原生动物△4-脂肪酸去饱和酶基因在卵巢细胞中的表达

目的 探讨优化、合成原生动物△4-脂肪酸去饱和酶基因,并构建其哺乳动物表达载体,将基因导入卵巢细胞(CHO)中进行初步表达.方法 目的基因经优化后人工合成全长编码区,利用双酶切连接法将其连入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-).采用脂质体法稳定转染CHO细胞后应用PCR和RT-PCR法检测△4-脂肪酸去饱和酶基因的整合和表达情况.结果 成功构建了△4-脂肪酸去饱和酶基因的表达载体pcDNA3.1-D4,并整合进CHO细胞基因组,实现了该基因在CHO中的表达.结论 原生动物△4-脂肪酸去饱和酶基因哺乳动物表达载体的成功构建以及△4-脂肪酸去饱和酶基因表达后的分析为下一步深入研究△4-脂肪酸去饱和酶基因的功能和转基因动物的制作打下了基础.     

SV40T抗原胃壁细胞特异性表达载体的构建与鉴定

目的:构建在胃壁细胞中特异性表达SV40T抗原的真核表达裁体并进行鉴定.方法:采用酚-氯仿法从昆明小鼠肝细胞中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增H~ /K~ ATPaseβ亚基启动子,产物命名为HK.将PCR产物纯化回收后与pMT18-T载体相连,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK;从含SV40T基因片段的质粒p LITAg中酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,并测序鉴定.结果:pcDNA3.1(-)/HKSV用XbaⅠ、BarnHⅠ双酶切可得到1kb H~ /K~ ATPaseβ亚基启动子,2.7 kb SV40T基因与5.4 kb pcDNA3.1(-)载体3条DNA条带.用XbaⅠ、KpnⅠ双酶切电泳,可见到约3.7与5.4 kb的两条DNA条带;用BamHⅠ单酶切电泳,可见到2.7与6.4 kb的2条DNA条带;用EcoRⅠ单酶切,只见到约9.1 kb的1条DNA条带,酶切电泳结果均与设计一致.测序结果显示,H~ /K~ ATPaseβ亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中.结论:构建在胃壁细胞中特异性表达SV40T基因的真核表达载体,为进一步转基因小鼠及胃癌动物模型的建立提供了稳定、可靠的分子工具.     

SV40T抗原真核表达载体的构建及其在食管癌细胞EC9706中的表达鉴定

构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV和非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,行酶切及测序鉴定.用脂质体转染法将构建的载体导入食管癌细胞EC9706细胞株,RT-PCR法检测SV40T抗原基因的表达,免疫组化法检测蛋白表达情况. 结果限制性内切酶分析与测序结果示H /K ATP酶β亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中;转染细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出618 bp和272 bp的特异性片段,非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV瞬时转染时SV40T抗原表达阳性,而特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV转染组蛋白表达阴性.认为构建特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV并在食管癌细胞EC9706中检测其表达为转基因肿瘤动物模型的建立奠定了理论基础.     

四环素基因表达调控系统调控HSV-tk基因表达的单载体构建

目的 构建能够调控自杀基因表达的单载体四环素基因表达调控系统.方法 以真核表达载体pcDNA3.1为载体构建骨架,将两个四环素基因表达调控元件(TetO2)克隆到pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体;将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)与核糖体进位位点(IRES)相连的基因片段克隆入pcDNA3.1-TetO2载体的多克隆酶切位点,构建成pcDNA3.1-TetO2-HSV-TK-IRES载体;将四环素调控子基因(TR)克隆至pcDNA3.1-TetO2-HSV-TK-IRES载体IRES下游,从而构建成pcDNA3.1-TetO2-HSV-TK-IRES-TR载体.利用酶切与测序鉴定克隆结果.结果 载体构建过程的酶切结果以及测序结果表明载体构建正确.结论 成功构建了能够调控自杀基因表达的单载体四环素基因表达调控系统,为调控自杀基因体外杀伤肿瘤奠定实验基础.     

