内源性大麻素对体外培养的牛眼小梁细胞PGE2表达及细胞骨架的影响

目的:研究内源性大麻素N-花生四氢酸氨基乙醇(anan-damide,AEA)对体外培养的牛眼小梁细胞细胞骨架及PGE2表达的影响。方法:对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养,并行鉴定。对传3代的牛眼小梁细胞分别施加AEA浓度分别为0,0.1,1.0,10μmol/L的无血清培养液,作用24h后提取细胞上清液,并将细胞置于倒置显微镜下摄像,计算机图像分析系统计算细胞面积。用ELISA法检测PGE2浓度的变化。结果:AEA可以产生明显的细胞舒张效应,呈浓度依赖性。而且在一定范围内可以成剂量依赖性的促进PGE2的表达。与对照组均有显著性差异(P<0.05)。结论:AEA可引起小梁细胞的舒张和促进PGE2的释放。     

内源性大麻素AEA对体外培养的牛眼小梁细胞形态和细胞骨架的影响

目的:研究内源性大麻素(AEA)对体外培养牛眼小梁细胞形态和细胞骨架的影响,探讨大麻素在原发性开角性青光眼(POAG)中的降眼压的机制,为大麻素的眼部用药提供帮助。方法:原代培养的牛眼小梁细胞,经不同质量浓度的AEA作用后,于光学显微镜下观察小梁细胞形态的改变,免疫荧光染色后在荧光显微镜下观察肌动蛋白微丝束的形态改变。免疫组化(SABC法)对a-tubulin(微管蛋白)染色,结果以计算机图像分析系统分析,并统计学检验。结果:经AEA作用后的牛眼小梁细胞,细胞间隙扩大,细胞变圆,细胞立体感增强;肌动蛋白微丝纤维变稀疏,断裂,排列紊乱。各浓度组与对照组比较,微管蛋白的含量减少,其下调呈浓度依赖性。结论:大麻素可改变体外培养的小梁细胞的形态和细胞骨架,引起细胞内的微管蛋白含量的减少,有利于降低小梁网房水引流阻力。     

茶碱对培养的牛眼小梁细胞骨架及细胞间黏附的影响

目的 观察茶碱对培养的牛眼小梁细胞的增殖、细胞骨架、细胞间黏附的影响，探讨其降眼压机制。方法 组织块法培养牛眼小梁细胞。不同浓度的茶碱(1、10、50mmol／L)分别作用4h、8h，免疫细胞化学法观察小梁细胞微丝及微管的改变，MTT法观察小梁细胞的增殖。ELISA法检测不同浓度的茶碱作用4h后连接素(β-catenin)的相对表达量。结果 茶碱作用8h抑制细胞增殖。茶碱明显改变细胞形态、微管及微丝染色浓集，变化程度与药物浓度及作用时间有关。茶碱降低连接素的表达量。结论 茶碱抑制小梁细胞增殖，改变细胞骨架，降低细胞间黏附，提示茶碱可能通过影响细胞骨架及细胞间黏附减少房水流出阻力从而降低眼压。     

细胞因子对体外牛眼小梁细胞生成SPARC的调节

目的:了解房水中细胞因子对体外培养牛眼小梁细胞合成富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secretedprotein,acidicandrichincysteine,SPARC)的影响。方法:体外培养牛眼小梁细胞并传3代,应用免疫组化染色法验证SPARC存在于小梁细胞内,并将传3代的小梁细胞无血清培养24h后分别加入房水中的细胞因子bFGF,TGF-β,EGF及IGF-1,72h后提取细胞上清液,并用酶联免疫吸附法(ELISA)测定SPARC的浓度。结果:细胞因子bFGF,TGF-β不影响小梁细胞对SPARC的合成,EGF和IGF-1分别减少和增加小梁细胞对SPARC的合成。结论:细胞因子可通过影响SPARC的生成而调节眼内压。     

