兔血管内皮细胞对角膜后弹力层代谢的影响

目的:检测移植后生长于角膜内皮面的自体血管内皮细胞对角膜后弹力层代谢的影响.方法:家兔26只随机分成3组:实验组10只,将培养的自体血管内皮细胞移植到无后弹力层的角膜内皮面;实验对照组10只,移植无角膜内皮层的自体植片;空白对照组6只,移植带角膜内皮细胞的自体植片,术后观察3组角膜植片的水肿变化.术后15d,取下各组角膜植片做病理切片HE染色观察各组植片的角膜后弹力层变化及其上的细胞分布情况.结果:实验组角膜植片的内皮面长满培养的自体血管内皮细胞.病理切片显示,生长的细胞呈单层分布,内皮面未见明显的后弹力膜样物质形成;实验对照组角膜植片高度增厚,内皮面无细胞生长和后弹力膜样物质形成;空白对照组角膜植片内皮面可见明显的后弹力层,其上可见单层细胞分布.结论:血管内皮细胞具有一定的角膜内皮细胞样功能,但不能产生角膜后弹力层样物质.     

BrdU示踪的恒河猴血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞的免疫组化染色观察

目的观察BrdU示踪标记的恒河猴血管内皮细胞移植替代同种异体角膜内皮细胞后角膜内表面免疫组化染色,探索血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞的可行性。方法体外培养恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞,培养增生至第2代后置于含BrdU(10μg·mL-1)的1640培养液中传代72h,通过离心沉淀法移植到撕除后弹力层的恒河猴角膜内表面,术后取角膜行HE染色及抗BrdU免疫组化染色,观察角膜后表面的细胞分布及有无后弹力膜样组织,并观察角膜后表面细胞能否被抗BrdU染色着染。结果 HE染色显示,实验组角膜内表面可见细胞层生长,细胞后方未见后弹力膜样物质,抗BrdU免疫组化染色阳性,示该细胞为培养的BrdU示踪的血管内皮细胞;对照组角膜组织HE染色显示,角膜内表面光滑,未见细胞样结构,BrdU染色呈阴性,未见棕黄色着色的细胞样组织。结论 BrdU可成功示踪标记体外培养的血管内皮细胞,恒河猴血管内皮细胞能够在撕除后弹力层的角膜内表面生长。     

利用离心沉淀法移植恒河猴血管内皮细胞替代角膜内皮的可行性分析

目的 分析利用离心沉淀法移植体外培养的恒河猴血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VEC)替代角膜内皮细胞(corneal endothelial cells,CEC)的可行性.方法 将恒河猴9只随机分为2组:实验组(6只)、对照组(3只).实验组:角膜环钻取下中央角膜组织,显微镜下撕除后弹力层,将角膜植片形成约45°倾斜、内表面向上方置于0.6 mL EP管中,再向管中加入配置好的密度为40×106L-1的恒河猴VEC悬液0.5 mL,管中形成棉球在下、角膜植片在中间、细胞悬液在上面的三明治结构,盖紧EP管,放置于离心机中,以400r·min-1、800 r· min-1、1200 r·min-1的转速各离心4 min后将植片原位缝回植床;对照组:将撕除后弹力层的术眼角膜植片原位缝回植床.术后1个月、2个月、3个月分别摘取术眼,行扫描电镜观察移植的VEC在角膜植片内表面的分布情况.结果 离心沉淀后倒置显微镜观察,可见移植的类圆形细胞均匀贴附于角膜植片内表面;术后1个月扫描电镜显示种植的VEC贴附于角膜内表面,细胞表面积较大,呈长梭形,细胞间连接不紧密,可见细胞间隙及少量裸露的胶原纤维区;随着时间推移,术后2个月时,可见植片内表面的VEC密度逐渐增大,细胞间出现紧密连接;术后3个月时,可见细胞密度进一步增大,大片状均匀贴附于角膜植片内表面,细胞呈不规则多边形,高倍镜下,细胞表面可见典型的长短不一微绒毛.对照组未见纤维裸露区,胶原前表面偶见白细胞及变形红细胞.结论 离心沉淀法可以将VEC成功移植于角膜内表面并均匀分布,移植后的VEC可异位生长并大量分裂增殖.     

