聚合酶链反应—单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

应用PCR-SSCP技术快速检测耐INH,RFP,SM结核分支杆菌分离株rpoB、KatG、rpsL基因突变,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32侏耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及25侏结核分支杆菌敏感分离株用PCR-SSCP方法分别检测,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中,rpoB、KatG、rpsL PCR扩增产物PCR-SSCP分别有28株（87.5%)rpoB基因,19株（59.3%)KatG基因和23株（71.9%)rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H37Rv电泳条带相比有明显差异,而25株结核分支杆菌敏感株的PCR-SSCP条带与结核分支杆菌H37Rv相似,特异性为100%。结论 PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变,有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的　应用PCRSSCP技术快速检测耐INH,RFP,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及25株结核分支杆菌敏感分离株用PCRSSCP方法分别检测,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中,rpoB、KatG、rpsL PCR扩增产物PCR-SSCP分别有28株(87.5%)rpoB基因,19株(59.3%)KatG基因和23株(71.9%)rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H₃₇Rv电泳条带相比有明显差异,而25株结核分支杆菌敏感株的PCR-SSCP条带与结核分支杆菌H₃₇Rv相似,特异性为100%。结论 PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变,有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。     

三种结核分支杆菌耐药基因的检测方法

目的　建立3种结核分支杆菌耐药基因的检测方法,了解耐药基因突变和耐药水平的关系。方法 108例临床痰标本分离株均做聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR-SSCP)和传统梯度药敏试验。结果 耐SM (rpsL)、RFP (rpoB)、INH (KatG)基因突变率分别为78.5%,68.2%,70.5%,其中,高耐SM,RFP,INH分离株分别为86.5%,89.3%,84.3%;低耐分离株分别为28.5%,16.5%,7.1%。结论 结核分支杆菌耐药基因突变与耐药水平有密切联系,绝大多数结核分支杆菌耐药基因突变发生在高耐药株,少部分在低耐药株发生基因突变。     

三种结核分支杆菌耐药基因的检测方法

目的：建立3种结核分支杆菌耐药基因的检测方法，了解耐药基因突变和耐药水平的关系。方法：108例临床痰标本分离株均做聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）和传统梯度药敏试验。结果：耐SM(rpsL)、RFP(rpoB)、INH(KatG)基因突变率分别为78.5％，68.2％，70.5％，其中，高耐SM，RFP，INH分离株分别为86.5％，89.3％，84.3％；低耐分离株分别为28.5％，16.5％，7.1％。结论：结核分支杆菌耐药基因突变与耐药水平有密切联系，绝大多数结核分支杆菌耐药基因突变发生在高耐药株，少部分在低耐药株发生基因突变。     

结核分支杆菌五种耐药基因检测的临床应用及评价

目的　检测结核分支杆菌rpoBkatG、rpsL、pncA和embB耐药基因 ,评价其临床应用价值。方法　采用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)分析和药敏试验 (比例法 ) ,了解 10 9例肺结核患者结核分支杆菌耐药情况 ,并分析、比较临床治疗效果。结果　 1/ 2以上的肺结核患者至少耐两种抗结核药物 ,对RFP、INH、SM、PZA和EB总耐药率分别为 80 7%、71 5 %、78 8%、5 7 7%和48 6%。rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变率分别为 76%、68%、71%、5 1%和 3 0 %。结核分支杆菌耐药基因突变率与耐药水平联系密切 ,多数结核分支杆菌耐药基因突变易发生在高耐药株 ,也有少数基因突变发生在低耐药株。根据药敏试验和耐药基因检测结果 ,6个月耐多药结核治愈率分别达到 5 4 8%和 62 8% ,治疗效果满意 ,两种方法差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论　耐药基因检测指导治疗是一种新探索 ,PCR SSCP方法敏感、特异 ,可以快速检测结核分支杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB耐药基因突变 ,可能会成为临床指导用药的好方法     

