淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4家族新成员基因克隆及序列分析

目的获取淡色库蚊CYP4家族新基因。方法根据CYP4氨基酸保守序列设计一对简并引物，采用RT-PCR的方法，从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系四龄幼虫总RNA中扩增出与设计相符的基因片段。利用T／A克隆方法，将获得的基因片段克隆入pGEM-Teasy载体，经PCR鉴定重组成功，测序并进行比对。结果共克隆出36个阳性克隆，将其中9个随机挑取的阳性克隆测序及同源性分析，表明为CYP4家族中9个新的cDNA序列，由GeneBank登录上网；经国际细胞色素P450命名委员会鉴定，属CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。为进一步研究细胞色素P450的多样性及其与抗药性的关系打下基础。结论克隆9个淡色库蚊基因部分序列，被鉴定属于CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。     

淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初步鉴定

[目的 ]探讨淡色库蚊细胞色素P45 0与溴氰菊酯抗药性的关系。 [方法 ]采用一对昆虫细胞色素P45 0简并引物 ,以反转录 聚合酶链反应从淡色库蚊扩增特异片段 ,T/A直接克隆法筛选阳性克隆 ,对新序列进行cDNA芯片和逆Northern分析。 [结果 ]从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系获得 112个阳性克隆 ,其中 2 4个阳性克隆测序后显示为细胞色素P45 0新序列 ,由GenBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定分别属CYP4家族CYP4C、CYP4D、CYP4H和CYP4J等 4个亚家族 ;2 4个CYP4cDNA片段中 ,来自敏感品系的 2个片段(NYDS3和NYDS5 )和来自抗性品系的 4个片段 (NYDR6、NYDR9、NYDR15和NYDR17)在两品系间存在差别 ,cDNA芯片信号亮度值均是抗性品系大于敏感品系 ,倍数在 3 .1～ 9.7范围内 ;NYDR17仅与抗性探针杂交 ;逆Northern再鉴定 ,获得了与cDNA芯片一致的结果。 [结论 ]淡色库蚊CYP4与溴氰菊酯抗性相关 ;在淡色库蚊溴氰菊酯抗性机理中 ,可能存在P45 0基因点突变而导致的特异表达。     

淡色库蚊细胞色素P450 CYP4E2r6基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆并表达鉴定淡色库蚊细胞色素P450(CYP4E2r6)基因。方法根据昆虫细胞色素P450氨基酸保守序列设计一对简并引物，采用RT—PCR，从淡色库蚊四龄幼虫mRNA中扩增出目的基因片段。产物经T—A克隆、测序、比对，在抗性品系高表达的CYP4E2r6亚克隆入原核表达载体pGEX-6P1，在大肠杆菌BL21中进行原核表达。将细菌总蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果14个阳性克隆中9个为CYP4新序列，由GenBank登录上网(GenBank／NCBI CB074944—51、CB270837，2003年)；经鉴定属CYP4家族CYP4H、CYP4E、CYP4J亚家族；CYP4E2r6基因已成功表达。结论获得的CYP4E2r6融合表达蛋白为进一步研究CYP4基因与抗药性之间的关系奠定基础。     

嗜人按蚊溴氰菊酯抗性分子机理研究Ⅱ嗜人按蚊CYP4基因cDNA片段的克隆与序列分析

目的　获得嗜人按蚊CYP4基因家族成员的c DNA片段。方法　采用简并引物对嗜人按蚊溴氰菊酯敏感和抗性品系总RNA进行RT- PCR扩增,得到的特异性片段采用T/ A克隆法克隆并进行序列测定和分析。结果　敏感品系和抗性品系嗜人按蚊均能扩增得到4 5 0 bp和5 30 bp左右的2个片段。经克隆测序后,得到6个基因序列,其中4个来自敏感品系,2个来自抗性品系。其中1个来自敏感品系的序列和1个来自抗性品系的序列完全相同。所得的5个不同基因序列已被Gen Bank收录(登录号:AY2 0 814 1～AY2 0 814 5 ) ,并递交国际细胞色素P4 5 0命名委员会,经鉴定确认均为细胞色素P4 5 0超家族中的CYP4家族成员,其中4个为新基因,另1个为等位基因,分别属于CYP4家族的CYP4 C、CYP4 H和CYP4 J3个亚家族。结论　得到的5个c DNA新序列为CYP4家族新成员的基因片段。     