血管内皮细胞替代角膜内皮细胞的可行性

目的:探讨培养的人脐静脉内皮细胞行猫眼角膜内皮细胞移植的可行性。方法:取第三代体外培养人脐静脉内皮细胞,种植在处理过的人羊膜上,待完全形成单层后用于细胞移植手术。正常健康家猫20只,分为A人脐静脉内皮细胞移植组:将载有完全融合的人脐静脉内皮细胞的羊膜移植到去除自体角膜内皮细胞及后弹力层的猫角膜上;B单纯羊膜移植对照组:将保存人羊膜移植到去除自体角膜内皮细胞及后弹力层的猫角膜上;C去除内皮细胞对照组:去除猫眼自体角膜内皮细胞及后弹力层后,既不移植羊膜,也不移植血管内皮细胞。术后1,2,4,8,12,24wk以裂隙灯观察角膜的透明度、眼前节炎症情况,同时行大体及裂隙灯照相。并以角膜厚度仪测量角膜厚度,A组在术后1,2,4,8wk各取1例植片制备光镜标本进行组织病理学检查。对照组均取术后2wk植片做光镜检查。结果:A组共11例植片术后3d水肿渐消退,植片渐透明,并在1wk内保持完全透明。4例在术后1～2wk因排斥反应而混浊,其中3例于混浊后4wk逐渐恢复透明,1例持续混浊。6例在术后12～24wk植片持续透明,光镜观察显示,移植的内皮细胞在前房内成连续单层排列。B组植片持续水肿混浊,但较C组轻,未见免疫排斥反应发生;2wk植片光镜观察羊膜与基质贴附较好无皱折。C植片持续高度水肿混浊,在长达24wk的观察中未发现恢复透明现象。2wk植片光镜观察完全没有后弹力层及内皮细胞层,基质高度水肿,结构疏松紊乱。结论:以人羊膜为载体移植的人脐静脉内皮细胞在前房环境内存活24wk,并可行使角膜内皮细胞的屏障及液泵功能。与角膜基质贴附紧密,不发生免疫排斥反应。     

自体血管内皮细胞移植替代角膜内皮层的实验研究

目的 探讨自体血管内皮细胞(VECs)移植替代角膜内皮层的可行性.方法 40只家兔随机分为4组.A组,家兔VECs培养移植于去后弹力层的白体角膜植片内表面;B组,角膜植片去后弹力层后移植回原植床;C组,角膜植片取下后移植回原植床;D组,家兔不做处理.术后观察VECs生长状况及角膜植片透明度,A型超声测其厚度.结果 A组角膜植片混浊,1周内最明显,后混浊减轻,2周可见前房.细胞生长良好,部分细胞形状不规则.B组角膜植片混浊且不改善.C、D两组角膜无混浊.结论 VECs可替代自体角膜内皮层的屏障功能,维持角膜的透明状态.     

恒河猴血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞后房水血管内皮生长因子水平的变化

目的探索恒河猴血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞后房水血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度的变化。方法实验组将体外培养增殖的恒河猴视网膜-脉络膜血管内皮细胞通过离心沉淀法移植到撕除后弹力层的恒河猴角膜内表面;对照组撕除角膜内皮层后,不做任何处理,直接原位缝合角膜植片。分别于术前及术后1周、2周、3周、4周、6周、8周、12周抽取房水,通过ELISA方法检测其中VEGF浓度,并进行统计分析。结果实验组和对照组术后1周时VEGF浓度差异无统计学意义(P>0.05),术后2周、3周、4周时实验组VEGF浓度分别为(374.74±3.30)ng·L-1、(419.06±1.39)ng·L-1、(481.83±3.36)ng·L-1,同时间点对照组分别为(271.11±1.12)ng·L-1、(345.18±3.27)ng·L-1、(380.33±5.03)ng·L-1,差异均具有统计学意义(均为P<0.05),相应时间点实验组显著高于对照组。实验组术后1周、2周、3周、4周VEGF浓度的差异均有统计学意义(均为P<0.05),各时间点与术前(128.75±3.83)ng·L-1差异均有统计学意义(均为P<0.05)。对照组术后各时间点VEGF浓度与术前差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论血管内皮细胞移植到角膜内表面后,房水VEGF浓度在术后4周内持续升高,之后稳定在一较高水平。     