血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛眼小梁细胞^3H胸腺核苷酸掺入率及胶原合成的影响

目的观测血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)对体外培养的牛眼小梁细胞(bovine trabecularmeshwork cells,TM cell)3H胸腺核苷酸(3H-thymidine,3H-TdR)掺入率及胶原合成的影响,探讨原发性青光眼的发病机制.方法(1)牛眼小梁细胞的体外培养应用免疫组化方法(neuronal specific enolas,NSE,Ⅷ因子相关抗原染色)、细胞鉴定、光学及电子透射显微镜对细胞进行形态学及生长特性的观察;(2)AngⅡ(1×10-7mol@L-1及1×10-8mol@L-1)以及其Ⅰ型受体(angiotensin receptor type I,AT1)拮抗剂孵育TM细胞,采用检测3H-TdR掺入率的方法了解细胞增殖状态,并用化学方法检测培养液中羟脯氨酸含量,间接推导胶原含量.结果牛眼小梁细胞培养成功,以上皮型为主.AngⅡ明显地增加了牛眼小梁细胞的3H-TdR摄入率,同时培养液中的羟脯氨酸含量亦相应增高.结论体外培养牛眼小梁细胞技术是研究小梁细胞特性的重要实验技术.AngⅡ可以诱导体外培养的牛眼小梁细胞的细胞增殖率升高,同时促使胶原合成增强.AT1受体拮抗剂可以部分阻断此促增殖效应.眼科学报2001;17209-212.     

地塞米松对小梁细胞粘附及吞噬功能的影响

目的：探讨地塞米松对小梁细胞的粘附及吞噬功能的影响。方法：不同浓度地塞米松(10^-7M，10^-6M，10^-5M)处理体外培养的牛眼小梁细胞3d，消化、漂洗后加入用不同的细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)包被的培养板中，37℃孵育90min后．采用甲基噻唑基四唑(Methyl thiazolyl tetrazolium，MW)法测定各组吸光度值反应粘附细胞的量；另外，以乳胶微球为标记，观察不同浓度的地塞米松对小梁细胞吞噬功能的影响。结果：与对照组比较，三种浓度的地塞米松均对小梁细胞与ECM粘附有抑制作用．且呈浓度依赖性；对小梁细胞的吞噬功能亦呈现浓度依赖性抑制作用。结论：地塞米松对小梁细胞的粘附及吞噬功能有抑制作用，抑制小梁细胞的粘附及吞噬功能可能是皮质类固醇性青光眼的发病原因之一。     

肿瘤坏死因子-α对体外培养的牛眼小梁细胞MMP3,MMP9和TIMP-2表达的影响

目的:观察肿瘤坏死因子-α对体外培养的牛眼小梁细胞MMP3,MMP9和TIMP-2表达的影响,探讨原发性开角型青光眼的发病机制。方法:对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养,应用免疫组化方法(NSE,Ⅷ因子相关抗原染色)鉴定细胞,化学及电子透射电镜对细胞进行形态学及生长特性的观察;对传3代的小梁细胞分别施加含TNF-α终浓度为0,12.5,25,50μg/L的培养液,48h后行MMP3和MMP9免疫组化SP染色,结果进行计算机图像分析并进行统计学检验。分组提取细胞培养液用ELASA检测TIMP-2量的变化。结果:体外培养的牛眼小梁细胞表达MMP3及MMP9,TNF-α可增加MMP3及MMP9的表达,并且抑制TIMP-2的表达。结论:TNF-α在一定范围内可以增加MMP3及MMP9的表达(P<0.05),并抑制TIMP-2的表达(P<0.01),故TNF-α可以减少小梁细胞细胞外基质的堆积,使房水引流通畅,对激光小梁成形术的手术原理有一定的说明意义。     

血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛眼小梁细胞微管及微丝动力学影响的研究

目的 研究血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ)对体外培养的牛眼小梁细胞骨架的动力学影响,探讨AngⅡ对房水的调节作用及在青光眼发病机制中的意义。方法 （1）牛眼小梁细胞的体外培养,应用免疫组化方法（NSE,Ⅷ因子相关抗原染色）细胞鉴定,光学及电子透射显微镜对细胞进行形态学及生长特性的观察;（2）以含不同浓度AngⅡ-的培养液孵育小梁细胞12-24h,（终浓度分别是10^-5、10^-6、10^-7mol.L^-1)。免疫组化法（SABC）对α-smooth-actin、tubulin-α染色,结果以计算机图像分析系统分析,并统计学检验。结果 牛眼小梁细胞培养成功,成活率80%——100%,上皮型为主,AngⅡ产生明显的细胞收缩效应,actin是收缩的主要效应器。结论 体外培养牛眼小梁细胞技术是研究小梁细胞特性的重要实验技术,AngⅡ可以引起小梁细胞的浓度依赖性的收缩,提示Ang可能是房水排出途径的调节姻子之一,对眼压及青光眼的发生发展有一定的影响。     