小鼠IL-4真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-4(murine interleukin-4,mIL-4)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠IL-4基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,利用电泳和测序鉴定重组质粒的大小、序列。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-4转入293T细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其表达。结果经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-4构建成功,并在293T细胞中成功表达。结论 pcDNA3.0-mIL-4可在真核细胞中成功表达,为进一步研究其在炎症性肠病(IBD)动物模型中的生物学功能提供了条件。     

小鼠白介素-10真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-10(murineinterleukin-10,mIL-10)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠脾脏IL-10基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,酶切和测序鉴定重组质粒的大小、序列。采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-10瞬时转染293T细胞,用Westernblot法检测IL-10表达。结果重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,而且转染了293T细胞中提取的蛋白可检测到活性蛋白。结论经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,并在293T细胞中成功表达活性蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

半合成-酶连法克隆EFsec基因及其初步表达分析

目的将缺失一段编码序列的真核硒代半胱氨酸-tRNA特异性延伸因子(EFsec-)基因补齐,并克隆到真核表达载体进行初步表达分析。方法采用人工合成法合成所缺失的基因片段,然后利用EFsec-基因序列中靠近5’端存在的天然酶切位点进行酶连,再用PCR方法扩增出拼接产物,并将其克隆到pcDNA3.1(-)载体。采用脂质体转染法转染HEK293T细胞后应用RT-PCR法检测EFsec基因的表达。结果准确快捷地将EFsec-基因补齐了其5’端缺失的基因序列,并成功地构建了其表达质粒pcDNA3.1-EFsec,转染哺乳动物细胞后检测到了EFsec基因的显著表达。结论半合成-酶连法可以高效快捷地补齐并克隆缺失的EFsec-基因,提供了一种拼接基因的有效策略和方法,同时也为EFsec基因的下一步研究奠定了基础。     

hHGF转染HepG2细胞后基因表达谱差异筛选

目的:构建hHGF真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,筛选其对HepG2细胞的差异表达基因.方法:构建pcDNA3.1(-)-hHGF载体,测序鉴定:转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:运用基因表达谱芯片技术,筛选pcDNA3.1(-)-hHGF和pcDNA3.1(-)载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA并逆转录为cDNA,经表达谱芯片分析差异表达基因.结果:构建的表达载体经酶切和测序确定;转染HepG2细胞后hHGF表达经蛋白免疫印迹证实;经20000个基因的表达谱芯片分析发现,其中有430个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:筛选出HGF转染HepG2细胞后的差异表达基因,对其在肝细胞中多种作用机制研究提供了重要依据.     

稳定表达水通道蛋白-4细胞株的建立及应用价值

目的 构建水通道蛋白-4 (AQP4)真核表达载体,转染HEK293细胞建立稳定表达AQP4的HEK293细胞株,并将其应用价值与现有的酶联免疫吸附(ELISA)法进行比较,为视神经脊髓炎(NMO)的诊断提供新的方法.方法 用RT-PCR法从小鼠小脑皮质中克隆AQP4基因,将其连入质粒pcDNA3.1,构建AQP4真核表达载体pcDNA3.1 -AQP4；用脂质体转染法将重组质粒转染HEK293细胞,G418筛选稳定表达细胞株；RTPCR和间接免疫荧光法(IFA)检测AQP4基因的表达情况；以稳定细胞株为底物用IFA法检测81例患者血清抗AQP4抗体,并与ELISA检测方法进行比较.结果 琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出993 bp的条带；与载体连接后得到酶切正确的重组质粒；RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带；IFA法检测转基因HEK293细胞,呈抗AQP4阳性.IFA法检测患者血清中AQP4抗体的敏感性为93.3％,特异性为97.4％,正确指数为90.7％,与ELISA法一致性为96.3％.结论 成功克隆并构建小鼠AQP4基因真核表达载体,成功建立稳定表达AQP4的HEK293细胞株,该细胞株对NMO具有良好的检测效果,有望在NMO的临床诊断中发挥重要作用.     

Stat3对Foxp3表达的影响北大核心CSCD

目的构建并鉴定pcDNA3.1-Stat3真核表达质粒,探讨信号转导和转录激活因子Stat3对Foxp3表达的影响。方法以EL4细胞cDNA为模板,PCR法获取目的基因Stat3。构建含有目的基因的T载体pMD19-T-Stat3。用HindⅢ和ECOR I双酶切pcDNA3.1载体及pMD19-T-Stat3,纯化后在T4 DNA连接酶作用下连接,构建pcDNA3.1-Stat3真核表达质粒,并进行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建正确的pcDNA3.1-Stat3电转入EL4细胞,采用Western blot法及细胞免疫荧光法检测Foxp3的表达。结果 PCR和双酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1-Stat3构建成功,测序鉴定插入片段无突变,序列完全正确。pcDNA3.1-Stat3转入EL4细胞后,能上调目的蛋白Stat3的表达,且能进一步促进Foxp3表达。结论 pcDNA3.1-Stat3重组质粒转化入EL4细胞后能高表达Stat3,且能诱导Foxp3的表达。     