改良揭膜消化法分离培养恒河猴角膜内皮细胞

目的　分析改良揭膜消化法分离培养恒河猴角膜内皮细胞的可行性。方法　揭取恒河猴角膜后弹力层和内皮层,反复剪碎,用１ｍｇ·ｍＬ－１胶原酶Ａ消化１５ｍｉｎ,离心后重悬接种。待原代细胞长满８０％ ～９０％时,以４０×１０６个·Ｌ－１的密度传代。观察记录原代及传代细胞生长情况、传代时间,进行细胞鉴定,并与组织贴壁法相比较。结果　改良揭膜消化法获取的原代细胞生长较慢,２１ｄ融合成单层铺路石样结构,无基质细胞污染;传代细胞生长较快,５～６ｄ可传一代;神经元特异烯醇化酶表达阳性。组织贴壁法分离组织２４ｈ后组织片体积变小,透亮度明显下降,疑似溶解,高倍镜下观察显示,后弹力层纤维排列紊乱,细胞观察不清;继续培养至第５天,细胞完全溶解,组织片碎裂,轮廓不清,未见角膜内皮细胞爬出。结论　改良揭膜消化法能简易高效地获得大量恒河猴角膜内皮细胞。     

超声乳化致恒河猴角膜内皮损伤动物模型的建立

目的 建立超声乳化致恒河猴角膜内皮损伤的动物模型.方法 健康成年恒河猴4只,右眼用于实验.术中超声头斜面向角膜内表面,负压150 mmHg(1 kPa=7.5 mm-Hg)、流量25 mL·min-1、能量80％、距离角膜内表面0.1 ～0.2 mm的条件下持续5 min,并不断摆动超声头破坏角膜内表面,位置为角膜中央直径7 ～9 mm处.用I/A吸出透明晶状体皮质.术后当时、1周、2周、3周、4周行术眼前段照相后分别摘除术眼角膜,行扫描电镜观察角膜内皮细胞形态.结果 超声乳化损伤角膜内皮细胞后,角膜透明度随时间延长逐渐下降,术后4周时出现明显角膜混浊水肿.扫描电镜下可见随着时间推移,受损角膜内皮细胞逐渐水肿,并从后弹力层脱落,术后4周时角膜内皮细胞已基本脱落,见裸露的后弹力层.结论 本实验通过超声乳化仪建立了恒河猴角膜内皮损伤的动物模型,并且本模型具有可重复性、对内皮以外组织损伤小及简单易行的特点.     

脱水保存角膜基质为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的探讨以脱水保存角膜基质/后弹力层为载体培养角膜内皮细胞,构建组织工程化角膜内皮细胞移植膜的可行性及其机理。设计实验性研究。研究对象体外培养的兔角膜内皮细胞和脱水保存角膜基质/后弹力层。方法兔角膜经中性蛋白酶37°C孵育5min,去除内皮细胞保留后弹力层和角膜基质,无水氯化钙脱水后低温保存,使用前磷酸盐缓冲液复水。纯化的角膜内皮细胞接种于基质载体的后弹力层上进行体外培养,直至生长融合为细胞单层,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。在不同时间点(1、2、4、6d)收集植片进行HE染色和电镜检测,分析组织结构的变化。主要指标角膜内皮细胞在脱水保存角膜基质/后弹力层载体上形成单层时间和生长特性,组织工程化角膜内皮细胞移植膜的三维结构和超微结构。结果角膜内皮细胞在载体上快速贴壁生长并增殖,体外培养6～7d即融合成单层,复合角膜内皮组织由基质/后弹力层和单层扁平内皮细胞组成,与生理状态下的角膜内皮组织相近。电镜下组织培养的兔角膜内皮细胞间连接紧密,细胞为多边形,胞核清晰,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论角膜内皮细胞能够在干燥脱水保存基质/后弹力层载体上良好生长,并形成形态结构与正常角膜内皮组织相似的细胞单层,为角膜内皮细胞移植提供了新的载体选择。(眼科,2006,15:164-168)     