PCR-SSCP检测耐乙胺丁醇结核杆菌embB基因突变的价值

目的探讨应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测结核分支杆菌耐乙胺丁醇(EMB)分离株embB基因突变情况,研究其应用价值。方法2000-06~2002-08对河南省结核病耐药监测项目收集的菌株及河南省各地市结核防治所收集的68株结核分支杆菌菌株采用PCR-SSCP分析68例结核菌株embB。结果以H37Rv标准株为对照,30株药物敏感株的embB基因SSCP泳动均正常,38株耐EMB分离株中25株embB基因SSCP泳动异常,异常检出率占66%。结论部分分支结核杆菌耐EMB是由于其embB基因突变引起,PCR-SSCP可成为检测部分结核杆菌耐EMB耐药基因的有效方法。     

结核分枝杆菌链霉素耐药基因rpsL的检测

目的探讨结核分枝杆菌(TB)对链霉素(Sm)耐药的分子机制,建立快速检测结核分枝杆菌Sm耐药性的方法。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测80株结核分枝杆菌临床分离株的rpsL基因。结果以H37Rv标准株为对照,21株敏感株中,1株(4.76%) SSCP和RFLP分析存在rpsL基因异常;59株耐药株中,36株(61.02%)SSCP和RFLP分析存在rpsL基因异常。结论结核分枝杆菌对Sm耐药与rpsL基因突变有关,PCR-SSCP和PCR-RFLP技术可快速、准确地检测结核分枝杆菌对Sm的耐药性。     

应用基因阵列法快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的　研制一种新型的基因阵列 ,用于结核分枝杆菌耐利福平分离株rpoB基因突变的快速检测。方法　根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计寡核苷酸探针并制作基因阵列 ,用生物素标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断 ,与基因阵列杂交 ,同时以聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术及DNA测序法为对照。结果　 111株结核分枝杆菌临床分离株经PCR SSCP分析 ,4 1株RFP敏感株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同 ;70株耐RFP菌株中 ,6 3株(90 % )SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株不同 ,其余 7株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同。基因阵列检测结果 4 1株RFP敏感株杂交图谱与标准株完全相同 ,70株耐RFP临床分离株中 ,6 3株检测到rpoB基因突变 ,检出率为 90 % ;其中 37株 (5 3% ) 5 31位丝氨酸 (Ser)置换 ,15株 (2 1% ) 5 2 6位组氨酸(His)置换 ,11株 (16 % )其他位置的氨基酸置换。基因阵列检测结果与PCR SSCP及测序结果一致。结论　用基因阵列法可简便、快速、准确地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变。     

PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG的检测

目的探讨结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药的分子机制,建立快速检测结核分枝杆菌INH耐药性的方法。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测105株结核分枝杆菌临床分离株的katG基因,运用DNA测序和生物信息分析比对进行验证。结果以H37Rv标准株为对照,34株敏感株中5株(14.7%)存在KatG基因异常,105株耐药株中55株(52.4%)存在KatG基因异常。结论结核分枝杆菌对INH耐药与KatG基因突变有关,PCR-RFLP技术可快速、准确地检测结核分枝杆菌对INH的耐药性。     

结核分枝杆菌临床分离株耐药性与耐药基因突变关系的研究

目的分析临床分离结核分枝杆菌耐药性与耐药基因突变的关系。方法用绝对浓度法和基因测序技术检测临床分离的22株结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)、卡那霉素(KM)、氧氟沙星(OFLX)、对氨基水杨酸(PAS)耐药性和相应耐药基因kat G、rpo B、rpsl、rrs、gyr A、thy A的突变。结果 22株结核分枝杆菌中耐药菌株占45.5%。INH耐药率为18.2%,RFP耐药率为27.3%,SM耐药率9.1%,KM耐药率为18.2%,OFLX的耐药率为13.6%,PAS耐药率为4.5%。敏感菌株中均未检测到耐药基因突变。耐药菌株中除2株外均检测到相应耐药基因突变。结论结核分枝杆菌对抗结核药物耐药性与相关耐药基因突变密切相关。     