脂肪酸结合蛋白在防治脂肪肝中的作用

脂肪酸结合蛋白（FABPs）是细胞内运输长链脂肪酸的蛋白超级家族成员,到目前为止发现有9种不同的FABPs。作为脂肪酸的转运体,其功能已经有大量研究证实。最近几年,许多试验更直接证实了FABPs的转运脂肪酸、参与细胞内脂质代谢作用。深入研究FABPs,在脂肪肝的检测、防治中具有重要意义。     

原发性高血压患者血浆脂肪酸的研究

目的:探讨原发性高血压患者血浆脂肪酸组成及含量情况。方法:(1)试验分2组,正常对照组选取正常健康者60例。高血压组选取单纯原发性高血压患者56例,采用Morrison法提取血浆脂肪酸,以气相色谱法检测三氟化硼甲脂化的脂肪酸,计算出各组分所占重量百分比。结果:血浆脂肪酸测定结果高血压组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)(1):高血压组血浆总饱和脂肪酸(SFA)增高,其中增高明显的SFA为豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸。(2)单不饱和脂肪酸(MUFA):高血压组的反式油酸明显增高,油酸则较正常对照组明显减少。(3)多不饱和脂肪酸(PUFA):①总PUFA在高血压组明显减低;②n-6PUFA中:高血压组的亚油酸,Υ-亚麻酸,花生四烯酸,二十二碳四烯酸和二十碳三烯酸均较正常对照组低,尤以二十二碳五烯酸降低更明显;③n-3PUFA中:高血压组的α-亚麻酸、二十碳五烯酸及二十二碳六烯酸均明显减少(均P<0.05)。结论:原发性高血压患者血浆中不但豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸及反式油酸较正常人明显增高,而且油酸、亚油酸,α-亚麻酸及二十碳五烯酸及二十二碳六烯酸均较正常人明显降低,Υ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳四烯酸和二十二碳五烯酸也较正常人明显缺乏。     

CD36 palmitoylation disrupts free fatty acid metabolism and promotes tissue inflammation in non-alcoholic steatohepatitis

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高脂肪饮食诱发的C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病肝脏PPAR-γ表达升高

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)是否与非酒精性脂肪性肝病的形成有关。方法通过标准高脂肪饮食诱导雄性C57BL/6J小鼠形成非酒精性脂肪性肝病,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及Western Blot检测肝脏的PPAR-γ和脂肪酸转位酶mRNA和蛋白水平;用RT-PCR及Western Blot检测PPAR-γ的天然激动剂棕榈酸处理后的小鼠1C1C7肝癌细胞的脂肪酸转位酶mRNA和蛋白水平,并与正常饮食组进行比较。结果高脂肪饮食非酒精性脂肪性肝病组小鼠肝脏组织PPAR-γ显著高于正常饮食对照组小鼠(1.84±0.16 vs 1.00±0.11,P0.05),Western Blot显示蛋白水平显著升高;脂肪酸转位酶的mRNA水平也显著高于正常饮食对照组小鼠(2.75±0.26 vs 1.00±0.08,P0.05),Western Blot显示蛋白水平显著升高;经过200μM的PPAR-γ的天然激动剂棕榈酸处理6 h后,1C1C7细胞的脂肪酸转位酶mRNA表达水平显著高于对照组(2.98±0.25vs 1±0.06,P0.05),Western Blot显示蛋白水平显著升高。结论 PPAR-γ可能通过提高脂肪酸转位酶表达参与非酒精性脂肪性肝病的形成。     

肝细胞L-FABP、FATP4在大鼠非酒精性脂肪性肝病形成中的表达及意义

目的研究肝脏型脂肪酸结合蛋白（L—FABP）、4型脂肪酸转运蛋白（FATP4）在大鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病机制中的表达及意义。方法建立高脂饮食脂肪肝模型，用定量逆转录聚合酶链反应与半定量聚丙烯凝胶蛋白电泳方法测定脂肪肝肝组织中L—FABP、FATP4表达变化。结果高脂饮食脂肪肝大鼠肝脏中L—FABP于2周时其mRNA及蛋白表达增强，12周时表达最为明显，与正常组比较，差异有统计学意义；FATP4 mRNA水平及蛋白表达趋势同L—FABP，结果基本相近似（L—FABP mRNA，F=124．9；蛋白表达，F=92．6；FATP4 mRNA，F=602．9；蛋白表达，F=108．8，JD值均〈0．05）。结论高脂饮食引起L—FABP、FATP4表达增强，最初是一种适应性反应，随着L—FABP、FATP4表达进一步增强，导致脂肪酸代谢失衡，引起脂肪肝的发生。     