恒河猴血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞后房水中离子浓度的变化

目的 探索恒河猴血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞后房水中Na+、K+、Ca2+、Mg2+、p3+、Cl-6种离子浓度的变化.方法 将体外培养增殖的恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞通过前房注射法移植到超声乳化破坏角膜内皮细胞的恒河猴角膜内表面,术前及术后定期抽取房水,通过全自动生化分析仪检测房水中Na+、K+、Ca2+、Mg2+、P3+、Cl-的浓度,并与移植前进行对比分析.结果 Na+:术后3个月时,实验组Na+浓度(164.15±0.49) mmol·L-1略低于空白对照组(167.05 ±0.49)mmol·L-1,差异有统计学意义(P＜0.05).其余组间及组内检验浓度差异均无统计学意义(均为P＞0.05).K+、Ca2+、Cl-:组间及组内检验后K+、Ca2+、Cl-浓度差异均无统计学意义(均为P ＞0.05).Mg2+和P3+:实验组中各观察时间点Mg2+、p3+浓度差异有统计学意义(P＜o.05),实验组、实验对照组、空白对照组两两相比不同组别、不同时间差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).结论 恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞移植到角膜内表面后,对房水中Na+、K+、Ca2+和Cl-离子含量无明显影响,细胞内环境基本稳定;对Mg2+浓度的影响较明显,提示着细胞生理状态的改变过程;对P3+离子浓度有一定影响,尚需进一步的研究和证实.     

人表皮生长因子对体外培养兔角膜内皮细胞影响的实验研究

目的：明确人表皮生长因子（ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ,ｈＥＧＦ）对角膜内皮细胞的影响。方法：采用体外培养的兔角膜内皮细胞,观察接种后不同时点ｈＥＧＦ对其生长状态的影响;兔角膜片内皮损伤模型,离体培养后行Ｈ－Ｅ染色和Ｈ＾３－ＴｄＲ掺入放射自显影,观察ｈＥＧＦ对其修复的影响。结果：兔角膜内皮细胞体外培养ｈＥＧＦ组细胞数高于对照组,并使细胞形态产生纺锤形改变;角膜内皮细胞     