淡色库蚊细胞色素P450基因的克隆、序列分析及表达差异的鉴定

目的克隆淡色库蚊细胞色素P450（CYP6F1）基因并进行表达差异的鉴定。方法采用RT—PCR技术和RACE策略，从淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系4龄幼虫中克隆细胞色素P450基因（CYP6F1），用相应的软件进行生物信息学分析，并用实时定量PCR和RT—PCR分析敏感、抗性品系蚊的CYP6F1表达水平及对蚊各期CYP6F1进行表达鉴定。结果成功克隆出CYP6F1基因，基因全长1639bp，开放阅读框为1527bp，编码508个氨基酸（GenBank登录号：AY662654）。序列分析显示该基因与已克隆的日本致倦库蚊细胞色素P450基因（AB001324）有99％的同源性，并具有所有的细胞色素P450基因的保守性特征，1个膜锚定信号、2个还原酶结合位点、1个典型的血红素蛋白结合位点和ETLR基序等。实时定量PCR和半定量RT—PCR结果表明，CYP6F1在淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系中表达水平高于敏感品系，且CYP6F1基因在淡色库蚊各个发育阶段有不同的表达。结论CYP6F1基因可能与杀虫剂抗药性相关，并且在淡色库蚊各个发育阶段有不同的表达。     

淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初 …

「目的」探讨淡色库蚊细胞色素Ｐ４５０与溴氰菊酯抗药性的关系。「方法」采用一对昆虫细胞色素Ｐ４５０简并引物，以反转录－聚合酶链反应从淡色库蚊扩增特异片段、Ｔ／Ａ直接克隆法筛选阳性克隆，对新序列进行ｃＤＮＡ芯片和逆Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析。「结果」从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系获得１１２个阳性克隆，其中２４个阳性克隆测序后显示为细胞色素Ｐ４５０新序列，由ＧｅｎＢａｎｋ登录上网；经国际细胞色素Ｐ４５     

嗜人按蚊溴氰菊酯抗性分子机理研究Ⅰ嗜人按蚊CYP6基因cDNA片段的克隆与序列分析

目的获得嗜人按蚊CYP6基因家族成员的cDNA片断。方法采用简并引物对嗜人按蚊溴氰菊酯敏感和抗性品系总RNA进行RT-PCR扩增,得到的特异性片断采用T/A克隆法克隆并进行序列测定和分析。结果敏感品系和抗性品系中均扩增得到250bp左右的片断。进行克隆测序,得到10个CYP6新基因,2个来自敏感品系,8个来自抗性品系,被GenBank收录(登录号AY273927～AY273936)。递交国际细胞色素P450命名委员会,被鉴定为是细胞色素P450超家族中CYP6家族的7个新基因及其3个等位基因,分别属于CYP6Z、CYP6P、CYP6N和CYP6M等4个亚家族。结论得到的10个cDNA新序列为CYP6家族新成员的基因片断。     

