采用DNAstar软件进行分析。结果经鉴定,两分离株布鲁氏菌均为羊种3型,测序获得OMP25基因全长序列为638bp,编码212个氨基酸,核苷酸序列与GenBank公布羊种布鲁氏菌OMP25基因同源性为99．9％,氨基酸序列同源性为99．7%。系统进化树显示,分离株与参考株布鲁氏菌亲缘关系相近,与羊种布鲁氏菌为同一个分枝。结论宁夏地区布鲁氏菌分离株OMP25基因序列与参考菌株序列同源性高,且与羊种布鲁氏菌存同一分枝,表明OMP25基因序列是一个保守序列。该研究结果可为布鲁氏菌的分子生物学鉴定和诊断试剂的研制提供参考。     

中国广西登革3型病毒分离株基因组序列特征分析

目的对我国广西登革3型病毒分离株桂登-1株(GD-1株)和桂登-11株(GD-11株)进行全基因组序列测定和分析,为了解其地理来源提供依据。方法根据GenBank提交的登革3型病毒基因序列设计9对引物,RT-PCR方法分段扩增GD-1和GD-11株基因序列,测序后进行拼接,得到其全基因组序列。结果两株病毒全长均为10 707nt,与国际参考株H87株核苷酸同源性为96.0%,氨基酸同源性为98.8%。GD-1株和GD-11株间仅有4个氨基酸差异,二者与H87株分别存在39和41个氨基酸差异。对3’UTR二级结构进行预测,二者与H87株存在较大差异。根据E蛋白基因序列对两株病毒进行进化分析,GD-1和GD-11均属于亚型Ⅱ,与分离自泰国的两毒株进化关系较近。结论 GD-1和GD-11均属于登革3型病毒亚型Ⅱ,二者可能是源自泰国的病原。     

东方巴贝虫cDNA文库的构建与免疫学筛选

目的 构建东方巴贝虫（Babesia orientalis）cDNA文库, 从中筛选免疫学阳性的克隆。 方法 用东方巴贝虫感染牛, 提纯红细胞内虫体的总RNA, 反转录合成cDNA, PCR扩增后将其连接于噬菌体载体（λTriplEx2）, 通过体外包装, 建成东方巴贝虫cDNA文库, 并进行扩增。用兔抗东方巴贝虫的血清筛选cDNA文库, 阳性克隆经大肠埃希菌BM25.8自身环化酶将噬菌体重组子λTriplEx2转化为相应的质粒重组子pTriplEx2, PCR鉴定插入片段大小, 并测序, 用Blast对测序结果进行同源性分析, 并对序列编码的氨基酸序列进行结构和功能的预测。 结果 未扩增文库的滴度为2.0×10⁶ pfu/ml, 重组率为98.8%, 文库插入片段大小为500~3 000 bp, 扩增后的滴度为5.8×10⁸ pfu/ml。从东方巴贝虫cDNA文库中筛选得到3个阳性克隆B04、B05和B41, 插入片段大小分别约为1 300、1 000和2 400 bp, 3个片段均包含开放阅读框, 分别与多种原虫的核动蛋白、功能未知的假定蛋白和热激蛋白70具有较高的同源性。B04、B05和B41分别编码310、192和647个氨基酸, 相对分子质量(Mr)分别约为34 000、21 000和70 700。 结论 构建了较高质量的东方巴贝虫cDNA文库, 并发现3个东方巴贝虫阳性克隆。     

简单异尖线虫L-样半胱氨酸蛋白酶基因的克隆与表达

目的克隆简单异尖线虫L-样半胱氨酸蛋白酶基因(AsCP)全长,研究其表达特性。方法根据GenBank中简单异尖线虫表达序列标签L-样半胱氨酸蛋白酶基因的部分信息,设计特异引物,用cDNA末端快速扩增技术扩增3′端部分,获得基因全长序列。根据基因全长序列设计引物,以简单异尖线虫总RNA为模板,RT-PCR扩增AsCP基因编码序列,产物经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,克隆至表达载体pET32а(+),转化大肠埃希菌BL21(DE3)株,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达效果经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。结果3′端扩增片段大小为1211bp,拼接完整后基因全长1462bp,编码411个氨基酸,与秀丽隐杆线虫的L-半胱氨酸蛋白酶相似性达36.4%;重组载体pET32a(+)-AsCP经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后有一条约1150bp的条带,测序结果显示重组载体构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白相对分子质量约为Mr60000(含6个组氨酸的标签),与目的蛋白相符。用不同浓度的IPTG诱导对表达量的影响很小,1mmol/LIPTG诱导2h后表达量达到最高水平。结论成功克隆并表达了L-样半胱氨酸蛋白酶。     

日本鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌与创伤弧菌的分离与鉴定

目的对日本鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的病原进行了分类鉴定。方法对两株病原菌进行了形态、API-ID32E鉴定系统和分子生物学鉴定,分别测定了菌株AnGH080301和An-GH080302的16SrRNA和HSP60基因序列,构建了系统进化树。结果按形态特征和API-ID32E鉴定系统分别初步鉴定菌株AnGH080301和AnGH080302为迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌。菌株AnGH080301的16SrRNA基因部分序列(登录号FJ646618)与迟缓爱德华氏菌的16S rRNA基因(登录号AB050832)同源性最高,达99.7%;菌株AnGH080302的HSP60基因部分序列(登录号FJ646619)与创伤弧菌HSP60基因(登录号BA000037)的同源性最高,达99.8%。结论综合菌株的生理生化特性和分子生物学鉴定结果,可将菌株AnGH080301和AnGH080302分别鉴定为迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌,迟缓爱德华氏菌与创伤弧菌均为人兽共患病病原,其混合感染日本鳗鲡致病的报道尚属首次。     

2011年龙岩市流行株柯萨奇病毒A组16型VPl基因特征分析

目的分析2011年龙岩市流行的柯萨奇病毒A组16（CVA16）分离株的分子生物学特征。方法对从龙岩市2011年散发的手足口病（HFMD）患者标本中分离CVA16病毒,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增VPl基因片段全长,并对扩增产物测序。根据VPl基因核苷酸序列与国内外其他CVA16毒株序列构建进化树,并进行核苷酸和氨基酸同源性分析。结果 4株龙岩分离株CVA16核苷酸同源性为99%~100%。比较推导的氨基酸序列,VP1不存在位点差异,氨基酸序列完全相同。对分离株病毒进行VP1核苷酸序列两两差异分析,与国内其他分离株VP1基因序列的一致性为87%~100%。确定4株CVA16病毒均属于B1b基因型。结论引起2011年龙岩市HFMD流行的CVA16病毒均为B1b基因型,与目前国内其他地区流行毒株高度同源。     

棘阿米巴土壤分离株CB/S1的18S rDNA基因型鉴定

目的鉴定从北京市区土壤中分离的棘阿米巴分离株Acanthamoeba sp．CB／S1的18S rDNA基因型。方法从土壤分离的CB／S1株中提取基因组18SrDNA，应用棘阿米巴属特异性引物PCR扩增18S rDNA序列。将扩增产物测序后用分子生物学软件Clustal X进行序列分析，与基因库中已有T1至T12型序列进行比较并构建进化树。结果与结论从北京市区土壤中分离的的棘阿米巴分离株CB／S1的18S rDNA全基因序列分别为2291bp，其基因型属于T5型。