恒河猴骨髓间充质干细胞角膜移植后的超微结构观察

背景寻求理想的种子细胞是解决角膜移植供体匮乏的研究热点。骨髓间充质干细胞（BMSCs）已被成功地在体内或体外诱导为角膜上皮细胞或视网膜神经节样细胞,但尚无诱导为角膜内皮细胞的报道。目的探讨BMSCs移植于角膜内皮表面后的存活和增生情况,进而为BMSCs体内诱导为角膜内皮细胞的研究奠定基础。方法健康成年恒河猴4只,分为实验组（3只）和对照组（1只）,均取右眼为实验眼。采用密度梯度离心联合贴壁法分离培养BMSCs,培养至第3代,通过流式细胞仪检测细胞表面分子、透射电子显微镜观察细胞超微结构以及对细胞进行脂肪细胞诱导等方法鉴定体外培养的BMSCs,同时用含0．01g／L 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）的完全培养基增生培养对细胞进行标记备用。实验组与对照组均用7mm环钻钻取恒河猴右眼角膜植片,撕除角膜内皮细胞层,实验组采用离心沉淀法将BrdU标记的BMSCs移植于角膜植片,而对照组未进行细胞移植,最后将角膜植片原位缝合回植床。分别于术后1、2、3个月摘取术眼角膜植片进行扫描电子显微镜检查,观察移植后细胞分布及连接情况,同时行BrdU免疫组织化学染色。结果密度梯度离心联合贴壁法可以获得较高纯度的BMSCs,体外培养12～16d细胞90％融合,细胞呈梭形,平行或漩涡状排列。培养细胞的CD29表达阳性率为94．26％,CD45表达阳性率为4．02％,CD34表达阳性率为7．51％。透射电子显微镜显示核质比增大,细胞质内可见丰富的线粒体、高尔基体及粗面内质网。培养的细胞通过脂肪细胞诱导液培养3周后,油红O染色细胞质被染为橘红色,细胞核染为蓝色。实验组术后1个月,右眼角膜植片内皮表面细胞呈短梭形,术后2个月呈梭形及多角形,术后3个月多数细胞呈多角形,细胞数量增多,细胞连接较前紧密,均为单细胞层;角膜植片内表面可见BrdU抗体染色阳性的细胞;对照组扫描电子显微镜检测角膜植片内皮表面无细胞生长,弹性纤维裸露,BrdU染色阴性。结论BMSCs通过离心沉淀法移植于角膜内表面可以存活并增生为单细胞层。     

小鼠胚胎干细胞条件培养基体外促进人角膜内皮细胞增殖的研究

目的　观察小鼠胚胎干细胞条件培养基（ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ,ＥＳＣ-ＣＭ）是否可以在体外促进人角膜内皮细胞（ｈｕｍａｎｃｏｒｎｅａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ,ＨＣＥＣｓ）的增殖。方法　利用角膜内皮后弹力层组织块方法进行原代培养Ｐ０ＨＣＥＣｓ。实验组使用含有２５％ＥＳＣ-ＣＭ的培养液进行培养,对照组使用普通角膜内皮细胞培养液（ｃｏｒｎｅａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍｍｅｄｉ-ｕｍ,ＣＥＭ）进行培养。倒置相差显微镜、反转录聚合酶链反应（ｒｅｖｅｒｓｅ-ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ,ＲＴ-ＰＣＲ）鉴定ＨＣＥＣｓ;倒置相差显微镜观察细胞的形态及萌出时间;ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ、免疫组织化学法观察ＨＣＥＣｓ的泵相关功能蛋白（ｚｏｎａｏｃｃｌｕ-ｄｅｎｓｐｒｏｔｅｉｎ-１,ＺＯ-１）及Ｎａ＋-Ｋ＋-ＡＴＰ酶的表达。Ｇｉｅｍｓａ染色细胞克隆实验、免疫组织化学及流式细胞学检测Ｋｉ６７阳性率的方法比较ＨＣＥＣｓ的增殖能力;流式细胞学方法检查细胞周期及细胞凋亡情况。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和免疫组织化学方法检测细胞周期负性调节蛋白Ｐ２１的水平,初步探讨其可能的作用机制。结果　原代培养时,２５％ＥＳＣ-ＣＭ组培养的ＨＣＥＣｓＰ２细胞爬出,细胞形态呈典型多角形结构。ＣＥＭ在Ｐ２时细胞形态变大,失去了多角形结构。２５％ＥＳＣ-ＣＭ 组和ＣＥＭ组均表达ＺＯ-１、Ｎａ＋-Ｋ＋-ＡＴＰ酶。２５％ＥＳＣ-ＣＭ组的Ｋｉ６７阳性率、克隆形成数量、进入到细胞周期Ｓ期和Ｇ２期的比例均高于ＣＥＭ组（均为Ｐ＜０．０５）。２５％ＥＳＣ-ＣＭ组的细胞凋亡数量和Ｐ２１阳性率均低于ＣＥＭ组（均为Ｐ＜０．０５）。结论　２５％ＥＳＣ-ＣＭ组可显著促进ＨＣＥＣｓ增殖;其作用可能是通过抑制Ｐ２１蛋白的表达和抑制细胞凋亡实现的,为ＨＣＥＣｓ体外大量扩增提供了一种新方法。     