PCR－SSCP技术快速检测结核分枝杆菌 rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

用耐药基因检测方法指导老年肺结核病人治疗的临床研究

目的：了解老年肺结核病人的结核分支杆菌耐药情况，评价它们的临床应用价值。方法：采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）检测结核分支杆菌rpoB,katG,rpsL,pncA,embB基因突变和药物敏感试验（比例法），了解117例老年结核病人结核分枝杆菌耐药情况。探讨和比较2种耐药性检测方法的检测效果。结果：1／2上的肺结核病人至少耐2种抗结核药物，对RFP、INH、SM、PZA和EB总耐药率为82．1％、71．7％、63．2％、51．2％和35．0％，耐多药率为67．5％，rpoB,katG,rpsL,PpncA和embB基因突变率分别为72．8％、64．9％、59．8％、41．0％和30．7％，多基因突变株达76．0％，结核杆菌耐药基因突变与耐药水平联系密切，多数结核分支杆菌耐药基因突变易发生在高耐药区，也有少数基因突变发生在低耐药区。根据药敏试验和耐药基因检测，耐多药结核病人6个月治愈率分别达到54．8％和62．8％，治疗效果满意，两种方法没有显著性差异（P＞0．05）。结论：耐药基因检测指寻治疗是一种新探索，PCR－SSCP方法敏感，特异，可以快速检测结核菌rpoB,katG,rpsL,pncA和embB耐药基因突变，可能会成为临床指导用药的好方法。     

结核分枝杆菌耐喹诺酮临床分离株gyrA基因突变的研究

目的 了解结核分枝杆菌喹诺酮(quinolones)耐药株耐药基因突变情况，评价其应用价值。方法 通过16S rRNA聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析77株分枝杆菌临床分离株；通过PCR-SSCP和直接测序技术分析结核分枝杆菌的gyrA基因突变的情况。结果 75株为结核分枝杆菌复合群。30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱中，11株与H37Rv相同，19株与卡介苗相同；与卡介苗gyrA基因的SSCP图谱相同的敏感株95位密码子为ACC，与H37Rv该图谱相同的敏感株95位密码子为AGC。45株喹诺酮耐药株中，34株(75．6％)gvrA基因SSCP图谱泳动异常，对25株泳动异常、出现频率较高耐药株测序证实15株(44．1％)为94位密码子GAC→GGC突变；10株(29．4％)为90位密码子GCG→GTG的突变。结论 结核分枝杆菌耐喹诺酮与gyrA基因突变有关，PCR-SSCP可能成为测定结核分枝杆菌耐喹诺酮类药基因型的快速、简便的方法。     

结核分支村菌耐药分子机制及快速检测的研究

目的：研究结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药的分子机制，探索快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性的分子生物学方法。方法：应用聚合酶反应－单链构象多态性（PCR-SSCP）检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药株与katG基因、rpoB基因突变。结果：46株结核分支杆菌临床分离株均未发现katG基因序列的缺失，30株异烟肼耐药株中，17株检测到katG基因突变，耐药株中katG基因的突变率为57％；87株结核分支杆菌利福平耐药临床分离株的PCR－SSCP结果显示，所有39株利福平敏感菌无突变检出，48株利福平耐药菌中，36株高度利福平耐药菌和7株低度利福平耐药菌检测量到rpoB基因突变；利福平耐药株中rpoB基因的突变检出率为89．6％。结论：证实katG和rpoB基因突变分别是结核分支杆菌异烟肼和利福平耐的主要分子机制。应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）可快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性。     

结核分枝杆菌链霉素耐药临床分离株rpsL基因突变特征分析

目的了解我国结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）rpsL基因突变特征及其与链霉素耐药的相关性,并评价其应用价值。方法对302株结核分枝杆菌临床分离株的rpsL基因采用聚合酶链反应-直接测序（PCR-DS）进行检测。结果 59株对INH、RFP、SM、EMB和PAS全部敏感,rpsL基因没有突变,61株对SM敏感的耐药株有6株突变,SM敏感菌株突变率为5.00%（6/120）。182株SM耐药MTB,rpsL基因突变率为70.33%,其中43位密码子赖氨酸转变为精氨酸（Lys43Arg）突变率为52.20%;88位密码子有4种突变类型,突变率为17.58%;86位密码子精氨酸转变为谷氨酰胺（Arg86Gln）突变率为0.55%。SM耐药株的rpsL基因突变率明显高于SM敏感株的基因突变率,两者之间的差异有统计学意义,χ2=125.05,P〈0.05。结论 rpsL基因突变与结核分枝杆菌链霉素耐药高度相关,其中Lys43Arg突变是主要突变类型,PCR-DS检测rpsL基因突变可以用于临床结核菌链霉素耐药的快速检测。     