转化生长因子β1对体外培养的牛眼小梁细胞MMP3和MMP9表达的影响

目的 探讨转化生长因子β1（TGF-β1）对培养的牛眼小梁细胞基质金属蛋白酶（MMPs)的影响。房水引流阻力在原发性开角型青光眼（POAG）发病机制中的作用。方法 对牛眼小梁细胞进行体外原代及传代培养，对传三代小梁细胞分别施加含TGF-β1终浓度为0、0.5,1,5ng/ml的培养液，48h后行MMP3及MM农艺师免疫组人SP法染色。结果进行计算机图像分析并行统计学检验。结果 体外培养的牛眼小梁细胞表达MMP3及MMP9，TGF-β1可抑制小梁细胞MMP3及MMP9表达。结论 TGF-β1在一定范围内抑制小梁细胞MMP3及MMP9表达，造成小梁网ECM的异常堆积，导致房水引流阻力增高。     

牛眼小梁网细胞体外培养及吞噬功能的研究

目的研究小梁细胞吞噬功能异常在青光眼发病中的作用。方法利用牛眼分离小梁网组织，进行小梁细胞体外培养；应用乳胶微球为标记物，定性及定量观察体外培养的牛小梁细胞吞噬功能及其影响因素。结果免疫组织化学染色证实牛小梁细胞能分泌纤维连接蛋白和层连蛋白。在体外，牛小梁细胞对乳胶微球有较强的吞噬能力。细胞吞噬乳胶微球的数目随培养时间的延长而增多，培养至２４小时，平均每个细胞含４０．５±６．７个微球，细胞在吞噬过程中出现明显的形态学改变，同时也伴有自身损伤，甚至死亡。肾上腺素及可的松抑制小梁细胞的吞噬功能（Ｐ＜０．０５），ＥＧＦ对细胞吞噬作用无影响。结论小梁细胞的吞噬功能对保持房水流出道通畅起重要作用，小梁细胞的吞噬功能异常可能参与原发性开角型青光眼的发病过程。     

过氧化氢对人晶状体上皮细胞增生及VEGF表达的影响

目的:研究不同浓度的过氧化氢(H2O2)对体外培养的人晶状体上皮细胞增生及VEGF表达的影响。方法:体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04,在培养液中分别加入浓度为1,10,100nmol/L;1,10,100μmol/L和1mmol/L的过氧化氢处理40min,对照组无过氧化氢,随后在正常培养液中继续培养,在0,6,12和24h用MTT方法检测晶状体上皮细胞的增生活力;在24h用ELISA方法检测培养液上清中血管内皮生长因子(VEGF)的含量。结果:在培养液中加入1nmol/L~10μmol/L浓度的H2O2处理组,晶状体上皮细胞增生率(A值)随浓度较对照组明显增加,其中以10nmol/L最为明显;而100μmol/L,1mmol/L处理组,晶状体上皮细胞出现生长抑制。ELISA检测结果显示,1nmol/L~10μmol/L的过氧化氢刺激后,VEGF水平均高于对照组,且呈浓度依赖性,峰值出现在10nmol/L和10μmol/LH2O2处理组。结论:低浓度(1nmol/L~10μmol/L)的H2O2可以促进晶状体上皮细胞增殖,并使VEGF分泌增加;提示VEGF可能作为一种氧化应激产物,对晶状体上皮细胞起到保护、免受损伤的作用。     