体外培养角膜内皮细胞移植的实验研究

目的　探讨体外培养角膜内皮细胞移植的手术方法及移植后在活体的生理功能。方法　植片 :以直径 7 5mm、厚 10 0 μm、冷冻脱水保存的猪角膜后弹力膜 (Descemet′smembrane ,DM ) /基质为载体 ,原代接种兔角膜内皮细胞 ,体外培养 7～ 10d ,用于移植。受眼 :新西兰兔 3 0只 ( 3 0眼 ) ,实验组 2 0眼 ,对照组 10眼 ,全角膜范围去除术眼内皮细胞 ,5周后施行手术 ;做直径 9mm、3 / 4角膜厚的带蒂前层角膜瓣并掀置一侧 ,再用直径 7 2 5mm的环钻钻去中央后层角膜 ,形成植床 ;将植片置于植床 ,8-0可吸收线间断缝合 ,10 -0尼龙线间断缝合前层角膜瓣 ,术后观察 1～ 12个月。结果　术后角膜持续透明 6个月 14眼 ( 14 / 18、 77% ) ,12个月 8眼 ( 8/ 14、 5 7% ) ;术后 6个月内皮细胞密度 ( 193 4± 3 0 7)个 /mm2 ,角膜厚度平均为 ( 3 92± 3 9) μm。 结论　以异种DM /基质为载体培养的兔角膜内皮细胞 ,行同种异体移植后 ,能够在活体上成活 ,并具有正常内皮细胞的生物学功能 ,维持角膜透明 ,深板层角膜内皮移植术是体外培养内皮细胞移植的一种有效术式。     

不同粘弹性物质对人工晶体植入术后角膜内皮细胞的形态影响

本研究使用角膜内皮分析系统，对使用空气泡、Ｈｅａｌｏｎ和２％荧光羟丙基甲基纠维素进行人工晶体植入术的病例进行角膜内皮细胞的形态学分析。术后短期内皮细胞丢失率，空气泡组显著高于后二组，而细胞面积变异系数（ＣＶ）和六边形细胞百分数（Ｈ％）在三红中都有相似的表现，即ＣＶ值在术后一周增加，但术后一月有恢复术前水平的趋势；Ｈ％值在术后一周降低，但术后一月回升到接近术前的水平。Ｈｅａｌｏｎ组和甲基纤维素组相比，细胞丢失率无显著差异。     

不同粘弹性物质对人工晶体植入术后角膜内皮细胞的形态影响

本研究使用角膜内皮分析系统，对使用空气泡，Ｈｅａｌｏｎ和２％荧光羟丙基甲基纤维素进行人工晶体植入术的病例进行角膜内皮细胞的形态学分析，术后短期内皮细胞丢失率，空气泡组显著高于后二组，而细胞面积变异系数和六边形细胞百分数（Ｈ％）在三组中者有相似的表现，即ＣＶ值在术后一周增加，但术后一月有恢复前水平的趋势；Ｈ％值在术后一周降低，但术后一月回升到接近术前的水平，Ｈｅａｌｏｎ组和甲基纤维组相比，细胞丢失率     

无活性内皮细胞的保存角膜治疗角膜穿孔的临床应用

目的观察将无活性内皮细胞的保存角膜用于穿透性移植对角膜穿孔的治疗效果，方法-20度保存无活性内皮细胞的全层角膜做为穿透性移植供体角膜，在受体做特殊的深层桥状植床，尽量多的保存自体后弹力层和内皮，常规间断或连续缝合，观察植片存活状况、视力、排斥反应和并发症等情况。结果5例患者早期植片均透明、视力不同程度提高，2例患者晚期发生轻微排斥反应，经局部使用免疫抑制剂控制。结论在利用新的深层桥式穿透性移植手术最大限度保存自体角膜内皮的前提下，无活性内皮细胞保存角膜可望用于常规角膜穿孔治疗。     