白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N亚家族新成员5‘—及3’—非翻译区序列功能分析

目的 获得白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N亚家族新成员5‘－及3‘－非翻译区（untranslated region,UTR）核苷酸序列,并进行功能分析。方法 以本文作者已获得的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株－新的细胞色素P450 CYP6基因cDNA片段,设计1对特异性引物,以反向引物,进行5‘-cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）,以正向引物进行3‘-RACE。然后分别进行克隆、测序和鉴定。以获得5‘-UTR及3‘－UTR,并运用PC／GENE软件分析其功能。结果 获得CYP6N家族中两个新成员5‘－UTR及3‘－UTR;其结构特征包括：两个新成员前导序列均为46个核苷酸;起始密码子ATG两侧核苷酸－3位是A、＋4位是T;5‘－UTR区域无稳定性的发卡结构;终止密码子在CYP6N3为TZAA、在CYP6N4为TAG,紧挨其3‘端核苷酸分别为A和G,翻译产物羧基端均为亮氨酸。结论 成功地获得了白纹伊蚊细胞色素P450CYP6N亚家族两个新成员5‘－及3‘－非翻译区序列,进一步分析表明该两个新成员均能进行有效翻译,昆虫细胞色素P450基因翻译起始调控与翻译终止调控有部分类似于脊椎动物mRNA的翻译调控,但具有多态必性的特点。     

淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4E2r6基因的克隆与生物信息学分析

目的 从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫扩增并分析CYP4E2r6基因，为蚊虫抗药性的研究、检测和防治筛选靶标。方法 根据已扩增的CYP4E2r6基因片段（长470bp，GenBank登录号为CB074945）的序列设计2条特异引物，从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫提取RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，用5’-RACE和3＇-RACE方法，各获得722bp、617bp片段。进行序列拼接并对所得新基因进行登录和生物信息学分析。结果获得了1条3’端含polyA尾，长1025bp的CYP4E2r6基因大片段（GenBank登录号为AY309972），编码289个氨基酸，与果蝇细胞色素P450氨基酸的同源性为55％。编码蛋白的理论分子质量单位为32．9ku，等电点为5．8。结论 获得了CYP4E2r6基因大片段，为进一步获取全长基因并研究该基因的功能奠定了基础。     

白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N3基因的原核表达及鉴定

目的　对白纹伊蚊细胞色素P4 5 0CYP6N3基因进行原核表达 ,以获得高效表达蛋白。方法　根据CYP6N3基因的全长cRNA为模板进行RT -PCR。产物经T -A克隆测序鉴定后 ,亚克隆入原核融合表达载体 pGEX - 4T - 1(含有编码 2 6KDaGST的基因序列 )中 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行原核表达。将细菌总蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 ,通过Westernblot分析鉴定目的蛋白的位置 ,并运用核酸蛋白分析仪扫描凝胶以确定表达产物的含量。结果　获得了高效表达的融合蛋白GST -CYP6N3,表达量占菌体总蛋白的 37 4 9%。结论　本实验成功地异源表达了白纹伊蚊CYP6N3基因 ,为体外重建细胞色素P4 5 0CYP6N3单加氧酶系 ,了解CYP6N3基因结构功能关系奠定基础     

山东省淄博市淄川区淡色库蚊kdr等位基因突变研究

目的　了解山东省淄博市淄川区淡色库蚊（Culex pipiens pallens）季节消长趋势及蚊虫击倒抗性（Knockdown resistance, kdr）相关钠通道基因多态性分布特征。方法　于2017–2018年蚊媒活动高峰期，使用诱蚊灯法对山东省淄博市淄川区进行蚊虫种群和密度调查，提取淡色库蚊DNA，通过PCR检测kdr等位基因突变类型和频率。结果　在山东省淄博市淄川区共捕获830只蚊虫，包括淡色库蚊、骚扰阿蚊、白纹伊蚊、刺扰伊蚊、中华按蚊和三带喙库蚊6种，其中淡色库蚊占83.13%，密度为12.32只/（台·夜）；淡色库蚊全年密度监测曲线呈双峰趋势，高峰出现在6月和9月。在kdr基因1 014位点共检测发现5种kdr等位基因类型，包括TTA（75.71%）、TTT（10.00%）、CTA（5.71%）、TCA（4.29%）、TTC（4.29%），同时发现2种核苷酸非同义突变，即亮氨酸（L1014）突变为苯丙氨酸（L1014F）、丝氨酸（L1014S）。罗村镇、太河镇两地淡色库蚊kdr基因突变频率分别为10.53%、40.63%，差异具有统计学意义（[χ2] = 8.559，P = 0.003）。结论　淡色库蚊为山东省淄博市淄川区优势蚊种。本研究首次在淡色库蚊中检测发现CTA、TTC两种kdr等位基因突变，kdr基因型呈多态性。     