bFGF诱导人晶状体上皮细胞增殖过程中细胞外信号调节激酶的作用

目的:检测细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导的人晶状体上皮细胞增殖过程中的表达与活化;检测ERK1/2特异性阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞增殖的影响。方法:人晶状体上皮细胞系SRA01/04体外培养,采用MTT比色法和[3H]-TdR掺入法检测ERK阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞活力和DNA合成的影响;Westernblot法测定bFGF对培养的人晶状体上皮细胞ERK,c-Jun氨基末端激酶(JNK),P38蛋白表达及PD98059对环氧合酶-2(COX-2)表达的影响。结果:10μg/LbFGF能显著刺激人晶状体上皮细胞增生,1μmol/LPD98059即能显著抑制bFGF启动的HLEC增殖,其效应呈浓度依赖性(P<0.01)。10μg/LbFGF可激活ERK信号通路,诱导COX-2蛋白表达,其效应在30min内达到高峰,6h后逐渐减弱,此作用可被10μmol/LPD98059阻断;10μg/LbFGF对非磷酸化ERK,磷酸化和非磷酸化JNK及P38表达无明显影响。结论:有丝分裂原活性蛋白激酶信号传导通路中ERK磷酸化对bFGF启动的人晶状体上皮细胞增殖具有重要的调节作用。     

两种选择性环氧化酶-2抑制剂对翼状胬肉成纤维细胞生长影响的对比研究

目的:观察两种选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)增殖和凋亡的影响,并比较两者作用强弱,寻找辅助治疗和预防翼状胬肉复发的新途径。方法:用0～200μmol/L尼美舒利(nimesulide)和美洛昔康(meloxicam)作用体外培养的HPF,24～96h后观察不同浓度的两种药物对HPF的影响。MTT法及免疫组织化学染色增生细胞核抗原(PCNA)检测细胞生长活性,流式细胞仪测定细胞周期时相变化。结果:在尼美舒利50μmol/L作用24h后,美洛昔康100μmol/L作用24h后均能显著抑制HPF的增殖(P<0.05),呈剂量和时间依赖性。100μmol/L尼美舒利和美洛昔康分别作用48h后,流式细胞仪检测结果发现,药物作用组均出现典型的亚二倍体凋亡峰,G0/G1期细胞百分比上升(P<0.05),S期细胞百分比下降(P<0.05),说明细胞阻滞于G0/G1期。当尼美舒利的浓度在25～200μmol/L,美洛昔康在50～200μmol/L范围内能浓度依赖性地抑制细胞表达PCNA(P<0.05)。结论:两种选择性COX-2抑制剂均能抑制HPF的生长,并诱导其调亡,对COX-2的选择性越高,对HPF的抑制作用越强,尼美舒利的作用强于美洛昔康。     

全反式视黄酸对体外培养人巩膜成纤维细胞的抑制作用

目的:观察全反式视黄酸(all-trans retinoicacid,RA)对体外培养的人巩膜成纤维细胞(human scleral fibroblasts,HSF)的形态、增殖能力和自我更新能力以及细胞周期的影响,探讨RA对巩膜成纤维细胞的作用。方法:原代培养HSF,波形蛋白和角蛋白对细胞进行鉴定。用不同浓度RA培养HSF,相差显微镜下动态观察其形态和数量变化;MTT法检测HSF在不同浓度RA培养后的细胞增殖和自我更新能力;FCM方法检测不同浓度RA对HSF细胞周期的影响。结果:MTT法显示RA对HSF有明显的抑制作用,该效应呈剂量依赖性反应。RA培养后HSF细胞数目减少,细胞收缩,突起减少,部分裂解,胞浆内有空泡和颗粒形成,细胞之间的间隙增宽,细胞变得细长,呈束状或不规则排列。FCM结果显示和对照组比较,随着RA浓度和时间的增加,G0/G1期细胞的比例逐渐上升,而S期和G2期细胞比例相应下降,细胞被阻滞在G0/G1期。结论:RA可抑制体外培养HSF的增殖和DNA合成。     