角膜内皮细胞改良培养技术的初步探讨

目的 评价角膜后弹力层撕除联合酶消化法分离角膜内皮细胞的效率,分析细胞体外生长的生物学特性.方法 将兔角膜带有内皮细胞的后弹力层完整撕下,用胰蛋白酶-EDTA联合酶消化,纯化的角膜内皮细胞进行体外培养.观察细胞形态,用神经元烯醇化酶抗体进行细胞表型鉴定.苏木精-伊红染色以及茜素红-台盼蓝联合染色分析细胞活性,流式细胞仪检测细胞体外生长过程中Anne xiv-PE的表达情况,透射电镜和扫描电镜进行细胞超微结构形态的观察.结果 带角膜内皮细胞的后弹力层撕除联合酶消化法可快速获得大量纯化的角膜内皮细胞,快速贴壁生长并增生,体外培养3～4d即融合成单层细胞,且表达神经元烯醇化酶抗体阳性,苏木精-伊红染色及活性染色提示细胞功能良好,Annexiv-PE抗体表达水平微弱.结论 角膜后弹力层撕除联合酶消化法可提高角膜内皮细胞的获取和培养效率,为工程化角膜内皮移植膜的构建提供稳定的种子细胞来源.     

小切口下角膜后弹力层剥除联合深板层内皮移植术的实验研究

目的 探讨小切口下角膜后弹力层剥除联合深板层内皮移植术(DSEK)的手术方法、疗效、并发症、内皮细胞的评价及组织学检查.方法 为实验研究.将24只新西兰大白兔随机分为3组,每组8只兔(8只眼),供体为新西兰大白兔16只眼.A组于角膜缘处行5 mm长隧道切口,剥去角膜中央直径10 mm的后弹力层,将等大的带有少量基质的后弹力层内皮细胞膜片植入受体眼;B组行单纯角膜后弹力层环形撕除术;C组在角膜后弹力层剥除后行去内皮细胞的带少许角膜基质和后弹力层膜片植入.术后观察1个月,比较3组兔角膜的透明性、植片贴附情况、角膜内皮细胞密度及并发症情况.结果 A组8只眼术前角膜内皮细胞密度平均值为(2728±108)个/mm2,术后角膜均恢复透明,内皮细胞密度平均为(2195±77)个/mm2,差异有统计学意义(t=12.455,P＜0.001);组织切片证实角膜内皮细胞植片与受体植床愈合良好,层间无瘢痕形成.B组8只眼术后均有严重的角膜水肿,持续1个月未恢复,组织学检查术后28 d时仅在后弹力层剥除的交界处有极少数的内皮细胞长入.C组8只眼术后1周内角膜植片均水肿,5只眼植片脱位;术后至观察1个月,角膜中央水肿仍较明显,伴有角膜新生血管长入,组织学检查植片部位未见内皮细胞长入.结论 角膜后弹力层剥除联合深板层内皮移植术具有安全、损伤小、术后恢复快及无层间瘢痕的优点,是治疗大泡性角膜疾病的优选术式.     

供体角膜离体和保存时间与植片内皮细胞密度的关系

用角膜内皮显著镜摄像对３１眼部分穿透性角膜移植术后６个月的植片内皮细胞密度进行了计数观察，以探讨供体角膜离体和保存时间与植片内皮细胞密度的关系。结果表明，离体１５－１８小时的供体角膜，术后植片内皮细胞密度与≤１２小时者无显著性差异。供体角膜平均保存５９－７１小时与保存≤４８小时者，术后植片内皮细胞密度无显著性差异。说明除夏日暴晒之外，供体角膜在人体死亡后１８小时内离体和角膜湿房保存时间不超过７１小