利用蛋白组学解析淡色库蚊对氯氰菊酯的抗性机制

目的　比较氯氰菊酯选育后抗性淡色库蚊与敏感淡色库蚊蛋白差异表达情况,揭示淡色库蚊抗氯氰菊酯杀虫剂的机制。方法　利用同位素相对和绝对定量（iTRAQ）技术,结合液相色谱/串联质谱（LC?MS/MS）分析技术,对氯氰菊酯敏感与抗性淡色库蚊进行蛋白组定量分析。结果　共鉴定出164种蛋白在氯氰菊酯抗性选育前后差异表达,其中上调蛋白54种、下调蛋白110种,大量细胞骨架结构与组成相关的表皮蛋白、幼虫表皮蛋白、蛹表皮蛋白及表皮结构成分蛋白在淡色库蚊氯氰菊酯抗性选育前后差异表达。通过平行反应监测验证了能量产生与转换、翻译、核糖体结构与生物发生、脂质转运与代谢、翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣、细胞骨架、细胞内运输等13种类型的蛋白在淡色库蚊氯氰菊酯选育后差异表达,可作为潜在抗性发生标记物。结论　氯氰菊酯抗性淡色库蚊中同时存在表皮抗性及代谢抗性等多种杀虫剂抗性机制,与抗氯氰菊酯杀虫剂相关的表皮基因及细胞色素P450蛋白酶可能在淡色库蚊氯氰菊酯抗性中发挥了重要作用。     

Cytochrome P450 family 4 in a cockroach: molecular cloning and regulation by regulation by hypertrehalosemic hormone.

Hypertrehalosemic hormone (a carbohydrate-mobilizing neuroendocrine decapeptide) and starvation markedly increased levels of a cockroach (Blaberus discoidalis) fat body cytochrome P450 message. The gene represented by the cloned P450 cDNA has been named CYP4C1 (cytochrome P450 family 4, subfamily C, gene 1), a newly identified member of the ubiquitous cytochrome P450 monooxygenase gene superfamily. Blaberus CYP4C1 (511 amino acids, Mr = 58,485) has a hydrophobic NH2 terminus and a sequence near the COOH terminus that is homologous to the cysteine-containing heme-binding region definitive of cytochromes P450. The cockroach sequence is 32-36% identical to mammalian family 4A and 4B enzymes. It contains a 13-residue sequence characteristic of family 4 but not other P450s. This study suggests that CYP4C1 is hormonally regulated in association with energy substrate mobilization and supports the idea that family 4 is an old and widespread gene family.     

基于iTRAQ的定量蛋白质组学技术探索 淡色库蚊越冬机制

目的　比较淡色库蚊越冬后与滞育准备阶段蛋白表达差异,探索淡色库蚊越冬休眠（滞育）的机制。方法　采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术,对越冬滞育及准备阶段淡色库蚊进行定量蛋白质组学分析。结果　淡色库蚊越冬滞育前后共鉴定出244种差异表达蛋白,其中上调蛋白126种、下调蛋白118种。生物信息学分析表明,这些差异表达蛋白与能量产生及转化、脂代谢、细胞骨架重塑、糖代谢、蛋白质转运、分子伴侣、应激耐受以及各种代谢酶等有关。结论　本研究首次采用现代蛋白质组学工具鉴定淡色库蚊越冬滞育相关蛋白,初步揭示了与淡色库蚊越冬滞育相关的KEGG通路及蛋白,进一步扩展了对蚊媒越冬滞育机制的理解。