The interpretation of the distribution of radioactivity between carboxyl and alkyl carbon in fatty acids, following exposure to 14C-labelled acetate or malonate

The distribution of radioactivity between carboxyl and alkyl carbon in fatty acids, following exposure to ¹⁴C-labelled acetate or malonate, has been widely used as an indication of the relative importance of chain-elongation and de novo synthesis of fatty acids. The present analysis shows that the simple interpretation of such data may seriously over-estimate the importance of chainelongation.Using a theoretical model of de novo synthesis, it can be shown that, from caproate onwards, the ratio of total to carboxyl radioactivity will increase in time from unity toward the value appropriate to de novo synthesis. At any point in time, the ratio will be successively less than that appropriate to de novo synthesis as fatty acids with an increasing chain length are considered. The ratio for any fatty acid is a complex function influenced by wash-out constants of successive individual fatty acid pools. It is concluded that great caution must be exercised in the interpretation of decarboxylation data in the absence of other supporting evidence.     

气相色谱鉴定分支杆菌对比实验

采用毛细管柱色相色谱（ＧＣ）检测分支杆菌细胞脂肪酸（ＦＡ）的方法，通过制备２６种参考菌株ＧＣ图谱（原冻干菌株及其移种改良罗氏培养基生长３￣４周菌株）对临床分离的５４株非结核分支杆菌以ＧＣ法与传统生物学鉴定法进行对比，两者符合率达９４％；观察了结核分支杆菌和牛分支杆菌临床分离株ＧＣ图谱变化与耐药性的关系。认为ＧＣ法鉴定临床分离分支杆菌目前采取同时观察细菌生长速度、产色情况以及在对硝基苯甲酸（ＰＮＢ）     

非酒精性脂肪性肝病患者尿酸水平与人体测量学指标的研究

目的：探讨非酒精性脂肪性肝病患者人体测量学指标与血尿酸水平的关系。方法选择2010年1月至2012年8月经彩色多普勒超声及肝组织活检诊断为NAFLD患者109例为NAFLD组,选择同期健康体检者47例为非NAFLD组。常规测量两组人员人体测量学指标[身高、体质指数、腰围（WC）、臀围]及生物化学指标[空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、血尿酸（SUA）]。结果与非NAFLD组相比,NAFLD组患者BMI显著增高（P =0.000）,腰围（WC）亦显著增高（P男性=0.000;P女性=0.026）。NAFLD组男性人员患者腰臀比（WHR）明显高于非NAFLD组男性人员患者（P =0.000）,而两组女性人员患者WHR差异无统计学意义（P =0.119）。相对于非NAFLD组, NAFLD组男性患者血尿酸（SUA）水平明显高于非NAFLD组（P =0.000）,而两组女性人员患者SUA水平差异亦无统计学意义（P =0.386）。结论高尿酸血症（HUA）与NAFLD患者人体测量学指标变化及性别相关。     

心肌损伤过程中肉毒硷与游离脂肪酸之间关系的探讨

本文观察了通过大鼠尾静脉给于内毒硷 (L-Carnitine,100mg/Lg/d、连续3日)对异丙基肾上腺素所致大鼠心肌损伤的影响。提示大鼠注射异丙基肾上腺素(ISP)后能显著降低心肌细胞内游离肉毒硷含量,同时使血中游离脂肪酸(FFA)含量明显升高,达正常值的4倍多。预先给大鼠注射 L-Carnitine,能阻止 ISP 降低心肌细胞游离肉毒硷的作用,并能显著降低血中 FFA 的水平,从而在一定程度上保护了心肌细胞。     

Bitter gourd （Momordica charantia）： A potential mechanism in anti-carcinogenesis of colon

TO THE EDITOR Bitter gourd (Momordica charantia), has received widespread attention in the scientific community due to its beneficial effects, including anti-diabetic, anti-cancer and anti inflammatory effects in laboratory studies[1]. However, a well-defined mechanism by which this important plant food exerts its beneficial effects has not been elucidated. We present some of the latest findings on the plant's effects against colon cancer.