过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中20S蛋白酶体表达的上调作用

目的:探讨过氧化氢诱导的氧化应激对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中20S蛋白酶体表达的影响。方法:分别选择0,100,300μmol/L过氧化氢作用ARPE-19细胞4h后收集样本,Western blot方法检测细胞中20S蛋白酶体表达水平,细胞免疫荧光方法检测20S蛋白酶体在细胞中的分布。结果:100和300μmol/L过氧化氢溶液处理的细胞中20S蛋白酶体的表达和对照组相比明显增加(100μmol/L过氧化氢处理组vs0和300μmol/L过氧化氢处理组,P<0.05),并呈现剂量依赖性。正常培养情况下,细胞内20S蛋白酶体在核周微量表达,100和300μmol/L过氧化氢溶液处理的细胞内20S蛋白酶体和对照组相比明显增加,其分布集中在核内及核膜周围。结论:过氧化氢对ARPE-19的20S蛋白酶体表达有上调作用。     

橙皮苷对人翼状胬肉成纤维细胞增生的抑制作用

目的　评价橙皮苷对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞（human pterygium fibroblasts,HPF）增生的抑制作用,对照观察丝裂霉素C（mitomycin C,MMC）对HPF的影响,寻找治疗及预防翼状胬肉复发的中医中药方法。方法　将人翼状胬肉新鲜组织剪碎后进行体外贴壁细胞常规培养及传代,并采用波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学染色及DAPI染色对HPF进行鉴定。用24 μmol·L^-1、48 μmol·L^-1、64 μmol·L^-1、72 μmol·L^-1、96 μmol·L^-1、120 μmol·L^-1橙皮苷及1.5 μmol·L^-1、7.5 μmol·L^-1、30.0 μmol·L^-1 MMC作用于第3代HPF,24 h、48 h、72 h后采用MTT法检测细胞的增生抑制率,并筛选合适的浓度梯度及时间进行细胞凋亡检测,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果　根据MTT法检测细胞增生抑制率的结果,选用72 μmol·L^-1及48 μmol·L^-1 的橙皮苷作为实验组,将7.5 μmol·L^-1 MMC作为MMC标准对照组,无处理细胞作为空白对照组,培养48 h后流式细胞仪检测HPF的凋亡率。结果显示,72 μmol·L^-1橙皮苷组、48 μmol·L^-1橙皮苷组、7.5 μmol·L^-1 MMC标准对照组及空白对照组的细胞凋亡率分别为（41.10±1.04）%、（24.97±3.70）%、（48.60±6.94）%及（9.20±4.67）%,各组间HPF凋亡率整体存在差异（F=43.581,P<0.001）,两两比较结果显示,除72 μmol·L^-1橙皮苷组与MMC标准对照组间差异无统计学意义（P>0.05）外,其余组间两两相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　72 μmol·L^-1橙皮苷在抑制HPF生长方面有着与MMC等同的效果,主要是通过促进HPF凋亡进而抑制HPF的增生。     

灯盏花素通过调节Bcl-2和Bax表达拮抗高糖诱导的RPE细胞损伤

目的:探讨灯盏花素对高糖环境下人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激的影响。方法:常规培养RPE细胞,分为对照组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为30mmol/L)、灯盏花素低浓度组(30mmol/L葡萄糖+1μmol/L灯盏花素)和灯盏花素高浓度组(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L灯盏花素)。细胞划痕实验观察RPE细胞的迁移性,CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平变化,Hoechst染色法观察凋亡细胞比例,Western blot分析各组Bcl-2和Bax的变化。结果:细胞划痕实验结果显示,灯盏花素低浓度组和灯盏花素高浓度组RPE细胞形态较高糖组改善,细胞迁移性较高糖组增加;CCK-8结果显示,用1、10μmol/L浓度的灯盏花素处理后,RPE细胞存活率分别提高到61.06%±5.59%和79.81%±7.04%,与高糖组(40.63%±4.72%)比较有差异(P<0.05);2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)荧光探针染色结果显示,灯盏花素抑制了RPE细胞内ROS水平;Hoechst染色法显示,1、10μmol/L灯盏花素处理后发生凋亡的RPE细胞数量逐渐减少;Western blot结果显示,灯盏花素增强了Bcl-2蛋白的表达,降低了Bax蛋白的表达。结论:灯盏花素可以抑制高糖诱导的RPE细胞氧化损伤和凋亡的发生,为糖尿病视网膜病变的治疗靶点研究提供了理论支持。