DNA序列分析与PCR-SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

目的　了解DNA序列分析与PCR-SSCP法分析利福平敏感性的价值。方法 应用DNA序列分析与PCR-SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株 25株、耐药株 41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。 结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变,41株耐利福平株中 38株发生突变,突变率为 92.7% (38/41);25株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR-SSCP带型与对照H₃₇R_v株相同,41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株,提示有突变存在。与DNA序列分析相比,PCR-SSCP检测准确率为 93.9% (62/66),敏感度为 92.1% (35/38);特异度是 96.4% (27/28)。结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值;PCR-SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选。     

结核分枝杆菌Km基因突变与耐卡那霉素药物的研究

目的分析结核分枝杆菌(T.M)耐卡那霉素(KM)和(Km)基因突变情况。方法通过传统梯度药敏试验和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析127株分枝杆菌临床分离株耐KM情况和Km基因的变化。结果药敏试验卡那霉素耐药率为35.4%(45/127),127株分枝杆菌临床分离株的16S rDNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同。45株耐卡那霉素分离株中,12株(26.6%)Km基因SSCP泳动异常。结论T.M对抗结核二线药物中的KM药物已出现耐药,其部分耐药原因可能是由于T.M耐KM药物的Km基因突变所致。     

应用基因芯片分析结核分枝杆菌常见耐药基因型的研究

目的应用基因芯片快速检测结核分枝杆菌耐药基因型,建立一种新的分子药敏试验方法。方法以传统药敏试验和PCR-直接测序方法为对照,应用基因芯片快速检测157株结核分枝杆菌临床分离株异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)耐药基因(katGr、poB、rp-sLr、rs和embB)的带荧光素标记的PCR产物。结果PCR-直接测序和基因芯片检测36株结核分枝杆菌药物敏感株的5种耐药基因均为野生型。121株结核分枝杆菌耐药分离株中,56株耐INH分离株,katG基因突变率为62.5%,其中katG缺失率为7.5%,315位密码子突变率为55.4%,279位密码子突变率为1.8%;104株耐RFP株,rpoB基因突变率为94.2%,最常见的突变位点为531位和526位密码子(突变率分别为60.6%、15.4%),双位点突变率为5.8%,还发现511、513、515、516、517、518和533位密码子突变;62株耐SM分离株,rpsL和rrs总突变率为88.7%(两者分别为82.3%、6.5%),rpsL突变位于43位和88位密码子(突变率分别为77.4%、4.8%),rrs突变位于513位和516位碱基(突变分别为4.8%、1.6%);57株为耐EMB株,embB基因突变率为61.4%,均为306位密码子突变,最常见的突变为ATG→GTG或ATA(突变率分别为35.1%、15.8%),还发现306位密码子ATG→ATC、ATT和CTG突变。通过基因芯片检出的突变与基因测序结果一致。结论应用基因芯片可分析大多数结核分枝杆菌耐药基因型,弥补传统药敏试验方法的不足,指导临床治疗。     

应用PCR-RFLP分析结核分枝杆菌rpsL基因突变

目的 了解结核分枝杆菌链霉素(SM)耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法?方法 通过PCR-RFLP分析62株结核分枝杆菌临床分离株的rpsL基因突变的部位和性质?结果 以H37RV标准株为对照,13株敏感株的rpsL基因有MboⅡ酶切位点;37株耐SM分离株中,31株(838%)无MboⅡ酶切位点;12株耐其它抗结核药物株中,也有2株无MboⅡ酶切位点?结论 大多数结核分枝杆菌SM耐药分离株的核糖体S12蛋白编码基因(rpsL)第43位密码子有点突变?PCR-RFLP可能成为快速检测结核分枝杆菌耐药突变株的一种新方法?